上海宏基因組分析方法

① 宏基因組的介紹

宏基因組 ( Metagenome)（也稱微生物環境基因組 Microbial Environmental Genome, 或元基因組） 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名詞， 其定義為「the genomes of the total microbiota found in nature」 , 即生境中全部微小生物遺傳物質的總和。它包含了可培養的和未可培養的微生物的基因， 目前主要指環境樣品中的細菌和真菌的基因組總和。而所謂宏基因組學 (或元基因組學， metagenomics) 就是一種以環境樣品中的微生物群體基因組為研究對象， 以功能基因篩選和/或測序分析為研究手段， 以微生物多樣性、 種群結構、 進化關系、 功能活性、 相互協作關系及與環境之間的關系為研究目的的新的微生物研究方法。一般包括從環境樣品中提取基因組 DNA, 進行高通量測序分析，或克隆DNA到合適的載體，導入宿主菌體，篩選目的轉化子等工作。

② 如何採用宏基因組進行水產動物腸道微生物的研究

1，宏基因組提取；提取的樣品DNA必須可以代表特定環境中微生物的種類，除需嚴格遵循取樣規則外，取樣中應盡量避免對樣本的干擾，縮短保存和運輸的時間，使樣品盡可能代表自然狀態下的微生物原貌，獲得高質量環境樣品中的總DNA是宏基因組文庫構建的關鍵之一。要採用合適的方法，既要盡可能地完全抽提出環境樣品中的DNA，又要保持較大的片段以獲得完整的目的基因或基因簇。所以總的提取總是在最大提取量和最小剪切力之間折中。應嚴格操作，謹防污染，並且保持DNA 片段的完整和純度。為了更好地反映環境中的微生物種群並且提高陽性克隆的佔有率，需要在克隆之前通過不同的方法對感興趣的目的基因或基因組進行富集，常用的富集方法有穩定同位素探針、抑制性消減雜交、差異顯示、噬菌體展示、 親和捕獲及DNA微陣列等技術。
2，測序分析：
採用Solexa進行宏基因組 DNA測序，首先對特定環境微生物種群全基因組DNA進行提取。在提取微生物種群的DNA後制備DNA文庫，具體步驟如下：

（1）將DNA隨機打斷成200-500bp的片段；

（2）對DNA末端進行修復；

（3）將「A」鹼基加入到DNA片段的3』末端；

（4）在DNA片段的末端加上接頭；

（5）純化連接產物；

（6）PCR擴增連上接頭的DNA片段；

（7）檢測測序文庫。