甲基化研究方法

㈠ 有沒有特異的DNA甲基化方法

1. DNA甲基化（DNA methylation）是最早發現的修飾途徑之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達。

2. 在甲基轉移酶的催化下，DNA的CG兩個核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，這常見於基因的5'-CG-3'序列。大多數脊椎動物基因組DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5'端的非編碼區，並成簇存在。甲基化位點可隨DNA的復制而遺傳，因為DNA復制後，甲基化酶可將新合成的未甲基化的位點進行甲基化。DNA的甲基化可引起基因的失活，DNA甲基化導致某些區域DNA構象變化，從而影響了蛋白質與DNA的相互作用，甲基化達到一定程度時會發生從常規的B-DNA向Z-DNA的過渡，由於Z-DNA結構收縮，螺旋加深，使許多蛋白質因子賴以結合的原件縮入大溝而不利於轉錄的起始，導致基因失活。另外，序列特異性甲基化結合蛋白（MBD/MeCP）可與啟動子區的甲基化CpG島結合，阻止轉錄因子與啟動子作用，從而阻抑基因轉錄過程。

3. DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7－甲基鳥嘌呤（7-mG）

㈡ 有哪些RNA甲基化測序的技術呢

有，二代測序，可以找一家專業檢測甲基化的技術服務公司咨詢一下，，不過為什麼一定要用測序檢測甲基化呢？除了測序，目前有很多檢測甲基化的方法，如MSP、BSP、MSAP、晶元法、HRM、MassARRAY等，應該依據自己的實驗樣本和實驗目的選擇適合的檢測方法。

甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉移到其他化合物的過程。可形成各種甲基化合物，或是對某些蛋白質或核酸等進行化學修飾形成甲基化產物。在生物系統內，甲基化是經酶催化的，這種甲基化涉及重金屬修飾、基因表達的調控、蛋白質功能的調節以及核糖核酸(RNA)加工。

㈢ 基因甲基化檢測、甲基化PCR 的原理是什麼

一種全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技術

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學性修飾鹼基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位點，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區域，在哺乳動物中mC約佔C總量的2－7％。一般說來，DNA的甲基化會抑制基因的表達。DNA的甲基化對維持染色體的結構、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發生發展都起重要的作用。

CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區段，CpG保持或高於正常概率，這些區段被稱作CpG島。CpG島主要位於基因的啟動子和第一外顯子區域，約有60％以上基因的啟動子含有CpG島。 CpG甲基化的研究在腫瘤的研究中有著非常主要的地位。通過基因啟動子區及附近區域CpG島胞嘧啶的甲基化可以在轉錄水平調節基因的表達，從而引起相應基因沉默，去甲基化又可恢復其表達。DNA甲基化在生理情況下就參與了控制基因的時空表達，在腫瘤發生時，腫瘤細胞全基因組低甲基化是一個重要特徵。腫瘤細胞基因組甲基化的程度與正常細胞相比僅為20-60% , 同時伴有局部區域基因的高甲基化,包括腫瘤抑制基因、抑制腫瘤轉移和浸潤的基因、細胞周期調節基因、DNA修復基因、血管形成抑制基因等。但是目前研究手段的局限，限制了DNA甲基化的廣泛研究。

近年來，研究者不斷探索定性及定量檢測單個或多個甲基化位點的方法，但由於甲基化多態性區域存在的密度很高，所以對於延伸反應其引物的位置很難設計。Pyrosequencing技術作為一種新的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。

從原理上來看，Pyrosequencing是一種通過合成方法進行序列分析的方法，它通過核苷酸和模板結合後釋放的焦磷酸引發酶級聯反應，促使熒光素發光並進行檢測。這項技術曾經被用作單核苷酸多態性（SNP）的基因型和單倍型的檢測，以及細菌和病毒的鑒定和分型研究。這項技術的一個主要特點是在Pyrogarm™軟體上顯示的峰值高度來自於序列分析的原始數據，通過峰值的高度可以精確的檢測混合DNA模板中等位基因的頻率。

目前甲基化研究方面，很多甲基化定量分析的報道採用亞硫酸氫鹽處理甲基化樣本，並用混合的PCR產物
作為校正。其主要原理是：亞硫酸氫鹽可以將沒有甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而在適當的實驗條件下甲基化的胞嘧啶保持不變。因而，用它處理樣本後，再進行PCR擴增，甲基化的位點可以被當作一個C/T的SNP來處理，它的基因頻率為0－100％。在此，我們給大家介紹一個研究人員使用Pyrosequencing技術分析並精確定量DNA甲基化水平的例子。

研究者在一個Pyrosequencing反應中同時檢測了6個甲基化位點。這種方法同樣可以用於石蠟包埋的組織，並且具有較高的重復性和精確性。實驗選擇谷胱甘肽-S-轉移酶π（GSTP1）轉錄啟動位點的CpG島進行檢測。這些位點在正常前列腺組織中是非甲基化的，而在腫瘤樣本中高甲基化。通過PCR擴增一個包含17個甲基化多態位點140bp的片段，並用4個測序引物研究其中15個位點（Table 1）。使用在線的SNP測序引物設計軟體（Pyrosequencing AB）設計測序引物，其中一些甲基化多態性位點用最可能的鹼基所代替，以減少計算的數量。再通過人工檢測測序引物可能存在的錯配。此外，同時在PSQ 96MA DNA分析儀上運行空白對照，扣除由測序引物、生物素標記的引物或是模板引起的背景。

PCR引物設計完全與模板相匹配，不覆蓋任何甲基化多態性區域。使用10ng亞硫酸氫鹽轉化的DNA樣本或是10 fmol純化的PCR產物，10 pmol 正向（5』-GTGATTTAGTATTGG-3』）和反向（5』-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3』）引物擴增GSTP1轉錄啟動位點的基因片段，擴增片段長度為144bp。反應體系為60 mM Tris-SO4, pH 8.9, 18 mM (NH4)2SO4, 1 mM MgSO4, 200 μM dNTPs，以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶，終體積為50μL。PCR循環設置：首先在95℃下變性4分鍾，然後在95℃ 30S，50℃ 45S以及72℃ 20S條件下重復50個循環，最後一步延伸步驟在72℃下4分鍾，中止反應。PCR反應在Eppendorf的Mastercycler 96

哺乳動物基因組中，DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化. DNA甲基化是一種基因外修飾，不改變DNA的一級結構; 他在細胞正常發育、基因表達模式以及基因組穩定性中起著至關重要的作用. 全基因組低甲基化，維持甲基化模式酶的調節失控和正常非甲基化CpG島的高甲基化是人類腫瘤中普遍存在的現象. DNA高甲基化是導致抑癌基因失活的又一個機制.

㈣ DNA甲基化的最主流研究方法是什麼

甲基化特異性PCR（MSP），或甲基化組測序。適用對象不一樣，前者針對特定基因的甲基化水平，後者針對全基因。

㈤ 如何分析promoter的甲基化

如何分析promoter的甲基化
DNA甲基化是最早發現的修飾途徑之一，真核生物中甲基化僅發生於胞嘧啶，即在DNA甲基化轉移酶（DNMTs）的作用下的CpG二核苷酸5』端的胞嘧啶轉變為5』-甲基胞嘧啶。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達。DNA甲基化通常抑制基因表達，去甲基化則誘導了基因重新活化和表達。這種DNA修飾方式在不改變基因序列的前提下實現對基因表達的調控。脊椎動物DNA甲基化狀態與生長發育調控及生理狀態密切相關，比如在腫瘤發生時，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG島中的CpG則程高度的甲基化狀態，導致抑癌基因表達的下降。
原核生物中甲基化多發生在CCA/TGG和GATC序列；真核生物中DNA甲基化一般發生在CpG位點上；哺乳動物DNA甲基化只發生在CpG島的胞嘧啶，植物甲基化發生在CpG和CpNpG。甲基化會使胞嘧啶轉為5-甲基胞嘧啶，CpG位點在基因組是不常見的，主要密集於接近基因啟動子的位置，統稱為CpG島。CpG位點的甲基化可以對基因表現有重要的影響。
哺乳動物中，CpG序列在基因組中出現的頻率僅有1%，遠低於的其它雙核苷酸序列。但在基因組的某些區域中CpG序列密度很高，可以達均值的5倍以上即所謂的CpG島。通常，CpG島大約含有500多個鹼基，位於基因的啟動子區或第一個外顯子區。 在哺乳動物基因組中約有4萬個CpG島，而且只有CpG島的胞嘧啶能夠被甲基化。

㈥ 簡化甲基化測序和甲基化測序的區別

普通的測序不能找到甲基化位點。
這里有幾種常用的找甲基化位點的測序方法：
第一種是重亞硫酸鹽測序。重亞硫酸鹽使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴增(引物設計時盡量避免有CpG，以免受甲基化因素的影響)所需片段，則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶。最後，對PCR產物進行測序，並且與未經處理的序列比較，判斷是否CpG位點發生甲基化。此方法一種可靠性及精確度很高的方法，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態。在尋找有意義的關鍵性CpG位點上，有其他方法無法比擬的優點。測序法以CpG島兩側不含CpG點的一段序列為引物配對區，所以能夠同時擴增出甲基化和非甲基化靶序列。它的不足是耗費時間和耗資過多，至少要測序10個以上的克隆才能獲得可靠數據，需要大量的克隆及質粒提取測序，過程較為繁瑣、昂貴。
第二種甲基化DNA免疫共沉澱MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）測序，是基於抗體富集原理進行測序的全基因組甲基化檢測技術，採用甲基化DNA免疫共沉澱技術，通過5'-甲基胞嘧啶抗體特異性富集基因組上發生甲基化的DNA片段，然後通過高通量測序可以在全基因組水平上進行高精度的CpG密集的高甲基化區域研究。MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）測序是基於抗體富集原理進行測序的全基因組甲基化檢測技術，採用甲基化DNA免疫共沉澱技術，通過5'-甲基胞嘧啶抗體特異性富集基因組上發生甲基化的DNA片段，然後通過高通量測序可以在全基因組水平上進行高精度的CpG密集的高甲基化區域研究。
第三種是三代測序技術，採用pacbio測序儀的SMRT技術，採用的是對DNA聚合酶的工作狀態進行實時監測的方法。DNA聚合酶催化熒游標記的核苷酸摻入到互補的核酸鏈中。核苷酸的摻入被檢測成熒光脈沖，依據其顏色鑒定出核苷酸。當聚合酶切斷連接在核苷酸末端的熒光基團時，脈沖終止。熒光脈沖的到達時間和持續時間產生了關於聚合酶動力學的信息，從而允許直接檢測DNA模板鏈中的修飾核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶。

㈦ DNA甲基化的內容、功能、檢測及其研究方法

DNA甲基化（DNA methylation）
DNA甲基化是最早發現的修飾途徑之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達。
在甲基轉移酶的催化下，DNA的CG兩個核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，這常見於基因的5'-CG-3'序列。大多數脊椎動物基因組DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5』端的非編碼區，並成簇存在。甲基化位點可隨DNA的復制而遺傳，因為DNA復制後，甲基化酶可將新合成的未甲基化的位點進行甲基化。DNA的甲基化可引起基因的失活。
DNA甲基化主要形成5－甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7－甲基鳥嘌呤（7-mG）
結構基因含有很多CpG 結構, 2CpG 和2GPC 中兩個胞嘧啶的5 位碳原子通常被甲基化, 且兩個甲基集團在DNA 雙鏈大溝中呈特定三維結構。基因組中60%～ 90% 的CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地組成CpG 島, 位於結構基因啟動子的核心序列和轉錄起始點。有實驗證明超甲基化阻遏轉錄的進行。DNA 甲基化可引起基因組中相應區域染色質結構變化, 使DNA 失去核酶ö限制性內切酶的切割位點, 以及DNA 酶的敏感位點, 使染色質高度螺旋化, 凝縮成團, 失去轉錄活性。5 位C 甲基化的胞嘧啶脫氨基生成胸腺嘧啶, 由此可能導致基因置換突變, 發生鹼基錯配: T2G, 如果在細胞分裂過程中不被糾正,就會誘發遺傳病或癌症, 而且, 生物體甲基化的方式是穩定的, 可遺傳的。
DNA 甲基轉移酶有兩種: 1) DNM T1, 持續性DNA 甲基轉移酶—— 作用於僅有一條鏈甲基化的DNA 雙鏈, 使其完全甲基化, 可參與DNA 復制雙鏈中的新合成鏈的甲基化,DNM T1 可能直接與HDAC (組蛋白去乙醯基轉移酶) 聯合作用阻斷轉錄; 2)DNM T3a、DNM T3b從頭甲基轉移酶, 它們可甲基化CpG, 使其半甲基化, 繼而全甲基化。從頭甲基轉移酶可能參與細胞生長分化調控, 其中DNM T3b在腫瘤基因甲基化中起重要作用。
DNA 去甲基化有兩種方式: 1) 被動途徑: 由於核因子N F 粘附甲基化的DNA , 使粘附點附近的DNA不能被完全甲基化, 從而阻斷DNM T1 的作用; 2) 主動途徑: 是由去甲基酶的作用, 將甲基集團移去的過程。在DNA 甲基化阻遏基因表達的過程中, 甲基化CpG 粘附蛋白起著重要作用。雖然甲基化DNA 可直接作用於甲基化敏感轉錄因子E2F、CREB、A P2、CM ycöM yn、N F2KB、Cmyb、Ets, 使它們失去結合DNA 的功能從而阻斷轉錄, 但是, 甲基化CpG 粘附分子可作用於甲基化非敏感轉錄因子(SP1、CTF、YY1) , 使它們失活, 從而阻斷轉錄。人們已發現5 種帶有恆定的甲基化DNA 結合域(MBD ) 的甲基化CpG 粘附蛋白。其中M ECP2、MBD1、
MBD2、MBD3 參與甲基化有關的轉錄阻遏;MBD1 有糖基轉移酶活性, 可將T 從錯配鹼基對TöG 中移去,MBD4 基因的突變還與線粒體不穩定的腫瘤發生有關。在MBD2 缺陷的小鼠細胞中, 不含M ECP1 復合物, 不能有效阻止甲基化基因的表達。這表明甲基化CpG 粘附蛋白在DNA 甲基化方式的選擇, 以及DNA 甲基化與組蛋白去乙醯化、染色質重組相互聯系中的有重要作用。

㈧ SNP與甲基化結合的研究是怎麼做的

甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉移到其他化合物的過程。可形成各種甲基化合物，或是對某些蛋白質或核酸等進行化學修飾形成甲基化產物。在生物系統內，甲基化是經酶催化的，這種甲基化涉及重金屬修飾、基因表達的調控、蛋白質功能的調節以及核糖核酸(RNA)加工

㈨ 誰知道測DNA甲基化的方法

http://www.ebiotrade.com/emgzf/genenews200404/gene5.htm您自己看吧！好多圖片粘貼不過來，還不如你自己看。

一種全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技術

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學性修飾鹼基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位點，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區域，在哺乳動物中mC約佔C總量的2－7％。一般說來，DNA的甲基化會抑制基因的表達。DNA的甲基化對維持染色體的結構、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發生發展都起重要的作用。

CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區段，CpG保持或高於正常概率，這些區段被稱作CpG島。CpG島主要位於基因的啟動子和第一外顯子區域，約有60％以上基因的啟動子含有CpG島。 CpG甲基化的研究在腫瘤的研究中有著非常主要的地位。通過基因啟動子區及附近區域CpG島胞嘧啶的甲基化可以在轉錄水平調節基因的表達，從而引起相應基因沉默，去甲基化又可恢復其表達。DNA甲基化在生理情況下就參與了控制基因的時空表達，在腫瘤發生時，腫瘤細胞全基因組低甲基化是一個重要特徵。腫瘤細胞基因組甲基化的程度與正常細胞相比僅為20-60% , 同時伴有局部區域基因的高甲基化,包括腫瘤抑制基因、抑制腫瘤轉移和浸潤的基因、細胞周期調節基因、DNA修復基因、血管形成抑制基因等。但是目前研究手段的局限，限制了DNA甲基化的廣泛研究。

近年來，研究者不斷探索定性及定量檢測單個或多個甲基化位點的方法，但由於甲基化多態性區域存在的密度很高，所以對於延伸反應其引物的位置很難設計。Pyrosequencing技術作為一種新的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。

從原理上來看，Pyrosequencing是一種通過合成方法進行序列分析的方法，它通過核苷酸和模板結合後釋放的焦磷酸引發酶級聯反應，促使熒光素發光並進行檢測。這項技術曾經被用作單核苷酸多態性（SNP）的基因型和單倍型的檢測，以及細菌和病毒的鑒定和分型研究。這項技術的一個主要特點是在Pyrogarm™軟體上顯示的峰值高度來自於序列分析的原始數據，通過峰值的高度可以精確的檢測混合DNA模板中等位基因的頻率。

目前甲基化研究方面，很多甲基化定量分析的報道採用亞硫酸氫鹽處理甲基化樣本，並用混合的PCR產物
作為校正。其主要原理是：亞硫酸氫鹽可以將沒有甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而在適當的實驗條件下甲基化的胞嘧啶保持不變。因而，用它處理樣本後，再進行PCR擴增，甲基化的位點可以被當作一個C/T的SNP來處理，它的基因頻率為0－100％。在此，我們給大家介紹一個研究人員使用Pyrosequencing技術分析並精確定量DNA甲基化水平的例子。

研究者在一個Pyrosequencing反應中同時檢測了6個甲基化位點。這種方法同樣可以用於石蠟包埋的組織，並且具有較高的重復性和精確性。實驗選擇谷胱甘肽-S-轉移酶π（GSTP1）轉錄啟動位點的CpG島進行檢測。這些位點在正常前列腺組織中是非甲基化的，而在腫瘤樣本中高甲基化。通過PCR擴增一個包含17個甲基化多態位點140bp的片段，並用4個測序引物研究其中15個位點（Table 1）。使用在線的SNP測序引物設計軟體（Pyrosequencing AB）設計測序引物，其中一些甲基化多態性位點用最可能的鹼基所代替，以減少計算的數量。再通過人工檢測測序引物可能存在的錯配。此外，同時在PSQ 96MA DNA分析儀上運行空白對照，扣除由測序引物、生物素標記的引物或是模板引起的背景。

PCR引物設計完全與模板相匹配，不覆蓋任何甲基化多態性區域。使用10ng亞硫酸氫鹽轉化的DNA樣本或是10 fmol純化的PCR產物，10 pmol 正向（5』-GTGATTTAGTATTGG-3』）和反向（5』-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3』）引物擴增GSTP1轉錄啟動位點的基因片段，擴增片段長度為144bp。反應體系為60 mM Tris-SO4, pH 8.9, 18 mM (NH4)2SO4, 1 mM MgSO4, 200 μM dNTPs，以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶，終體積為50μL。PCR循環設置：首先在95℃下變性4分鍾，然後在95℃ 30S，50℃ 45S以及72℃ 20S條件下重復50個循環，最後一步延伸步驟在72℃下4分鍾，中止反應。PCR反應在Eppendorf的Mastercycler 96

哺乳動物基因組中，DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化. DNA甲基化是一種基因外修飾，不改變DNA的一級結構; 他在細胞正常發育、基因表達模式以及基因組穩定性中起著至關重要的作用. 全基因組低甲基化，維持甲基化模式酶的調節失控和正常非甲基化CpG島的高甲基化是人類腫瘤中普遍存在的現象. DNA高甲基化是導致抑癌基因失活的又一個機制.
http://www.wjgnet.com/1009-3079/abstract_cn.asp?f=1420&v=11

㈩ 有研究甲基化的嗎有什麼套路么 謝謝啦~~~

DNA甲基化嗎？
重亞硫酸鹽測序是最常用的
細胞中可用抗-5-甲基胞嘧啶單抗做免疫細胞化學觀察