熒光免疫分析儀保養方法

㈠ 免疫熒光的方法有什麼注意環節

• 1、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。

• 2、組織切片固定：切好片風干後立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當保存。

• 3、血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般10-30min。

• 4、一抗孵育條件：在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37℃1-2h，而4℃過宿和從冰箱拿出後37℃復溫45min。具體條件還要摸索。

• 5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或37℃立即觀察，若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然後去摸索一抗濃度和孵育時間。最後，熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能後有大量的游離熒光素殘留，需要注意配製時小包裝和並進行適當的離心。

• 6、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復染。

• 7、封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然後一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。

• 8、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育後的清洗均為5次*5min。注意：單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。PBS的pH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議pH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱鹼性條件（pH7-8）有利於免疫復合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫復合物的形成，而高離子強度則有利於分解）

• 9、拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1~2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3~5min後，熒光也明顯減弱或褪色；激發光長時間的照射，會發生熒光的衰減和淬滅現象；所以最多不得超過2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅後欲再啟用時，須待燈光充分冷卻後才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟15-30分鍾後；標本染色後立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩壓器，否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。

㈡ 熒光分析儀保養及使用

熒光光譜法具有靈敏度高、選擇性強、用樣量少、方法簡便、工作曲線線形范圍寬等優點，可以廣泛應用於生命科學、醫學、葯學和葯理學、有機和無機化學等領域。

熒光分光光度計的發展經歷了手控式熒光分光光度計，自動記錄式熒光分光光度計，計算機控制式熒光分光光度計。

光分光光度計三個階段;熒光分光光度計還可分為單光束式熒光分光光度計和雙光束式熒光分光光度計兩大系列。其他的還有低溫激光Sh p ol』skill熒光分光光度計，配有壽命和相分辯測定的熒光分光光度計等

熒光分光光度計操作步驟

1.開機：接通電源，打開主機開關，點燃（打開）光源後，根據說明書要求啟動計算機。

2.檢測前准備：參照儀器說明書，在20天內至少進行一次激發校準和發射校準，檢測前儀器應預熱。

3.工作條件的選擇：環境溫度應在20℃±5℃;相對濕度不大於70%;電源穩定，無磁場、電場干擾。根據樣品的特性及熒光強度，選擇合適的儀器工作條件（如狹縫、PM增益、響應時間等）。

（1）熒光激發光譜測定

設置儀器參數，掃描發射波長，找到maxλem，以此為發射波長，記錄發射強度作為激發波長的函數，便得到激發光譜。

（2）熒光發射光譜測定

設置儀器參數，掃描激發波長，找到maxλex，以此為激發波長，記錄發射強度與發射波長間的函數關系，便得到熒光發射光譜。

（3）差譜測定

設置儀器參數，選擇合適的工作方式，測定背景溶液的發射光譜並儲存起來，在一定的工作方式下，掃描樣品溶液的發射波長，得到當時的光度值和儲存的背景值之間的差示值，即差譜。

（4）峰面積積分

選擇適當的工作方式，對樣品溶液進行積分操作，即得到峰面積積分。

（5）熒光強度

選擇合適的測量參數，設置λex、λem，採用定點讀數或掃描方式，即可測得所選波長處的熒光強度。

（6）定量測定

配製一系列已知濃度的標准溶液，在一定的測定條件下，設置λex、λem，按照由稀至濃的次序，測定標准溶液的熒光強度，繪制熒光強度—濃度的工作曲線，不改變儀器參數測定未知溶液的熒光強度，由工作曲線即可求出未知溶液的濃度。

㈢ 液相色譜儀是如何進行保養和維護的

轉載：《分析測試網路網》
液相色譜儀的維護與保養

液相色譜儀的維護與保養

液相色譜儀是屬於易學難用的儀器，特別講究「正確使用」和經驗。

液相工作者接觸最多的是流動相，也就是流動相，是造成液相色譜各種問題的最主要源頭。

液相色譜儀最常見的故障一是堵，二是漏。下面就這兩點分別展開討論。(註：流動相以甲醇為例，色譜柱以C18為例)

「堵」的表現現象就是柱壓異常升高，直接原因就是流路不暢。堵塞的主要位置就是在色譜柱的前端，最主要原因就是流動相里有雜質，雜質的主要來源就是細菌。

「堵」的原因之一：配製流動相時細菌污染。

首先我們要認識到，一般的國產甲醇其實不需要額外過濾處理，直接使用沒有問題。即使是有些固態微粒雜質，也能在液相流路系統最前端的過濾頭上排除，真正容易引起問題的，是水中的細菌。

新制備的純水在室內放置幾天就會長菌，而這些細菌雖然肉眼不可見，卻足以堵塞柱填料顆粒的空隙，造成柱子很快報廢。這就是在配製流動相時造成的細菌污染的原因，解決它的方法很簡單，就是確保水的可靠性。這里有兩種方式推薦：

(1)最理想的方式當然是購買實驗室專用純水機，既方便又可靠，質量也放心。唯一的缺點就是價格不菲。

(2) 成箱購買市售品牌純凈水，如500ml 一支的怡寶或娃哈哈，這些水的質量足以應付液相色譜的要求。先隨機抽取一支做一下細菌平板實驗，待菌落數合格方可使用。這樣每次只要單獨開一支即可，也很方便。每次成本2 元左右。

這里特別指出一個細節：在絕大多數書本上，凡談到配製流動相都會談到最後有一個過濾的步驟。但是從我們長期使用的實際效果來說，只要能保證水的質量，這一步完全可以也應當去除。原因有以下三點：

(1)流動相過濾在理論上有好處，但是實際操作時由於不可能做到專瓶專用，反而容易造成的交叉污染，對於配比復雜的流動相影響更大。

(2)流動相過濾在經濟成本上不劃算。買一套過濾裝置要6000多元，且過濾器公認是比較容易損壞的設備。最主要是過濾片的成本太高，一片就要幾十元。按一般液相柱的正常使用壽命計算，過濾片的成本會遠遠高於色譜柱的成本。

(3)流動相過濾對於工作效率成本不劃算。使用溶劑過濾器有一個預清洗、裝備、使用、用後清洗，晾乾的過程，至少也有一個小時的時間。這個成本也不能忽視。

(4)在實際工作未發現流動相不過濾會對柱壽命有任何影響。我們起碼有6 年時間沒有做過流動相過濾的工作，但是和國內同行相比較，在同等使用強度下我們的柱壽命是比較長的。

「堵」的原因之二：使用流動相時的細菌污染。

指的是：流動相剛開始沒有長菌，在使用時卻產生了細菌污染。這主要是在使用多元液相色譜儀時的一種不良使用習慣造成的。

舉最簡單的例子：50%的甲醇水流動相，有兩種使用方式。一種方式是在上機前就配好混合在一起，另一種方式是在流路A放純甲醇，流路B放純水。

從單純實驗效果來說，後一種有明顯的優點：首先是簡單，不需要實驗者另個計算配比混合，其次就是比例准確，能得到保留時間重復性極好的實驗效果。

但是，它有一個致命的缺陷，就是純水在流動相瓶中幾天時間就會長細菌(很多情況下不僅僅用純水作流動相，而是用緩沖鹽溶液，本身就是優質肥料，細菌長得更迅速)，一旦有細菌柱子就壞得很快。所以這種方式要求操作人員每次實驗都要用新制備的純水，更要求在每次實驗後把水相換掉，換成甲醇沖洗干凈，這一點在實際工作中很多人意識不強，就是意識到了但多次使用中總有一兩次會遺漏，但是往往這一兩次就足以產生致命的影響。因為液相色譜柱的堵塞是不可逆的。

所以，寧可犧牲小小的保留時間的重復性，也不要用純水溶液作為流動相的一組。從實際實驗效果來說，我建議用10%的甲醇水代替純水溶液(以前我做過不同比例甲醇水的細菌總數實驗，在5%就基本可以抑菌，在10%及以上就可以完全殺菌了)，這樣可以有效排除長細菌的隱患，既可作流動相，也可沖柱。就算是在配製流動相時會計算得麻煩一些，但是一次麻煩，終身受益。

"堵」的原因之三：不適當操作。

常見問題的有以下幾種：

(1)在更換零件時選擇的型號有誤，介面不是很匹配，在擰緊的時候產生變形而使得管路堵塞。

(2)樣品處理液凈化得不幹凈，長期會在六通閥和柱之間形成阻塞不暢。

(3)在使用手動六通閥時，有些人可能由於手勁小的原因，轉動的不到位，於是造成流路形成了死堵，壓力快速升高超過警戒值。

(4)在使用金屬管路作出廢液管時，應當注意最好廢液瓶中先放一些水，並把廢液管的出口端放在液面下。如果位於在液相上且實驗使用較高濃度的緩沖鹽溶液，在停機時可能在出口端結晶成塊並造成堵塞。這種情況不常見，但卻的確發生過。

「堵」的原因講了不少，現介紹查堵的方法。

在發生「堵」的現象後，就需要找出原因，主要是什麼位置發生了「堵」。注意，絕大多數情況下，整個系統只會有一個地方發生堵塞。

查堵的方法是從尾向前逆向分段拆開，仔細觀察壓力數值，如果某一個部件(柱子除外)裝上和拆下時的壓力差別很大，可發展變化判斷。至於柱的堵塞，可以通過換同樣規格的柱的壓力是否一致來判斷。

下面再談一下「漏」的問題。「漏」則分兩種：漏液和漏氣。

一. 漏液

液相色譜儀從流動相瓶到廢液瓶之間的流路是一個全封閉體系，內部壓力很高，但外部卻能保證一滴不漏。如果某個部件發生了漏液，那就是故障所在。

漏液的原因分兩種：

(1) 接觸硬體不當。

在更換零件如流路管或換柱時，換的接頭介面不匹配，造成漏液。要注意不同公司的柱子接頭很多是不同的，甚至同一家公司在不同時期生產的液相柱接頭也有很大區別。當然選用PEEK接頭是一個較好的解決方法，不僅通用性好，而且靠手擰就能保證不漏液。

即使是介面本身是匹配的，但是如果操作不當也會漏液，一種不當就是力度把握不好，擰得太緊或太松;另一種不當就是致命的錯誤：滑絲，這是往往是動手能力不太強，螺絲釘很少擰的工作者犯的錯誤，滑絲的後果不僅是漏液那麼簡單，常造成重要部件的報廢。解決這個問題只能靠惡補基本功來實驗，那就是擰螺絲。

(2) 使用儀器不當

如果是輸送泵漏液，最常見的原因就是在活塞位置緩沖鹽析出造成。

析出的原因有兩個，一是使用緩沖鹽溶液時突然加入了純甲醇而析出，這種錯誤很容易避免，這是盡量不要用純的甲醇和純水。只要互相有10%的比例就不會出現這個問題。另一原因是在用緩沖鹽溶液(不論甲醇含量有多少)作流動相時，實驗結束後沒有換甲醇水沖洗，使得微滲的流動相乾燥形成晶體造成。

不過，輸送泵漏液並不是非得馬上修不可，沖洗干凈並在以後的使用中多加小心一般都可以正常使用。

檢測器漏液是個很麻煩的事，一般都是吸收池的問題，更換的費用相當高。但是並不是說一定要馬上更換，還可以從實際實驗效果看能否湊合使用。

二. 漏氣

漏液是從內部向外漏，而漏氣則是外部的氣體進入液相色譜儀的流路內部形成了氣泡。下面按流路的方向逐個部件分析產生氣泡的原因和相應解決方法。

(1) 過濾頭

抽液時，在流路管中有不規則但持續的小氣泡產生，這時考慮的是流動相有沒有脫氣(需要特別提醒即使是有了真空脫氣機也是要先超聲脫氣的，起碼可以減少脫氣機的工作壓力並提高工作效率)，如果已經脫了氣，則要注意過濾頭的污染也會造成這種現象。處理方法比較簡單，擰下過濾頭在稀硝酸中浸泡，超聲半小時，洗凈後裝回去即可。

(2) 透明流路管

指的是在過濾頭和輸送泵之間的那一段管路。這一個部分往往不是有點氣泡，而經常是整個管中全是空氣而操作人員卻渾然不知，以致輸送泵工作了半天才發現流動相瓶里的液體一點也沒少。這也是我們常說的液相色譜儀至少一周要開機一次的原因(我們做液相一定要有「微滲」的概念)。如果長時間不用，這一段管路的液體會徹底幹掉，而充滿空氣的管路和充滿液體的管路不仔細看是分辨不出的。

這種情況對於輸送泵很危險，因為泵從設計來說是輸送液體而不是氣體，內部的液體對於活塞來說起到了機油的作用，如果活塞桿上還殘存了一些緩沖鹽，則極易拉傷，造成不可逆轉的影響。

對於這種情況，要突出「預防為主」如：，液相色譜使用人員要相對固定和穩定，工作中合理搭配資源，每台機一周擊至少作一次實驗，如長期不用起碼每周要沖流動相2 小時。養成良好的工作習慣很重要。

如果不慎出現了這種問題怎麼辦?我的建議是用外力使管路中充滿液體。具體如下：

1、 找到流路管進入輸送泵的接頭。

2、 擰下來。

3、 用一干凈的洗耳球的尖端對准管路的平整切口。

4、 吸液體，看液面從流動相瓶里上升，至離洗耳球5 厘米左右時停止該動作。

5、快速把接頭擰回輸送泵上(這個過程可能會有少許流動相外泄，這是正常現象)。

6、 開機，打開排液閥門，啟動輸送泵。

7、等排液管中流出的溶液沒有氣泡時，再關閉排液閥，儀器正常工作。

(3) 輸送泵和柱子

這些部分進了氣泡一般不怕，沖掉就行。

(4) 檢測器

應該說，整個流路中只要有一個氣泡都會在檢測器上得到強烈的信號反映，檢測器內部的氣泡一般都能被沖走，但也有很難沖掉的殘留氣泡的情況。

如果檢測器里有殘留氣泡，會有特徵明顯的表現形式，就是在走基線時會時不時間隔出現直上直下信號很大的信號峰。這時先看普通流量能否沖走，如果沖不走，那唯一的辦法就是拆柱，把檢測器直接連到輸送泵的出口，加大幾倍流量沖洗，則肯定能沖走氣泡。

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㈣ 熒光免疫分析儀用來做什麼的

是一種用於測量含量很低的生物活性化合物的儀器。

㈤ 熒光分析儀的操作規程

為了防止氣瓶內的雜質進入分析儀, 建議在瓶壓為 10 個氣壓時即更換新氣。
4.1 設定高壓為 20kv/10mA，然後關高壓。
4.2 設定分光室介質為空氣狀態。
4.3.運行 TCM4400，進入 Detector Gas Support 按下 F2=Change gas bottle。
4.4 關閉鋼瓶主閥門，取下減壓閥。
4.5 更換新的 P10 氣體瓶。
4.6 快速打開氣瓶主閥並迅速關閉以沖洗介面。
4.7 安裝減壓閥，打開主閥門，檢查二次壓力為 0.7-0.8bar。(通常為 0.75bar)
4.8 用指令 F1=Start detector gas 啟動 P10 氣,設定分光室介質為真空狀態。
4.9 開高壓，正常分析。
4.10.檢查 PHD，進入 DETECTOR CHECK，檢查 PHD 時注意： 1） 2） 3） 4） 5） PSC 設定為 No 根據要求設定不同的晶體，角度，探測器，並 Load 樣品 （C3 或 Cu）。 調節 KV，mA, Collimator, Mask 等，使得 Current(kcps): 20kcps 左右。 按 F1 鍵，開始測量，觀察 Top poisition, 是否為 50±2。如不是，調節 Detector HV，使其為 50±2。 一般設定：LiF200+FL：用 Cu Kβ線，角度 40.45，樣品 Cu。 GE+FL：用 PKα 線，角度 140.96,樣品 C3。PET+FL，Al Kα，145.00，C3 樣品。PX1+FL，Cu Lα，角度根據 2d 值計算，（λ=13.336）Cu 樣品。LiF220+FL，CuKαβ，58.53， Cu 樣品。 Collimator：準直器。Xtal：晶體。Angle：角度。Detector：探測器。Detector HV：探測器高壓。Top position：峰值位置。Tube Kv mA: 高壓設定。 一般而言，Xtal：1:LiF200, 2:GE, 3:PET,4:PX1, 8:LiF220. Collimator: 1:300, 2:150, 3:700. Detector: 1:FL (流氣探測器) 3：Sc （閃爍探測器）。 裝樣及卸樣品：按 F9（Genaral）鍵，然後 F1（load/unload）鍵。 6） 7） 8） Sc 探測器通常一年或兩年可以檢查一次。它只能和 LiF200 及 LiF220 聯合使用。設定條 件和上面一樣，將探測器設定為 3 號即可。 如果水流量變得很低，將使安全迴路動作，從而不能打開高壓，這時需更換水 過濾器。更換的周期取決於水的質量。建議每年更換一次。 建議每年更換一次。 建議每年更換一次
5.1 設定高壓為 20kv/10mA，然後關高壓。
5.2 關閉水冷機閥門。
5.3 取出水過濾器，清洗過濾器或更換新的過濾器，重新安裝好。
5.4 打開水冷機閥門。檢查漏水情況。
5.5 開高壓，正常分析。 1）空氣壓縮機壓力：5.0bar。排水每月一次並檢查油位。 冷卻水：流量，漏水？ P10 氣體：鋼瓶壓力是否小於正常壓力(大於 10)？二次壓力：0.7-0.8bar。 分光室真空度：小於 100Pa。 儀器內部溫度：30 度。 6.6 冷卻陽極(anode)的水流量應為 1~4L/min, 冷卻陰極(cathode)的水流量應為 3~5L/min, P10 氣體的流量應為 0.6~2L/H(1L/H 最好)。
2）定期檢查真空泵油麵（3 個月），真空泵每月要將氣鎮閥打開排除泵中水份， 每年更換真空泵油。
3） 根據分析樣品情況，定期清潔分光室。