組蛋白修飾研究方法

❶ 關於表觀遺傳學的一些常用的研究手段有哪些

表觀遺傳調控是基因表達調控的重要組成部分，已成為當前研究的熱點。目前其研究主要集中在DNA甲基化和組蛋白修飾。針對這兩種表觀修飾，其研究方法也取得了較大進展，一方面方法的靈敏度和特異性都在不斷提高；另一方面表觀修飾的檢測正在逐步從定性檢測向定量分析方向發展，從個別位點向高通量檢測發展。此外，新一代測序技術的應用將大大推動表觀遺傳研究的發展，包括單分子實時測序法、單分子納米孔測序法等。綜述目前常用的DNA甲基化、組蛋白修飾研究方法以及最新的單分子測序技術，並對它們在表觀遺傳修飾檢測中的應用作了簡要對比分析。

❷ 什麼是染色質免疫共沉澱技術（ChIP）

染色質免疫共沉澱技術是在保持組蛋白和DNA聯合的同時，通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體，染色質被切成很小的片斷，並沉澱下來的技術。

這項技術主要用來分析目標基因有沒有活性、或者分析一種已知蛋白（轉錄因子）的靶基因有哪些。該技術主要應用於以下幾方面：

1.組蛋白修飾酶的抗體作為「生物標記」

2.轉錄調控分析

3.葯物開發研究

4.有絲分裂研究

5.DNA損失與凋亡分析

(2)組蛋白修飾研究方法擴展閱讀：

實驗步驟：

1、細胞固定

甲醛能有效的使蛋白質-蛋白質，蛋白質-DNA，蛋白質-RNA交聯，形成生物復合體，防止細胞內組分的重新分布。甲醛的交聯反應是完全可逆的，便於在後續步驟中對DNA和蛋白質進行分析。交聯所用的甲醛終濃度為1%，交聯時間通常為5分鍾到1個小時，具體時間根據實驗而定。

值得注意的是，交聯時間如果過長，細胞染色質難以用超聲波破碎，影響ChIP結果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯時間如果過短，則交聯不完全，產生假陰性。甲醛的交聯反應可被加入的甘氨酸終止。

2、染色質斷裂

交聯後的染色質可被超聲波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段（用瓊脂糖凝膠電泳檢測），以便暴露目標蛋白，利於抗體識別。超聲波是使用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產生泡沫，這都會引起蛋白質變性，進而影響ChIP的效率。

所以在超聲波斷裂染色質時，要在冰上進行，且要設計時斷時續的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側壁，以免產生泡沫。總超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。

技術應用：

1、Micrococcal Nuclease可以將染色質切成一到幾個核小體，比超聲波處理的結果更精緻，更均一。另外，酶反應的條件比較溫和，對DNA和DNA-蛋白復合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質適用於新鮮的細胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時，經常採用沒經過甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。

因為N-ChIP沒經過甲醛固定，超聲波處理會打斷組蛋白和DNA的結合，所以只能選擇酶處理染色質的方法。對於甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。

2、染色質免疫沉澱的DNA適用於多種分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要驗證的，可採用狹縫雜交（Slot blot）的方法，把靶序列特異性探針與染色質免疫沉澱的DNA雜交，來驗證目的蛋白與DNA靶序列的特異性結合。

還可以根據靶序列設計引物，用半定量PCR的方法進行測定，或採用Real-time PCR方法進行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的（high-throughput），可採用Southern雜交。但因為免疫沉澱的DNA量較少，所以在研究時通常要用PCR方法擴增DNA探針，再進行整個基因組掃描。

還可以把沉澱的DNA克隆到載體中，進行測序，尋找該序列附近的開放閱讀框，發現新的基因調節序列。

3、目前，隨著人類基因組測序工作的基本完成，研究目的蛋白和整個基因組的相互作用逐漸成為研究的熱點。由於基因組中的信息量非常大，上述常規方法通常無法滿足科研的需要。近年來發展起來的ChIP-chip技術將基因組DNA晶元（chip）技術與染色質免疫沉澱技術（ChIP）相結合，為研究目的蛋白與整個基因組相互作用提供了可能。

ChIP-chip 技術通過標記染色質免疫沉澱富集的DNA片段，和另一個被標記不同探針的對照組樣品一起，與DNA晶元雜交，再利用各種生物信息學方法對收集到的信號進行分析，具體的實驗步驟請參考Dr. Richard Young在Nature Protocols上的文章。

ChIP-chip技術已經被廣泛應用於研究轉錄因子在整個基因組中的信號網路，染色質修飾機制在基因組中的調控，DNA的復制，修復以及修飾，基因的轉錄與核運輸等諸多方面。

4、染色質免疫沉澱技術還可用於分析兩種蛋白共同結合的DNA序列，即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在第一次ChIP的基礎上不解交聯，而繼續進行另一個目的蛋白的免疫沉澱，從而得到與兩種目的蛋白都結合的DNA序列。

值得注意的是，因為通過兩次免疫沉澱富集的DNA量比較少，所以在分析時通常要把多次免疫沉澱的DNA濃縮後再進行操作。

5、隨著染色質免疫沉澱技術受到廣泛的關注，運用該技術發表的文章也逐漸增多，大家越來越多的開始關注如何改進ChIP的方法。Millipore最新推出的Magna ChIP試劑盒，利用磁珠分離DNA-蛋白-抗體復合物，提高了ChIP的效率，簡化了操作的過程，縮短了實驗的時間，還為同時進行多個目的蛋白的研究提供了可能，是經常使用ChIP技術的研究人員的理想選擇。

6、近年來ChIP技術也被用於研究RNA-蛋白的相互作用，其原理與DNA類似，也包括甲醛固定，超聲波破細胞，免疫沉澱，交聯逆轉，RNA純化和RNA鑒定等步驟。所不同的是，交聯逆轉只用Proteinase K，要進行RNA純化和不含RNase的DNase處理，分析時用RT-PCR，晶元雜交要用cDNA晶元等。

❸ 蛋白組學的研究方法

蛋白組學的研究方法如下：

蛋白質組學的發展既是技術所推動的也是受技術限制的。蛋白質組學研究成功與否，很大程度上取決於其技術方法水平的高低。蛋白質研究技術遠比基因技術復雜和困難。

不僅氨基酸殘基種類遠多於核苷酸殘基（20/4）, 而且蛋白質有著復雜的翻譯後修飾，如磷酸化和糖基化等，給分離和分析蛋白質帶來很多困難。此外，通過表達載體進行蛋白質的體外擴增和純化也並非易事，從而難以制備大量的蛋白質。

蛋白質組學的興起對技術有了新的需求和挑戰。蛋白質組的研究實質上是在細胞水岩瞎平上對蛋白質進行大規模的平行分離和分析山棗手，往往要同時處理成千上萬種蛋白質。因此，發展高通量、高靈敏度、高准確性的研究技術平台是現在乃至相當一段時間內蛋白質組學研究中的主要任務。

當前在國際蛋白質組研究技術平台的技術基礎和發展趨勢有以下幾個方面： 蛋白質組資料庫是蛋白質組研究水平的標志和基逗嫌礎。瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大，種類最多的蛋白質組資料庫。丹麥、英國、美國等也都建立了各具特色的蛋白質組資料庫。

生物信息學的發展已給蛋白質組研究提供了更方便有效的計算機分析軟體；特別值得注意的是蛋白質質譜鑒定軟體和演算法發展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大學、BHS寶護神、UCSF等都有自主的搜索軟體和數據管理系統。

最近發展的質譜數據直接搜尋基因組資料庫使得質譜數據可直接進行基因注釋、判斷復雜的拼接方式。隨著基因組學的迅速推進，會給蛋白質組研究提供更多更全的資料庫。另外，對肽序列標記的從頭測序軟體也十分引人注目。

❹ 組蛋白修飾的方式

⒈甲基化
組蛋白甲基化是由組蛋白甲基化轉移酶（histonemethyl transferase，HMT）完成的。甲基化可發生在組蛋白的賴氨酸和精氨酸殘基上，而且賴氨酸殘基能夠發生單、雙、三甲基化，而精氨酸殘基能夠單、雙甲基化，這些不同程度的甲基化極大地增加了組蛋白修飾和調節基因表達的復雜性。甲基化的作用位點在賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）的側鏈N原子上。組蛋白H3的第4、9、27和36位，H4的第20位Lys，H3的第2、l7、26位及H4的第3位Arg都是甲基化的常見位點。研究表明·，組蛋白精氨酸甲基化是一種相對動態的標記，精氨酸甲基化與基因激活相關，而H3和H4精氨酸的甲基化丟失與基因沉默相關。相反，賴氨酸甲基化似乎是基因表達調控中一種較為穩定的標記。例如，H3第4位的賴氨酸殘基甲基化與基因激活相關，而第9位和第27位賴氨酸甲基化與基因沉默相關。此外，H4—K20的甲基化與基因沉默相關，H3—K36和H3—K79的甲基化與基因激活有關。但應當注意的是，甲基化個數與基因沉默和激活的程度相關。
⒉乙醯化
組蛋白乙醯化主要發生在H3、H4的N端比較保守的賴氨酸位置上，是由組蛋白乙醯轉移酶和組蛋白去乙醯化酶協調進行。組蛋白乙醯化呈多樣性，核小體上有多個位點可提供乙醯化位點，但特定基因部位的組蛋白乙醯化和去乙醯化是以一種非隨機的、位置特異的方式進行。乙醯化可能通過對組蛋白電荷以及相互作用蛋白的影響，來調節基因轉錄。早期對染色質及其特徵性組分進行歸類劃分時就有人總結指出：異染色質結構域組蛋白呈低乙醯化，常染色質結構域組蛋白呈高乙醯化。最近有研究發現，某些HAT復合物含有一些常見的轉錄因子，某些HDAC復合物含有已被證實的阻遏蛋白。這些發現支持了高乙醯化與激活基因表達、低乙醯化與抑制基因表達有關的看法。
⒊組蛋白的其他修飾方式
相對而言，組蛋白的甲基化修飾方式是最穩定的，所以最適合作為穩定的表觀遺傳信息。而乙醯化修飾具有較高的動態，另外還有其他不穩定的修飾方式，如磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等等。這些修飾更為靈活的影響染色質的結構與功能，通過多種修飾方式的組合發揮其調控功能。所以有人稱這些能被專識別的修飾信息為組蛋白密碼。這些組蛋白密碼組合變化非常多，因此組蛋白共價修飾可能是更為精細的基因表達方式。
另外，研究發現H2B的泛素化可以影響H3K4和H3K79的甲基化，這也提示了各種修飾間也存在著相互的關聯。