A. 細胞凋亡的檢測方法及指標
哥們,大學翟中和版的細胞生物學裡面就有,很全很詳細,似乎就在講癌細胞的那一章,你去翻翻看,不會讓你失望的
B. 如何用DNA Ladder 法檢測細胞凋亡
DNA ladder法就是凝膠電泳DNA片段測定法
DNA Ladder 法檢測細胞凋亡方法如下:
1、凋亡處理:細胞經凋亡處理後,收集細胞(包括懸浮細胞),用70%乙醇-20度固定2h。
2、裂解細胞: 加400ml細胞裂解液,充分搖勻後再加蛋白酶K(10mg/ml),置65度水浴消化至少2h或過夜。
3、處理蛋白:加75ml 8mol/L KAc,4度 15min,再加750ml氯仿,充分混勻後,離心5000r/min 10min後,將上清移至一新的EP管。
4、沉澱DNA:加入750ml無水乙醇,輕柔搖勻即可見乳白色沉澱,若不明顯時可置-20度過夜,12000r/min,10min離心後,用70%乙醇洗DNA兩次。
5、溶解DNA:加50ml無菌雙蒸水,37度溶解DNA。
6、測定DNA的濃度。
7、2%瓊脂糖凝膠電泳80V 2h。
C. 檢測細胞凋亡的方法有哪些
一、形態學觀察方法
1、HE染色、光鏡觀察:凋亡細胞呈圓形,胞核深染,胞質濃縮,染色質成團塊狀,細胞表面有「出芽」現象。
2、丫啶橙(AO)染色,熒光顯微鏡觀察:活細胞核呈黃綠色熒光,胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側,可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、台盼藍染色:如果細胞膜不完整、破裂,台盼藍染料進入細胞,細胞變藍,即為壞死。如果細胞膜完整,細胞不為台盼藍染色,則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性,區別壞死細胞有一定的幫助。
4、透射電鏡觀察:可見凋亡細胞表面微絨毛消失,核染色質固縮、邊集,常呈新月形,核膜皺褶,胞質緊實,細胞器集中,胞膜起泡或出「芽」及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。
二、DNA凝膠電泳
(一)檢測原理
細胞發生凋亡或壞死,其細胞DNA均發生斷裂,細胞內小分子量DNA片斷增加,高分子DNA減少,胞質內出現DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規律的發生在核小體之間,出現180-200bpDNA片斷,而壞死細胞的DNA斷裂點為無特徵的雜亂片斷,利用此特徵可以確定群體細胞的死亡,並可與壞死細胞區別。
(二)結果判斷
正常活細胞DNA 電泳出現階梯狀(LADDER)條帶;壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續性條帶。
三、酶聯免疫吸附法(ELISA)核小體測定
凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質內出現核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成,可由ELISA法檢測。
(一)檢測步驟
1、將凋亡細胞裂解後高速離心,其上清液中含有核小體;
2、在微定量板上吸附組蛋白體;
3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合;
4、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合;
5、加酶的底物,測光吸收制。
(二)用途
該法敏感性高,可檢測5*100/ml凋亡細胞。可用於人、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器,適合基層工作,但是不能精確測定凋亡細胞發生的絕多對量。
四、流式細胞儀分析
(一)檢測原理
細胞發生凋亡時,其細胞膜的通透性也增加,但是其程度介於正常細胞與壞死細胞之間。利用一特點,被檢測細胞懸液用熒光素染色,利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。
(二)應用價值
流式細胞儀檢測具有以下特點:
1)、檢測的細胞數量大,因此其反映群體細胞的凋亡狀態比較准確
2)、可以做許多相關性分析
3)、結合被檢測細胞的DNA含量的分析,可確定凋亡的細胞所處的細胞周期
■檢測形態學及細胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法
細胞發生凋亡時,其細胞膜的通透性液增加,但其程度介於正常細胞和壞死細胞之間,利用這一特點,被檢測細胞懸液用熒光素染色,利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。
利用Hoechs-PI染色法,正常細胞對染料有抗拒性,熒光染色很淺,凋亡細胞主要攝取Hoecha染料,呈現強藍色熒光,而壞死細胞主要攝取碘化丙啶(PI)而呈強的紅色熒光。
■DNA片斷原位標記法
凋亡細胞DNA片斷原位末端檢測技術是指在細胞(或組織)結構保持不變的情況下,用熒光素、地高辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate,DUTP)和末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)相反應與凋亡細胞裂解後3.的羥基(-OH)端結合,經顯色反應後檢測DNA裂解點的技術。
DNA片段原位標記法有二種:
1、原位缺口轉移(in situ nick-translation,ISNT)技術,它是利用DNA多聚酶I將標記的核苷酸連接到斷裂DNA的3-OH端
2、原位缺口末端標記技術(in situ end labelling technique,ISEL),即TUNEL法,它是利用TdT將標記的DUPT接到3-OH端。研究證明,TUNEL法的敏感性遠高於ISNT,尤其對早期凋亡的檢測,TUNEL為合適。
■檢測細胞膜成分變化的Annexin V 聯合PI法
1、原理:在細胞凋亡早期位於細胞膜內側的磷脂醯絲氨酸(PS)遷移至細胞膜外測。磷脂結合蛋白V(Annexin V)是鈣依賴性的磷脂結合蛋白,它於PS具有高度的結合力。因此,Annexin V可以作為探針檢測暴露在細胞外測的磷脂醯絲氨酸。故利用對PS有高度親和力的Annexin V,將Annexin V標記上熒光素(如異硫氰酸熒光素FITC),同時結合使用PI拒染法(因壞死細胞PS亦暴露於細胞膜外測,且對PI高染)進行凋亡細胞雙染法後用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。
2、結果判斷:正常活細胞Annexin V 、PI均低染;凋亡細胞Annexin V高染、PI低染;壞死細胞Annexin V/PI均高染。
3、應用價值:細胞發生凋亡時,膜上的PS外露早於DNA斷裂發生,因此Annexin V聯合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又Annexin V聯合PI染色不需固定細胞,可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現的DNA片段丟失。因此,Annexin V聯合PI法更加省時,結果更為可靠,是最為理想的檢測細胞凋亡的方法。
D. 最常用的細胞凋亡檢測方法是什麼
細胞死亡的方式主要有兩種,包括 細胞壞死(necrosis)和細胞凋亡(apoptosis) 。細胞壞死是早已被認識到的細胞死亡方式,而細胞凋亡是近年來逐漸被認識且越來越受到重視的細胞死亡方式。兩種死亡方式最重要的區別是細胞壞死會釋放出細胞內溶物, 引起炎性反應 ,而細胞凋亡不會暴露細胞內溶物,一般被吞噬細胞吞噬清除, 不引起炎性反應 。
細胞凋亡,也稱 細胞程序性死亡,是指在一定的生理或者病理條件下,細胞主動的、高度有序的、自己結束其生命的過程 。細胞凋亡是生物體中一種普遍存在的現象,胚胎形成、個體發育、衰老和損傷細胞的清除等都與細胞凋亡密切相關。細胞凋亡在免疫學中也非常重要,如T細胞在胸腺內發育的過程,經過陰性選擇和陽性選擇後,95%的胸腺細胞發生凋亡,只有5%的胸腺細胞發育為成熟T細胞進入外周。
檢測細胞凋亡的方法很多,如電子顯微鏡或者光學顯微鏡下的形態學觀察、細胞DNA提取物的DNA梯狀帶電泳實驗等。而流式細胞術是非常重要的檢測細胞凋亡的方法,不僅可以定性,也可以定量。流式細胞術檢測細胞凋亡的方法也有很多,其中最重要是annexinV/PI雙染色法。其他的還有SYTO/PI雙染色法、細胞DNA含量分析法、線粒體損傷檢測法、活化的caspase-3檢測法、FLICA標記法、甲醯胺誘導ssDNA單抗檢測法、TUNEL法等。今天主要介紹一下annexinV/PI雙染色法。
Annexin V/PI雙染色法
正常細胞膜的磷脂分布是不對稱的,活細胞中 磷脂醯絲氨酸(phosphatidylserine,PS) 位於 細胞膜的內表面 ,細胞凋亡時,細胞膜發生變化, PS從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表 面。 annexinV是一種對PS有高度親和力的、鈣依賴性的磷脂結合蛋白 ,annexinV可以特異性地識別凋亡細胞表面的PS,而 活細胞的PS位於細胞膜的內表面 ,無法與annexinV特異性結合。所以可以用FITC偶聯的annexinV鑒別凋亡細胞和活細胞。
壞死細胞的PS也會從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表面,annexinV也能識別壞死細胞表面的PS,所以 annexinV無法區分壞死細胞和凋亡細胞 。而 PI染料能夠與細胞內的DNA結合 , 區分壞死細胞和活細胞 。凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整,PI染料無法自由通過細胞膜進入細胞內與DNA結合,所以 PI染料無法標記凋亡細胞和活細胞 ,而PI染料卻能夠通過壞死細胞的細胞膜與細胞內的DNA結合,壞死細胞內PI染料被488nm激光激發後會發射紅熒光,被FL2或FL3通道接收。所以 annexinV和PI同時使用,就可以區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞 ,這就是annexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡的原理。
標記方法與常規標記熒光抗體的方能一樣:加入適量的FITCannexinV和PI,4℃靜置30min即可。注意 標記PI的方法與PI染色檢測細胞內DNA含量的方法不同,不需提前固定細胞 ,因為本方法標記PI是為了檢測細胞膜的通透性從而鑒別細胞是活細胞還是死細胞,而用PI檢測DNA含量時必須先破壞活細胞的細胞膜的完整性使PI進入細胞內與DNA結合。
下圖是用annexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡得到的一張散點圖。圖中大致可以分為三大細胞群:右上象限的細胞表型為annexinV+PI+,代表的是壞死細胞;右下象限的細胞表型為annexinV+PI-,代表的是凋亡細胞;左下象限的細胞表型為annexinV-PI-,代表的是活細胞。通過annexin V/PI雙染色法可以非常明確地區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞,並且可以定量分析各自所佔的比例。
例:
下圖引自[1],作者用annexinV/PI雙染色法檢測肺癌細胞系「H1299」和「A549」細胞凋亡,證明肺癌細胞表面的TLR4受體與LPS結合後,能夠增強其抵抗TNFα和TRAIL誘導的凋亡。
從圖中可以看出,TRAIL誘導後,H1299肺癌細胞系的凋亡比例從3.36%上升到13.7%,被TNF-α/CHX誘導後,凋亡比例上升到16.9%;如果在誘導前加入LPS,活化H1299表面TLR4信號,被TRAIL誘導後凋亡比例只有3.8%,被TNF-α/CHX誘導後凋亡比例只有3.93%,說明H1299表面TLR4信號的活化能夠促進其抵抗凋亡。另一個肺癌細胞系A549的結果也相似,LPS活化TLR4信號後,TRAIL誘導凋亡比例從16%下降到3.09%,而TNF-α/CHX誘導凋亡比例從17%下降到11.8%。
[1]Weigang He, Qiuyan Liu, Li Wang, et al. 2007. TLR4 signaling promotes immune escape ofhuman lung cancer cells by incing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.Molecular Immunology, 44:2850-2859.