熒光素酶分析儀檢測方法

⑴ 如何使用多功能酶標儀檢測雙熒光素酶

報告基因檢測被廣泛應用於研究基因表達及外部刺激下原核和真核細胞的反應。Luciferase報告基因系統是以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統。可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達。但是報告基因實驗中往往會受到各種實驗條件的影響，例如培養細胞的數目和活力的差別、細胞轉染和裂解的效率、以及加樣操作過程中引起的變異。Dual-Luciferase雙熒光素酶報告基因檢測系統中含有在同一細胞中同時表達的兩種熒光素酶。共轉染的「對照」報告基因會作為內對照，減小細胞活性和轉染效率對實驗的影響。因此雙報告系統減少了外部干擾，使得實驗數據更可信。Promega提供了一種先進的雙報告基因技術（Dual-reporter assays）,結合了螢火蟲熒光素酶測試和海腎熒光素酶測試，該技術同時使用兩個獨立的報告基因以提高實驗的准確性，Biotek synergy 系列微孔板檢測儀作為雙報告基因的檢測分析平台獲得了Promega DLR 認證。
在雙報告基因系統中，通常一個報告基因用於檢測特定實驗條件下待測物的反應，即「實驗」reporter，另一個報告基因用來檢測實驗條件，類似於內部對照，用於校準「實驗」reporter的數據。通過這種方法，可減少內在的變化因素所削弱的實驗准確性，例如：轉染效率、細胞活性、細胞裂解差異以及加樣操作過程中引起的差異。Promega公司的Dual-Luciferase系統利用螢火蟲和海腎熒光素酶的活性分別檢測實驗組和對照組。螢火蟲熒光素酶是一種分子量為61KD的單體酶，分兩步催化蟲熒光素的氧化反應，產生560nm的光，海腎熒光素酶是一種分子量為36KD的單體酶，催化海腎熒光素的氧化反應，產生中心波長為480nm的藍光。螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶沒有種源同源性，對應不同的反應底物，反應中沒有任何的交叉干擾。

⑵ 熒光素酶報告基因的應用原理

應用原理

轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子，也稱為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現共價結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。

熒光素酶報告基因實驗（luciferase assay）是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段。

其原理簡述如下：

（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質粒，如pGL3-basic等。

（2） 將要檢測的轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染293細胞或其它相關的細胞系。如果此轉錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。

（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

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應用

植物基因工程

在植物基因工程研究領域，已使用的報告基因有以下幾種：胭脂鹼合成酶基因（nos）、章魚鹼合成酶基因（ocs）、新黴素磷酸轉移酶基因（nptⅡ）、氯黴素乙醯轉移酶基因（cat）、慶大黴素轉移酶基因、葡萄糖苷酶基因、熒光酶基因等。

nos、ocs這兩個基因是致瘤土壤農桿菌（Agrobacterium tumfaciens）的Ti質粒特有的，對Ti質粒進行改造，用相應的致瘤農桿菌轉化植物體時，如果外源基因轉入植物體中，則這兩種報告基因在植物根莖葉中均能表達，不受發育調控，檢測時直接用轉化體提取液進行紙電泳，染色後在紫外光下觀察熒光即可。

nptⅡ、cat及慶大黴素轉移酶基因，均為抗生素篩選基因，相關的酶可以對底物進行修飾（磷酸化、乙醯化等），從而使這些抗生素失去對植物生長的抑製作用，使得含有這些抗性基因的轉化體能在含這些抗生素的篩選培養基上正常生長，也可以用轉化體提取液體，外用同位素標記，放射自顯影篩選轉化體。

常用的一種報告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，該酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物體中幾乎無背景，組織化學檢測很穩定，可用分光光譜、熒光等進行檢測。

熒光酶基因（luc）是1985年從北美熒火蟲和叩頭蟲cDNA文庫中克隆出來的，該酶在有ATP、Mg2+、O2和熒光素存在下發出熒光，這樣就可用轉基因植物整株或部分直接用X-光片或專門儀器進行檢測。

動物基因工程

在動物基因表達調控的研究中，報告基因也被廣泛應用。常用的有氯黴素乙醯轉移酶基因（cat）、β-半乳糖苷酶基因（LacZ）、二氫葉酸還原酶基因、熒光酶基因等。

cat基因作為報告基因，檢測時可通過放射自顯影觀察。熒光酶基因作為報告基因，具有檢測速度快、靈敏度比cat基因高30～1000倍、費用低、不需使用放射性同位素等優點，得到了廣泛的採用。

檢測因子作用

可通過報告基因的表達，研究蛋白質與蛋白質之間的相互作用。雙雜交體系是由報告基因轉錄調控區、報告基因及一對可以相互作用的雜合反式作用因子組成。

來從上述雜交體系中發展出的單一雜交體系技術，也是根據報告基因表達量的檢測篩選出與已知順式作用元件相結合的未知因子的DNA，該項技術正廣泛應用於克隆細胞中含量微弱且用生化手段難以純化的反式作用因子。

由此可知，報告基因在基因表達調控和基因工程研究中處於非常重要的地位，它是作為外源目的基因能否轉化植物體的探路先鋒而首先被研究的，在研究植物的基因表達調控方面起著重要的作用，現已推廣到真核生物的基因調控領域中。隨著基因工程技術日新月異的發展，報告基因這一探路者的作用會更明顯。

參考資料來源：網路-熒光素酶報告基因

參考資料來源：網路-報告基因

⑶ 細菌總數的檢驗方法是什麼

細菌總數是水質參數之一，指單位體積水中的細菌總量。其檢驗方法是:在玻璃平皿內,接種一毫升水樣或稀釋水樣於加熱液化的營養瓊脂培養基中，冷卻凝固後在37°C培養24小時，培養基上的菌落數或乘以水樣的稀釋倍數即為細菌總數。有的國家把培養溫度定為35°C或其他溫度，也有把培養時間定為48小時的。

⑷ 熒光檢測方法

熒光檢測是一種自然發光反應，通過熒光素酶與 ATP進行反應，可檢測人體細胞、細菌、黴菌、食物殘渣，在15秒鍾內得到反應結果。光照度通過專用設備進行測量，並以數字形式予以表示，在1975年首先被應用到食品工業中，在1985年在化妝品製造業中得到應用。
熒光定量：採用國際主流的熒光定量PCR技術，迅速提升技術水平。
結果穩定：檢測結果CV值與進口全自動PCR儀接近，具有自檢功能，避免錯誤數據的輸出。
封閉操作：全部檢測過程均為閉管操作，於反應管處檢測熒光，有效防止污染，解決PCR技術中最棘手之難題。
准確定量：滿足臨床對量化的需求，定量盪圍寬，可涵蓋大部分病原微生物，自動曲線擬合。
靈敏度高：利用光譜信號靈敏性的優勢，有效提高檢測靈敏度。
安全：全程無毒檢測。
操作簡便：省去後處理的煩瑣過程。
直接列印：直接列印結果，無須記錄大量數據。
升級版：FS1000有與電腦連接的數傳輸口，可以連接電腦，根據用戶需要提供先進分析軟體，全面分析實驗數據。（電腦和列印機選配件）
故障率低：維護非常簡單。
節約資源：可利用現用PCR擴增儀，最大限度節約資源。