多肽n端序列分析方法

1. 常用於蛋白質多肽鏈N端.C端測定的方法有幾種基本原理是什麼

(1)N-末端測定 A.二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)：1945年Sanger提出此方法，是他的重要貢獻之一。DNP-氨基酸用有機溶劑抽提後，通過層析位置可鑒定它是何種氨基酸。Sanger用此方法測定了胰島素的N末端分別為甘氨酸及苯丙氨酸。B.氰酸鹽法：1963年Stank及Smyth介紹了一種測定N末端的新方法，步驟如下：由於乙內醯脲氨基酸不帶電荷，因此可用離子交換層析法將它與游離氨基酸分開，分離所得的乙內醯脲氨基酸再被鹽酸水解，重新生成游離的氨基酸，鑒別此氨基酸即可了解N-末端是何種氨基酸。C.二甲基氨基萘磺醯氯法：1956年Hartley等報告了一種測定N-末端的靈敏方法，採用1-二甲基氨基萘-5-磺醯氯，簡稱丹磺醯氯。它與游離氨基末端作用，方法類似於Sanger的DNFB法，產物是磺醯胺衍生物。丹磺醯鏈酸具有強烈的黃色熒光。此法優點為靈敏性較高(比FDNB法提高100倍，樣品量小於1毫微克分子)及丹磺醯氨基酸穩定性較高(對酸水解穩定性較DNP氨基酸高)，可用紙電泳或聚醯胺薄膜層析鑒定。(2)C-末端分析A.肼解法：這是測定C-末端最常用的方法。將多肽溶於無水肼中，100℃下進行反應，結果羧基末端氨基酸以游離氨基酸狀釋放，而其餘肽鏈部分與肼生成氨基酸肼。這樣羧基末端氨基酸可以採用抽提或離子交換層析的方法將其分出而進行分析。如果羧基末端氨基酸側鏈是帶有醯胺如天冬醯胺和谷氨醯胺，則肼解時不能產生游離的羧基末端氨基酸。此外肼解時注意避免任何少量的水解，以免釋出的氨基酸混淆末端分析。B.羧肽酶水解法：羧肽酶可以專一性地水解羧基末端氨基酸。根據酶解的專一性不同，可區分為羧肽酶A、B和C。應用羧肽酶測定末端時，需要事先進行酶的動力學實驗，以便選擇合適的酶濃度及反應時間，使釋放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。

2. 如何預測一段多肽鏈的氨基酸序列

如何預測一段多肽鏈的氨基酸序列
有兩種方法，一是直接測序列法，常用Edman降解法，在弱鹼性條件下多肽連N端氨基酸（阿爾發）與PITC反應，標記為苯氨基硫代甲醯蛋白質。肽鏈中的第一個肽鍵變弱，在無水酸的存在下發發生降解，第一個氨基酸（AA1）經過分子重排成為PTH-AA1結合層析技術即可確定氨基酸的性質。C端氨基酸殘基分析，可用；羧基肽酶，肼解法；二是串聯質譜測定多肽鏈氨基酸測序。

氨基酸（amino acid）：含有氨基和羧基的一類有機化合物的通稱。生物功能大分子蛋白質的基本組成單位，是構成動物營養所需蛋白質的基本物質。是含有鹼性氨基和酸性羧基的有機化合物。氨基連在α-碳上的為α-氨基酸。組成蛋白質的氨基酸均為α-氨基酸。

3. 多肽和蛋白質類葯物的分析方法

1.1生物檢定法
由於蛋白多肽類葯物多為有生物活性的物質,且生物活性不僅取決於葯物的一級結構，與二 、三級結構亦密切相關，故生物檢定法是研究該類葯物動力學獨特而必需的方法。生物檢定 法 有兩個目的，直接測定體液中葯物濃度及鑒定標記葯物的生物活性。其方法主要可分為兩大 類。
1.1.1在體分析常規的有胰島素的小鼠血糖法等，另外還有根據各 類蛋白多肽的生物活性 不同而建立的各異的方法，如根據IL-8可將大量中性粒細胞從骨中動員出的性質[1] 而建立 的IL-8動員中性粒細胞家兔體內實驗。這類方法最直觀地反映生物活性，但涉及整體動物 ，費時費力，靈敏度不高，變異較大。
1.1.2離體組織（細胞）分析如NGF刺激雞背根神經節增長，縮宮素 的大鼠離體子宮法等。 隨著分子生物學的發展，許多特異性強，靈敏度高的依賴細胞株被建立，細胞培養已是最常 用的方法。根據蛋白多肽與細胞相互作用的機理不同，具體的操作亦有多種。如細胞增殖法 （Proliferation assays）,快速靈敏,但特異性稍差; 抑制增殖法(Antiproliferation as s ays),檢測系統簡單,靈敏而專一; 減少細胞損傷法(Cytopathic effect rection assays ) [2],則是依據具有抗病毒活性的葯物如干擾素，保護細胞不受病毒損傷, 方法直觀 靈敏, 但 可能會受到多肽亞型的干擾。以上的方法都是以細胞數目的增減為量效指標，計數方法有直 接計數法和間接計數法，後者包括MTT法，同位素（3H,14C）摻入法 等。此外，還有根據蛋 白多肽與細胞間接作用進行檢測，如與免疫檢測聯用的抗體誘導法[3]，結合酶反 應的酶誘 導分解法[4]等。總的說來，細胞培養法多具有靈敏特異，客觀可靠的優點，但其 不足也顯 而易見。首先，生物檢定法無法定量失去活性的小代謝物，無法示蹤它們的體內動態；其次 ，樣品多存在於人或動物血清中，血清中內源物質的干擾以及可能存在的內源因子的交叉反 應，影響了方法的專屬性；再者，啟動生物過程常需閾量細胞因子從而降低了方法的靈敏度 ；依賴株細胞長期培養易發生變異而影響檢測的特異性。
1.2免疫學方法
免疫學方法是利用蛋白多肽葯物抗原決定簇部位的單克隆或多克隆抗體特異地識別被檢葯物 ，再以放射計數，比色等方法予以定量，即將特異的抗原抗體反應配以靈敏檢測的方法。常 用的方法有三種。
1.2.1放射免疫法（Radioimmunoassays RIA）該法是被測葯物（Ag ）,標記葯物（多為125I-Ag）與抗體（Ab）的競爭性結合反應，方法的特異性 取決於抗原抗體的親和力及標記葯 物的純度，與生物檢定法相比，有簡明，易於控制的優點。
1.2.2免疫放射定量法（Immunoradiometrec assays IRMA）該法中 被測葯物依然是Ag，它 先與固定相上的Ab形成Ab∶Ag復合物，再與標記抗體125I-Ab結合，形成Ab∶Ag ∶125I-Ab夾心 狀。由於Ag需有兩個Ab來識別，這就大大增加了方法的特異性，是一靈敏而低變異的方法， 只是對標記抗體的純度要求很高。
1.2.3酶聯免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA）ELISA的原理與IRMA相 似，只是第二個抗體不是用碘標，而是用可以與底物發生顯色反應的酶如HRP來標記，與上 述兩法相比，ELISA具有使用壽命長，重復性好，無輻射源的優點，並且已有不少實驗證明 ，它與生物檢定法具有一定的量效關系[4]及相關性[5]，提示它可部分地 反映葯物的生物活性。
免疫學方法的缺點在於它測定的是蛋白多肽的免疫活性而不是生物活性；不能同時測定代謝 物，且具有抗原決定簇的代謝片段可能增加結果誤差；不同來源的抗體與相同的蛋白多肽反 應可能有較大的差別；還可能受到內源物質的干擾。但免疫法畢竟是一種迅速，靈敏，適於批處理的方法，已有數十種蛋白多肽被開發成能滿足葯物動力學研究的商品葯盒。臨床 葯動學領域，免疫法已逐漸取代生物檢定法。
1.3同位素標記示蹤法
放射性同位素標記技術是研究蛋白多肽在生物體內處置的一種最常用的方法。所使用的同位 素有125I, 99mTc, 3H,14C, 35S 等，其中125I因比放射性高，半衰期適宜，標記制備簡單 而最為常用。標記方法有兩種，一是內標法，即把含有同位素的氨基酸加入生長細胞或合成 體系，該法對生物活性地影響可能較小，但由於制備復雜而限制了其廣泛應用；二是外標法 ，常用化學方法如氯胺T或Iodogen法將125I連接於大分子上，因相對簡單而被首 選。
同位素法具有簡便直觀，檢測迅速的優點，尤其適用於蛋白多肽葯物的組織分布研究，但其 缺點亦顯而易見。首先，它不能進行人體葯物動力學研究；其次，同位素標記後是否會引起 葯物的生物活性及其在生物體內的代謝行為發生變化，一直存在爭議．前者可通過調整反應 條件和生物檢定法加以改善和驗證，基本上可使生物活性無明顯變化；後者因葯而異則復雜 的多，已有報道認為[6]，放射性標記法可干擾表皮生長因子與細胞的相互作用， 從而導致 其體內清除的紊亂；最後，由於蛋白多肽進入體內會被降解代謝，或與其它蛋白質結合，總 的放射性不能代表葯物動力學過程，因此如何鑒別樣品的原葯，降解物及結合物是該法中需 解決的關鍵問題，常用的方法有兩種。
1.3.1SDS-PAGE法根據葯物Mr的大小選擇不同濃度的凝膠電 泳，通過控制電流等條件使得原 葯與其它產物分開，然後通過切割膠條放射計數或放射自顯影的方法，來檢測電泳放射性圖 譜。該法具有較高的解析度和靈敏度，但電泳過程中，125I-小肽和游離 125I可能擴散至空白凝膠或電解液中，從而使結果可能偏高。
1.3.2HPLC法高效反相色譜（RHPLC），高效排阻液相色譜（SEHPLC ）[7]，高效離子交換液相色 譜（IEHPLC）分別根據保留時間與蛋白多肽的疏水-親水性特徵，Mr大小，極性的 關系 來分離樣品中的物質。它們共同的優點是特異性高，解析度好，可同時測定原葯和降解物， 其中SEHPLC亦可得到結合物的信息，而RHPLC用於蛋白多肽的分離有獨特的優越性。但因受 注入樣品量的限制，靈敏度，重現性都受影響，且設備昂貴，成本較高。
1.3.3 HPLC-RAD法
高效液相偶聯同位素在線檢測系統。這種方法將HPLC的高度分析分離行為和同位素的高靈敏度檢測結合在一起。使得葯物的分析分離更加直觀和方便。特別在蛋白質多肽類葯物葯動學方面體現了其獨特的優點。
1.4色譜法
1.4.1HPLC在進行普通葯物動力學研究中，HPLC是技術成熟，應用廣 泛的分析手段。在蛋 白多肽葯物的實驗研究或產業化中，HPLC都是主要的分離純化工具。但鑒於蛋白多肽葯物結 構的特殊性，除了一些小分子多肽，如peptichemio[8]，加壓素的八肽拮抗劑（oc tapeptid e antagonist of vasopressin）[9]可分別直接或經選擇性柱反應後,單獨 用帶熒光檢測 器的HPLC進行葯動學研究外，HPLC常需進一步改進或與其它更靈敏的檢測技術聯用方能滿足 葯動學的需要。除了上述提及的與同位素的聯用，還有許多與免疫學方法的聯用，如Philli ps[10]採用免疫親和色譜技術分析人三種不同體液中粒細胞集落刺激因子的濃度； Partilla [11]等認為HPLC與RIA聯用可以檢測人體液中的神經肽。此外，令人矚目的還有液 /質在線聯用（LC-MS）。
LC-MS將高分離能力，適用范圍廣泛的色譜分離技術與高靈敏、專屬及通用,在研究蛋 白多肽的結構中具有重要價值的質譜法聯用起來，成為強有力的分離分析方法。多年來限制 LC-MS技術發展的決定因素是介面問題，由傳送帶介面（Moving-belt interface），熱噴 霧 介面（Thermospray），到最近的電噴霧離子化介面（Electrosptay ionization ESI），聯 用技術日趨成熟，尤其適用於生物樣品中低濃度（pg/ml）葯物及代謝物的測定[12] ，而蛋 白多肽類葯物恰有在體內代謝快，濃度低的特點。國外已將用LC-MS於該類葯物，葯物代 謝 物[13，14]的動力學研究，國內尚處於起步階段，除了儀器本身價格昂 貴，技術上亦存在 一些問題，如它對樣品的純度要求很高如何將葯物從生物體液，尤其是血漿中提取純化以 減少干擾；如何選擇合適的內標以減少系統誤差；在將LC-MS用於檢測體育禁用肽(HCG,HGH ,EPO,ACTH等)時發現，糖肽難用於質譜分析，因為在質譜條件下，同樣的氨基酸序列可產生 多種不同質量的多糖鏈，而每條鏈及整個分子都有可以產生質譜信號，這就大大降低了質譜 信號的專屬性。盡管LC-MS在蛋白多肽葯物的體內葯物代謝動力學研究中還存在一 定的難度，但其作為實用性強，前景好的領域已引起人們的廣泛關注。
1.4.2高效毛細管電泳（HPCE）HPCE是離子或荷電粒子以電場為驅動 力，在毛細管中按其 濃度和分配系數不同進行高效，快速分離的新技術，它以高解析度，高靈敏度，分析時間短 ，樣品量少及操作簡單等諸多優點而成為蛋白多肽生物分子分離分析的重要手段。在臨床 上 ，生物體液中低濃度蛋白多肽的分析面臨的問題有：蛋白多肽與毛細管壁的相互作用所引起 的遷移時間的改變，這可以通過塗層CE加以改善；由於毛細管很細，管內容積很小，進樣量 的不易控制給實驗的重復性帶來影響，而且很可能無法對低濃度的樣品提供足夠的靈敏度。 國外根據樣品的性質採用不同的預處理，大體上可分為非特異性和高親和性兩種， 將樣品加以濃縮，取得了滿意的效果[15]。HPCE在檢測上的迅速發展與HPLC已有並 駕齊驅之 勢，況且鑒於HPCE在樣品微量分析的優越性，已有人在葯物動力學研究、體內分析中，將微 透析連續采樣與之聯用[16]，這在整個葯動學研究中都不失為一有希望的方向。 2結語
由以上可知，現代科學技術的發展給蛋白多肽類葯物的研究提供了多樣的分析手段，但鑒於 該類葯物的特殊性，尚無一種方法能完全滿足動力學研究的要求。根據人用葯物注冊國 際協調會議（ICH）對生物葯物臨床前安全性評價「在科學基礎上的靈活性和具體情節個別 處理」的總則，人們通常將幾種方法聯合應用，互相補充，才能得到比較可靠的結果。

4. 多肽鏈的序列分析題怎麼做

直接測序列法：常用Edman降解法，在弱鹼性條件下多肽連N端氨基酸（阿爾發）與PITC反應，標記為苯氨基硫代甲醯蛋白質。

肽鏈中的第一個肽鍵變弱，在無水酸的存在下發發生降解，第一個氨基酸（AA1）經過分子重排成為PTH-AA1結合層析技術即可確定氨基酸的性質。C端氨基酸殘基分析，可用；羧基肽酶，肼解法。

多肽的生物合成

同時，游離在細胞質中的轉運RNA（tRNA）把它攜帶的特定氨基酸放在核糖體的mRNA的相應位置上，然後tRNA離開核糖體，再去搬運相應的氨基酸。

這樣，在合成開始時，總是攜帶甲硫氨酸的tRNA先進入核糖體，接著帶有第二個氨基酸的tRNA才進入，此時帶甲硫氨酸的tRNA把甲硫氨酸卸下，放在mRNA的起始密碼位置上，然後自己離開核糖體，甲硫氨酸的－COOH端與第二個氨基酸的-NH2形成肽鍵。

以上內容參考：網路-多肽鏈

5. 常用於蛋白質多肽鏈N端.C端測定的方法有幾種

常用於蛋白質多肽鏈N端測定的方法：

1、二硝基氟苯法（FDNB法）

2、二甲基氨基萘磺醯氯法（DNS－Cl法）

3、異硫氰酸笨酯法（Edman法）

常用於蛋白質多肽鏈C端測定的方法

1、肼解法

2、還原法

3、羧肽酶法

(5)多肽n端序列分析方法擴展閱讀：

多肽合成是一個固相合成順序，一般從N端即氨基端向C端即羧基端合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的稱為液相合成法。

液相合成基於將單個N-α保護氨基酸反復加到生長的氨基成份上，合成一步步地進行， 通常從合成鏈的C端氨基酸開始，接著的單個氨基酸的連接通過用DCC，混合炭酐， 或N-carboxy酐方法實現。

6. 蛋白質多肽鏈N端測定的方法及基本原理

1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈藉助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).
2 測定蛋白質分子中多肽鏈的數目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數與蛋白質分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數目。
3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然後用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。
二硫鍵的切割與保護（元素後數字為下標）
a 過甲酸〔performic acid〕 不可逆
－CH2SO3H
b、還原＋氧化 不可逆
[ 巰基乙醇，DTT ] ＋ 碘乙酸等
－S-CH2-COOH
c、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆
－R1-S-S-R2 ＋ HSO3-
R1-S- + R2-S-SOH3
可以通過加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。
巰基（-SH）的保護4 測定每條多肽鏈的氨基酸組成，並計算出氨基酸成分的分子比（如右圖）
5 分析多肽鏈的N-末端和C-末端
多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法），C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氫化鋰法）。
6 多肽鏈斷裂成多個肽段。可採用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，並將其分離開來。
7 測定每個肽段的氨基酸順序
8 確定肽段在多肽鏈中的次序。
利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。
9 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置
一般採用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理後，將可能含有二硫鍵的肽段進行組成及順序分析，然後同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。