放射免疫化學分析方法

A. 免疫分析方法有哪些

（1）放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）。RIA技術是使用以放射性同位素（如125I、32P、3H等）作標記的抗原或抗體，用γ－射線探測儀或液體閃爍計數器測定γ－射線或β－射線的放射性強度，來測定抗體或抗原量的技術。它包括以標記抗原為特點的放射免疫分析和以標記抗體為特點的免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）。前者以液相競爭結合法居多，既測大分子抗原又測小分子抗原；後者以固相法測大分子抗原為主。

RIA在早期建立的農葯免疫分析方法中佔了很大比重，建立了狄氏劑、艾氏劑、2，4－D和2，4，5－T、對硫磷和百草枯等農葯的放射免疫分析法。盡管該方法靈敏度非常敏銳（RIA通常為10-9g、10-12g，甚至10-15g），應用范圍廣，但進行RIA需使用昂貴的計數器，也存在放射線輻射和污染等問題，因此在農葯殘留檢測領域的應用和發展受到了一定的限制，並逐步為其他免疫分析方法所取代。

（2）酶免疫分析法（enzymeimmunoassay，EIA）。EIA是繼RIA之後發展起來的一項免疫分析技術。其檢測原理與放射免疫法類似，但所用的標記物為酶，它將抗原、抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化作用有機結合起來，通過測定結合於固相的酶的活力來測定被測定物的量。用做標記物的酶有辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）和鹼性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）、葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GO）、脲酶（urease）等。酶標記反應的固相支持物有聚苯乙烯塑料管、膜等。目前大多數採用96孔酶標板（MTP）作為固相支持物。這種板的檢測容量大，樣本數量多，只需有台簡單的酶標儀就可得出准確的檢測數據。也有學者採用磁珠作為固相材料進行EIA研究，其原理是將高分子材料（聚苯乙烯、聚氯乙烯等）包裹到金屬小顆粒（Fe2O3，Fe3O4）外面，再通過化學方法鍵合上氨基（－NH2）、羧基（－COOH）、羥基（－OH）等活性基團，再與抗體或抗原耦聯，製成免疫性微珠。該方法的優點是微珠比表面積大，吸附能力強，能懸浮在液相中快速均勻的捕獲樣品中的待測物，通過外加磁場後能夠實現微珠與樣品液的快速分離，從而減少檢測時間、提高檢測靈敏度。

由於酶標試劑制備容易、穩定、價廉，酶免疫分析的靈敏度接近放射免疫技術，故近年來EIA技術發展很快，已開發了多種EIA方法。其中酶聯免疫法（，ELISA）是目前農葯殘留檢測中應用最廣泛的酶免疫分析技術。

（3）熒光免疫分析法（fluorescenceimmunoassay，FIA）。FIA檢測的基本原理是將抗原抗體的高度特異性與熒光的敏感可測性有機地結合，以熒光物質作為示蹤劑標記抗體、抗原或半抗原分子，制備高質量的特異性熒光試劑。當抗原抗體結合物中的熒光物質受到紫外光或藍光照射時，能夠吸收光能進入激發態。當其從激發態回復基態時，能以電磁輻射形式放射出所吸收的光能，產生熒光。繪制農葯濃度－熒光強度曲線，可以定性、定量檢測樣品中的農葯殘留量。

適用於抗體、抗原或半抗原分子標記的熒光素須符合要求：①應具有能與蛋白質分子形成穩定共價鍵的化學基團，或易轉變成這類反應形式而不破壞其熒光結構；②標記後，熒光素與抗體或抗原各自的化學結構和性質均不發生改變；③熒光效率高，與蛋白質結合的需要量很少；④熒光素與蛋白質結合的過程簡單、快速，游離的熒光素及其降解產物容易除去；⑤結合物在一般儲存條件下性能穩定，可保存使用較長時間。

（4）化學發光免疫分析法（luminescentimmunoassay，LCIA）。LCIA又可分為化學發光免疫測定（chemiluminescentimmunoassay，CLCIA）和生物發光免疫測定（bio-luminescentImmunoassay，BLCIA）。

1976年，Shroeder首先用生物素（B）－親和素（A）系統建立了均相化學發光免疫測定技術，爾後Halman和Velan又將其引伸到非均相體系，現已滲入到生物學研究的各個領域。其原理是以發光指示抗原與抗體的結合，當發游標記物與相應的抗體或抗原結合後，底物與酶作用，或與發光劑產生氧化還原反應，或使熒光物質（例如紅熒烯等）激發，釋放光能。最後用光度計測定其發光強度，進行定量分析。常用發游標記物有辣根過氧化物酶（HRP）、魯米諾（luminol）、異魯米諾（isoluminol）、咯粉鹼（lophine）、光澤精（lucigen）、雙（2、4、6－三氯苯）草酸酯、聯苯三酚和6[N-（4－二氨基丁基）－N－乙基]－氨基-2，3－二氫吩嗪-1，4－二酮（ABEI）等。用上述發游標記物標記的抗體（或抗原）在一定的pH緩沖溶液中與相應的抗原（或抗體）結合時，在協同因子（例如H2O2等）的作用下發光，其發光強度與被測物的濃度成正比，故可以用於定量分析。

發光免疫測定具有特異性強、靈敏度高（檢測限量達10-15mol/L）、快速（1～3h）、發光材料易得等優點。但其發光過程和強度常受到發光物質本身的化學結構、介質的pH、協同發光物質和金屬離子雜質等影響。

（5）金免疫層析分析法（goldimmuno-chromatographyassay，GICA）。GICA檢測原理是將配體（抗體或抗原）以線狀包被固化於硝酸纖維素膜等微孔薄膜上，膠體金標記另以配體或其他物質並以干態固定在吸水材料上，通過毛細作用，使樣品溶液在層析條上泳動，當泳動至膠體金標記物處時，如樣品中含有待檢受體，則發生第一步高度特異性的免疫反應，形成的免疫復合物繼續泳動至線狀包被區時，發生第二步高度特異性的免疫反應，形成的免疫復合物被截留在包被的線狀區，通過標記的膠體金而顯紅色條帶（檢測帶），而游離的標記物則越過檢測帶，與結合的標記物自動分離。通過檢測帶上顏色的有無或色澤深淺來實現定性或定量測定2。

2金標試紙條檢測

GICA法具有快速（5～20min）、廉價、結果明確、無需復雜操作技巧和特殊設備、攜帶方便等優點。但相對於其他免疫分析方法，該方法檢測靈敏度稍低，主要適合現場快速定性或半定量測定。目前該方法已被應用於醫學和生物學等眾多研究領域，尤其在發達國家已經得到了廣泛的應用。

（6）免疫分析與儀器分析技術的聯用技術。使用單一的IA技術進行農葯殘留分析獲得的信息量少，而理化分析方法的選擇性又比較差。Kramer等人將免疫分析法和液相色譜法（LC）聯合起來使用，從而簡化了分析方法，提高了檢測效率。LC-IA的聯用，將LC的高分離能力和IA的高靈敏性和高特異性融為一體。該分析法尤其適合多組分殘留分析和微量分析。免疫分析與氣相色譜/質譜（GC/MS）的聯用可減少結構相似的農葯或代謝產物分析中的交叉反應，以降低假陽性。

B. 放射免疫分析簡介

目錄

• 1 拼音
• 2 英文參考
• 3 概述
• 4 放射免疫分析的基本原理
• 4.1 標記物
• 4.2 標記方法
• 4.3 標記物的鑒定
• 4.4 抗血清的檢定
• 5 放射免疫分析的測定方法
• 5.1 抗原抗體反應
• 5.2 B、F分離技術
• 5.3 放射性強度的測定
• 6 放射免疫分析在醫學檢驗中的應用

1 拼音

fàng shè miǎn yì fēn xī

2 英文參考

radioimmunoassay，RIA

3 概述

放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是以放射性核素為標記物的標記免疫分析法，用於定量測定受檢標本中的抗原。最初建立的方法模式是以核素標記的抗原與受檢標本中抗原競爭的測定模式，為區別於前者，稱為免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）。兩種方法均在醫學檢驗中得到了廣泛應用。

放射免疫分析是由Yalow和Berson於1960年創建的標記免疫分析技術。由於標記物放射性核素的檢測靈敏性，本法的靈敏度高達ng甚至pg水平。簡森基測定的准確性良好，ng量的回收率接近100％。本法特別適用於微量蛋白質、激素和多肽的定量測定。

4 放射免疫分析的基本原理

放射免疫分析的基本原理是標記抗原（Ag*）和非標記抗原（Ag）對特異性抗體（Ab）的競爭結合反應。它的反應式為：

在這一反應系統中，作為試劑的標記抗原和抗體的量是固定的。抗體春局的量一般取用能結合40％～50％的標記抗原，而受檢標本中的非標記抗原是變化的。根據標本中抗原量的不同，得到不同的反應結果。

假設受檢標本中不含抗原時的反應條件為：

4（Ag*）＋2（Ab）→2（Ag*Ab）＋2（Ag*）（2）

在標本中存在抗原時，舉例如下：

4（Ag*）＋4（Ag）＋（2Ab）→

1（Ag*Ab）＋3（Ag*）＋1（AgAb）＋3（Ag）（3）

當標記抗原、非標記抗原和特異性抗體三者同時存在於一個反應系統時，由於標記抗原和非標記抗原對特異性抗體具有相同的結合力，因此兩者相互競爭結合特異性抗體。由於標記抗原與特異性抗體的量是固定的，故標記抗原抗體復合物形成的量就隨著非標記抗原的量而改變。非標記抗原量增加，相應地結合較多的抗體，從而抑制標記抗原對抗體的結合，使標記抗原抗體復合物相應減少，游離的標記抗原相應增加，亦即抗原抗體攔謹復合物中的放射性強度與受檢標本中抗原的濃度呈反比（圖161）。若將抗原抗體復合物與游離標記抗原分開，分別測定其放射性強度，就可算性結合態的標記抗原（B）與游離態的標記抗原（F）的比值（B/F），或算出其結合率[B/（B＋F）]，這與標本中的抗量呈函數關系。用一系列不同劑量的標准抗原進行反應，計算相應的B/F，可以繪制出一條劑量反應曲線（圖162）。受檢標本在同樣條件下進行測定，計算B/F值，即可在劑量反應曲線上查出標本中抗原的含量。

圖161 放射免疫分析原理示意圖

圖162 劑量反應曲線

4.1 （一）標記物

標記用的核素有放射γ射線和β射線兩大類。前者主要為131I、125I、57Cr和60Co；後者有14C、3H和32P。放射性核素的選擇首先考慮比活性。例如125I比活性的理論值是64.38×104GBq/g（1.74×104Ci/g），有較長半衰期的14C最大比活性是166.5GBq/g（4.5Ci/g）。兩者相比，1mol125I或14C結合到抗原上，125I的敏感度約比14C大3900倍。又因為125I有合適的半衰期，低能量的γ射線易於標記，因而125I是目前常用的RIA標記物。

4.2 （二）標記方法

標記125I的方法可分兩大類，即直接標記法和間接標記法。

直接標記法是將125I直接結合於蛋白質側鏈殘基的酪氨酸上。此法優點是操作簡便，為125I和蛋白質的單一步驟的結合反應，它能使較多的125I結合在蛋白質上，故標記物具有高度比放射性。但此法只能用於標記含酪氨酸的化合物。此外，含酪氨酸的殘基如具有蛋白質的特異性和生物活性，則該活性易因標記而受損傷。

間接標記法（又稱連接法）是以125I標記在載體上，純化後再與蛋白質結合。由於操作較復雜，標記蛋白質的比放射性顯著低於直接法。但此法可標記缺乏酪氨酸的肽類及某些蛋白質。如直接法標記引起蛋白質酪氨酸結構改變而損傷其免疫及生物活性時，也可採用間接法。它的標記反應較為溫和，可以避免因蛋白質直接加入125I液引起的生物活性的喪失。下面介紹最常用的氯胺T直接標記法。

氯胺T是對甲苯磺基醯胺的N氯衍生物的鈉鹽，在水溶液中逐漸分解形成次氯酸，是一種氧化劑。在偏堿溶液中（pH7.5），氯胺T將125I的I－氧化為I+，I+取代蛋白質酪氨酸苯環的氫，形成二碘酪氨酸。反應式如下：

放射性碘標記率的高低與抗原（蛋白質或多肽）分子中酪氨酸的含量及分子中酪氨酸的暴露程度有關，當分子中含有較多的酪氨酸，又暴露在外時，則標記率就高。

標記方法：將純化抗原和125I加入小試管底部，然後將新鮮配製的氯胺T快速沖入，混勻振盪數十秒～2min後加入偏重亞硫酸鈉終止反應。再加入KI溶液稀釋。然後在葡聚糖G柱上分離，逐管收集。分別用井型閃爍計數器測定放射性強度（脈沖數/min,cpm），前部為標記抗原峰，後部為游離125I峰。在標記抗原峰試管內加等量1％白蛋白作穩定劑，此即為標記抗原液。

4.3 （三）標記物的鑒定

1．放射性游離碘的含量用三氯醋酸（預先在受鑒定樣品中加入牛血清白蛋白）將所有蛋白質沉澱，分別測定沉澱物和上清液的cpm值。一般要求游離碘在總放射性碘的5％以下。標記抗原在貯存過久後，會出現標記物的脫碘，如游離碘超過5％則應重新純化去除這部分游離碘。

2．免疫活性標記時總有部分抗原活性損失，但應盡量避免。檢查方法是用小量的標記抗原加過量的抗體，反應後分離B和F，分別測定放射性，算出BT％。此值應在80％以上，該值越大，表示抗原損傷越少。

3．放射性比度標記抗原必須有足夠的放射性比度。比度或比放射性是指單位重量抗原的放射強度。標記抗原的比放射性用mCi/mg（或mCi/mmol）表示。比度越高，測定越敏感。標記抗原的比度計算是根據放射性碘的利用率（或標記率）：

如：5μghGH用2mCiNa125I進行標記，標記率為40％，則

4.4 （四）抗血清的檢定

含有特異性抗體的抗血清是放射免疫分析的主要試劑，常以抗原免疫小動物誘發產生多克隆抗體而得。抗血清的質量直接影響分析的靈敏度和特異性。抗血清質量的指標主要有親和常數、交叉反應率和滴度。

1．親和常數親和常數（affinityconstant）常用K值表示。它反映抗體與相應抗原的結合能力。K值的單位為mol/L，即表示1mol抗體稀釋至若干L溶液中時，與相應的抗原結合率達到50％。抗血清K值越大，放射免疫分析的靈敏度、精密和准確度越佳。抗血清的K值達到109～1012mol/L才適合用於放射免疫分析。

2．交叉反應率放射免疫分析測定的物質有些具有極為類似的結構，例如甲狀腺素的T3、T4，雌激素中的雌二醇、雌三醇等。針對一種抗原的抗血清往往對於其類似物會發生交叉反應。因此交叉反應率反映抗血清的特異性，交叉反應率過大將影響分析方法的准確性。交叉反應率的測定方法為用與抗血清相應抗原及其類似物用同法進行測定，觀察置換零標准管50％時的量。以T3抗血清為例，置換零標准50％T3為1ng，其類似物T4則需200ng，則其交叉反應率為：1/200＝0.5％。

3．滴度滴度系指將血清稀釋時能與抗原發生反應的最高稀釋度。它反映抗血清中有效抗體的濃度。在放射免疫分析中滴度為在無受檢抗原存在時，結合50％標記抗原時抗血清的稀釋度。

5 放射免疫分析的測定方法

用放射免疫分析進行測定時分三個步驟，即抗原抗體的競爭抑制反應、B和F的分離及放射性的測量。

5.1 （一）抗原抗體反應

將抗原（標准品和受檢標本）、標記抗原和抗血清按順序定量加入小試管中，在一定的溫度下進行反應一定時間，使競爭抑制反應達到平衡。不同質量的抗體和不同含量的抗原對溫育的溫度和時間有不同的要求。如受檢標本抗原含量較高，抗血清的親和常數較大，可選擇較高的溫度（15～37℃）進行較短時間的溫育，反之應在低溫（4℃）作較長時間的溫育，形成的抗原抗體復合物較為牢固。

5.2 （二）B、F分離技術

在RIA反應中，標記抗原和特異性抗體的含量極微，形成的標記抗原抗體復合物（B）不能自行沉澱，因此需用一種合適的沉澱劑使它徹底沉澱，以完成與游離標記抗原（F）的分離。另外對小分子量的抗原也可採取吸附法使B與F分離。

1．第二抗體沉澱法這是RIA中最常用的一種沉澱方法。將產生特異性抗體（第一抗體）的動物（例如兔）的IgG免疫另一種動物（例如羊），製得羊抗兔IgG血清（第二抗體）。由於在本反應系統中採用第一、第二兩種抗體，故稱為雙抗體法。在抗原與特異性抗體反應後加入第二抗體，形成由抗原－第一抗體－第二抗體組成的雙抗體復合物。但因第一抗體濃度甚低，其復合物亦極少，無法進行離心分離，為此在分離時加入一定量的與一抗同種動物的血清或IgG，使之與第二抗體形成可見的沉澱物，與上述抗原的雙抗體復合物形成共沉澱。經離心即可使含有結合態抗原（B）的沉澱物沉澱，與上清液中的游離標記抗原（F）分離。

將第二抗體結合在顆粒狀的固相載體之上即成為固相第二抗體。利用固相第二抗體分離B、F，操作簡便、快速。

2．聚乙二醇（PEG）沉澱法最近各種RIA反應系統逐漸採用了PEG溶液代替第二抗體作沉澱劑。PEG沉澱劑的主要優點是制備方便，沉澱完全。缺點是非常特異性結合率比用第二抗體為高，且溫度高於30℃時沉澱物容易復溶。

3．PR試劑法是一種將雙抗體與PEG二法相結合的方法。此法保持了兩者的優點，節省了兩者的用量，而且分離快速、簡便。

4．活性炭吸附法小分子游離抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子復合物留在溶液中。如在活性炭表面塗上一層葡聚糖，使它表面具有一定孔徑的網眼，效果更好。在抗原與特異性抗體反應後，加入葡聚糖－活性炭。放置5～10min，使游離抗原吸附在活性炭顆粒上，離心使顆粒沉澱，上清液中含有結合的標記抗原。此法適用於測定類固醇激素，強心糖苷和各種葯物，因為它們是相對非極性的，又比抗原抗體復合物小，易被活性炭吸附。

5.3 （三）放射性強度的測定

B、F分離後，即可進行放射性強度測定。測量儀器有兩類，液體閃爍計數儀（β射線，如3H、32P、14C等）和晶體閃爍計數儀（β射線，如125、131I、57Cr等）。

計數單位是探測器輸出的電脈沖數，單位為cpm（計數/分），也可用cps（計數/秒）表示。如果知道這個測量系統的效率，還可算出放射源的強度，即dpm（衰變/分）或dps（衰變/秒）。

每次測定均需作標准曲線圖，以標准抗原的不同濃度為橫坐標，以在測定中得到的相應放射性強度為縱坐標作圖（圖163）。放射性強度可任選B或F，亦可用計算值B/（B＋F）、B/F和B/B0。標本應作雙份測定，取其平均值，在製作的標准曲線圖上查出相應的受檢抗原濃度。

圖163 放射免疫分析標准曲線示例

6 放射免疫分析在醫學檢驗中的應用

C. 免疫檢測方法

免疫檢測方法大全2017

免疫學檢測技術的用途非常廣泛，它們可用於有關免疫疾病的診斷、療效評價及發病機制的研究。如對傳染病、免疫增殖性疾病、免疫缺損病、超敏反應、自身免疫病、移植排斥反應腫瘤的免疫學檢測，對診斷、治療均有很大幫助。此外在醫學生物學研究中對抗原性物質或細胞的定性、定量檢查不僅推動了對各種免疫學現象的研究，而且擴大免疫學與醫學生物許多領域的聯系。本章僅介紹常用免疫學檢測方法的原理，簡要過程和實用意義。下面是我為大家帶來的關於免疫學檢測法的知識，歡迎閱讀。

第一節抗原或抗體的檢測

一、檢測的原理

藉助抗原和抗體在體外特異結合後出現的各種現象，對樣品中的抗原或抗體進行定性、定量、定位的檢測。

1.抗原與抗體的親和力(affinity)抗原抗體的結合就像酶與底物的結合，激素與其受體的結合一樣不是化學的反應，而是非共價鍵的可逆的結合。抗原決定簇和抗體分子可變區互補構型，造成兩分子間有較強的親和力。空間構型互補程度不同，抗原和抗體分子之間結合力強弱也不同。互補程度高，則親和力強。此外，反應溫度、酸鹼度和離子濃度對抗原和抗體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重要的影響，抗體與抗原決定簇之間的結合力大小可用親合力來表示。高親合力的抗體與抗原的結合力強，即使抗原濃度很低時也有較多的抗體結合抗原形成免疫復合物。

2.抗原或抗體外檢測原理根據抗原抗體結合形成免疫復合物的性狀與活性特點，對標本中的抗原或抗體進行定性、定位或定量的檢測。定性和定位檢測比較簡單，即用已知的抗體和待檢樣品混合，經過一段時間，若有免疫復合物形成的現象發生，就說明待檢樣品中有相應的抗原存在。若無預期的現象發生，則說明樣品中無相應的抗原存在。同理也可用已知的抗原檢測樣品中是否有相應抗體。

對抗原或抗體進行定量檢測時，以反應中加入抗原和抗體的濃度與形成免疫復物的濃度呈函數關系。

(1)根據免疫復合物產生的多少來推算樣品中抗原(或抗體)的含量：在一定的反應條件下，加入的已知抗體(或抗原)的濃度一定，反應產生的免疫復合物多少與待檢樣品中含有相應抗原(或抗體)量成正比。也就是抗體濃度一定時，免疫復合物越多則樣品中的抗原量也越多。可用實驗性標准曲線推算出樣品中抗原(或抗體)的含量。如免疫單向擴散試驗、免疫比濁試驗和酶聯免疫檢測等都屬於這類方法。

(2)抗原或抗體效價滴定的原理：當抗原抗體復合物形成多少不能反應抗原抗體反應強弱時，就不能以檢測反應強度來對抗原或抗體進行定量。在實際工作中，把濃度低的反應成分(抗原或抗體)的濃度固定，把濃度高的另一種反應成分作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫3隻家兔，比較3隻家兔產生抗體的多少，即滴定3隻兔血清抗體效價，可用雙向瓊脂擴散法來滴定，例如將抗體濃度固定，將抗原作不同的稀釋度，分別將抗原或抗體滴入瓊脂的相應小孔中，觀察免疫兔血清與不同稀釋度的抗原出現明顯沉澱淺的抗原稀釋度(如甲兔的抗體效價為1/2000，而丙免的是1/8000則可比較出後者比前者產生抗體的效價要高)。也就是表示效價的稀釋度越高，樣品中所含待檢成分越多。因人血清(抗原)和抗體(免疫兔血清)相比，濃度高，故應稀釋抗原。

二、抗原或抗體檢測的實用意義

1.抗體檢測的意義檢測抗體可用於評價人和動物免疫功能的指標。抗體用於臨床治療或實驗研究時也需做純度分析和定量測定。臨床上檢測病人的抗病原生物的抗體、抗過敏原的抗體、抗HLA抗原的抗體、血型抗體及各種自身抗體，對有關疾病的診斷有重要意義。

2.抗原檢測的意義可做為抗原進行檢測的物質可分為以下四類：

(1)各種微生物及其大分子產物：用於傳染病診斷、微生物的分類及鑒定以及對菌苗、疫苗的研究。

(2)生物體內各種大分子物質：包括各種血清蛋白(如各類免疫球蛋白、補體的各種成分)、可溶性血型物質、多肽類激素、細胞因子及癌胚抗原等均可做為抗原進行檢測。在對這些成分的生物學作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意義。

(3)人和動物細胞的表面分子：包括細胞表面各種分化抗原(如CD抗原)、同種異型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相關抗原和腫瘤相關性情抗原等。檢測這些抗原對各種細胞的分類、分化過程及功能研究、對各種與免疫有關的疾病的診斷及發病機制的研究，均有重要意義。

(4)各種半抗原物質：某些葯物、激素和炎症介質等屬於小分子的半抗原，可以分別將它們偶聯到大分子的載體上，組成人工結合的完全抗原。用其免疫動物，制備出各種半抗原的抗體，應用於各種半抗原物質的檢測，例如對某些病人在服用葯物後進行血中葯物濃度的監測。對運動員進行服用違禁葯品的檢測，都是應用半抗原檢測的方法。

三、抗原或抗體檢測的方法

由於各種檢測方法中所用的抗原性狀不同，出現結果的現象也不同。最廣泛應用方法有下述幾種：

(一)沉澱反應

可溶性抗原與抗體結合，在兩者比例合適時，可形成較大的不溶性免疫復合物。在反應體系中出現不透明的沉澱物，這種抗原抗體反應稱為沉澱反應(precipitation neaction)。

1.環狀沉澱試驗先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小於0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊於上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復合物沉澱環，故名為環狀沉澱試驗(ring precipitationtest),此法簡便易行，需用材料較多是其缺點。

2.單向免疫擴散試驗單向免疫擴散試驗(single immunodiffusion)是在凝膠中進行的沉澱反應。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注於玻片上，製成含有抗體的瓊脂板，在適當位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復合物。當復合物體積增加到一定程度時停止擴散，出現以小孔為中心的圓形沉澱圈，沉澱圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關。本方法簡便，易於觀察結果，可測定抗原的靈敏度(最低濃度)約為10～20μg/ml，常用於定量測定人或動物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點是需1～2天才能看結果

3.免疫比濁法 當抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不見的小免疫復合物，它可使通過液體的光束發生散射，隨著加入抗原增多，形成的免疫復合物也增多，光散射現象也相應加強。免疫比濁法(immunonephelomytry)就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，經過一段時間，用光散射濁度計(nephelometry)測量反應液體的濁度，來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便，可取代單向擴散法定量測定免疫球蛋白的濃度。

4，雙向免疫擴散試驗 雙免疫擴散試驗(double immunodiffusion)是在瓊脂板上按一定距離打數個小孔，在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現2～3條沉澱線，本法常用於抗原或抗體的定性或定量檢測，或用於兩種抗原材料的抗原相關性分析。

5.對流免疫電泳對流電泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快速的檢測方法，即在電場作用下的雙向免疫擴散。將瓊脂板放入電泳槽內，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，於負極側的孔內加入抗原，於正極側的孔內加入抗體，通電後，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復合物的沉澱線。只需1小時左右即可觀察結果。

6.免疫電泳 免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個步驟，即先進行電泳，再進行瓊脂擴散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然後在適當的位置上沿電泳方向挖一直線形槽，於槽內加入含有針對各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應抗體進行雙向免疫擴散，可形成多答卷沉澱線。常用此法進行血清的蛋白種類分析。對於免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義

7.免疫印跡法免疫印跡法(immunoblotting)又稱為Western印跡法，用於AIDS的血清抗體檢測。第一步，為電泳分離HIV抗原，在電場中根據分子量大小不同病毒抗原各成分散開。第二步，將電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維膜上(電印跡)，然後將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕於病人血清中。如果病人血清中含有與一種或幾種抗原相對應的抗體的話，則在該抗原印跡部位形成免疫復合物沉澱。在洗去未沉澱的抗原和抗體後，在膜上加標記的抗人免疫球蛋白的抗體，此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復合物發生反應，最後加入顯色底物(如果抗人Ig是用酶標記的)或做放射自顯影(抗人Ig用125Ⅰ標記)以顯示結果

第一步：經電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離;

第二步：將已分離的抗原經電印跡轉移到硝酸纖維膜上;

第三步：將待檢病人血清加入覆蓋於硝酸纖維膜上;

第四步：加入標記的第二抗體使之覆蓋膜上;

第五步：加入顯色底物(或放射自顯影)顯現第二抗體

(二)凝集反應

細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆粒抗原，當與相應抗體結合，抗原與抗體結合形成凝集團塊，即稱為凝集反應(agglutination)。

1.直接凝集 直接凝集(direct agglutination)是將細菌或紅細胞與相應抗體結合產生的細菌凝集或紅細胞凝集現象。可用於傳染病診斷如肥達氏反應(Widal reaction)診斷傷寒病。或利用血細胞凝集現象檢查血型。

2.間接凝集 間接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳膠顆粒或紅細胞表面，與相應抗體混合出現的凝集現象。如用γ球蛋白包乳膠顆粒檢測類風濕關節炎病人血清中的類風濕因子，用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用於檢測甲狀腺球蛋的抗體。也可以將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標本中的抗原，如細菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆粒，一旦與含有相應抗原的腦脊液混合，便可發生凝集，可進行快速診斷。故凝集反應即可測定抗原，也可測抗體，方法簡便、敏感。

3.抗球蛋白試驗 抗球蛋白試驗(antiglobulin test,coombs test)的原理為間接凝集試驗。例如應用於診斷自身免疫溶血性貧血症時，Rh+紅細胞與抗Rh血清間的反應。因抗Rh抗體是IgG只有兩個結合價，分子較小(不如IgM結合價多，分子大)很難直接引起Rh+紅細胞凝集。如果加入抗IgG的抗體，就可幫助抗Rh的IgG的抗體凝集紅細胞。也就是經抗Ig的作用提高凝集反應的'靈敏度。

(三)補體參與抗原抗體反應

這一類反應主要包括溶血反應(hemolytic assay)、補體介導的細胞毒試驗(complement mediated cytotoxicuty test)及補體結合試驗(complement fixation test)。

1.溶血反應 抗體與紅細胞表面抗原相遇，形成紅細胞-抗體復合物即可使加入反應中的補體活化，導致紅細胞溶解，此方法可用於紅細胞的各種抗原或相應抗體的檢測，此法比凝集反應敏感。溶血反應也是用於抗體分泌細胞即空斑形成細胞(PFC)檢測的原理。

2.補體介導的細胞毒試驗各種有核細胞與針對其表面抗原的抗體相遇，所形成的免疫復合物能活化反應中的補體，引起細胞膜穿孔，在一定時間內，細胞仍能維持一定的形態不破碎，加入水溶性染如伊紅Y(eosin Y)或台盼藍(trypan blue)後，染料即可進入被活化補體穿孔的細胞，不帶相應抗原細胞膜保持完整的活細胞不著色。此方法可用於帶各種抗原的細胞的檢測，如進行細胞MHC抗原的鑒定，和進行淋巴細胞中T細胞總數或其亞類的計數。在一些免疫學實驗中也可用這種方法，根據需要特異地消除帶某種抗原的細胞。

3.補體結合試驗當抗原(可溶性或顆粒性)與相應抗體結合，由於濃度低不出現可見反應時，應用補體結合試驗可檢出此抗原抗體反應，它比凝集反應或沉澱反應靈敏度高。本法包括兩個抗原抗體系統。一為檢測系統由待檢樣品與已知抗原(或抗體)組成;另一為指示系統，由綿羊紅細胞(SRBC)和抗SRBC組成。另加入作為補體的新鮮豚鼠血清。試驗時試管中先加入檢測系統和補體，混合經37℃30分鍾使抗原、抗體、補體形成復合物，再加入指示系統，如出現溶血現象，說明檢測系統中沒有相對應的抗原抗體，補體是游離的指示系統的SRBC和抗體結合而出現溶血，即為反應陰性。如不出現溶血，表明檢測系統中有抗原抗體復合物並結合補體，則指示系統無多餘的補體作用而沒有溶血現象，即為陽性。

在敏感的抗原、抗體檢測方法(如酶標方法)出現之前補體結合試驗曾廣泛用於檢測各種細菌、病毒或螺旋體(如梅毒)的抗原或抗體，由於本試驗影響因素多，結果不穩定現已被新檢測方法所代替。

四、用標記抗體或抗原進行的抗原、抗體反應

用熒光素、同位素或酶標記抗體或抗原，用於抗原或抗體檢測是目前廣泛應用的敏感、可靠的方法。上述三種常用的標記物與抗原或抗體化學連接之後不改變後者的免疫特性。本方法可用於定性、定量或定位檢測。

1.免疫熒光技術免疫熒光技術(immunofluorescence techni)是用化學方法使熒光素標記的抗體(或抗原)與組織或細胞中的相應抗原(或抗體)結合，進行定性定位檢查抗原或抗體的方法。

(1)直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細胞懸液，細胞塗片或組織切片上進行染色，經抗原抗體反應後，洗去未結合的熒光抗體，將待檢標本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應抗原存在，此法可用於病毒感染細胞、帶某種特異抗原的細胞(如T細胞和B細胞)或病原菌的檢查，也可用於組織中沉著的免疫復合物的檢查。本法的缺點是檢查多種抗原，就需分別制備相應的多種標記抗體。

(2)間接熒光法：可克服直接法需制備多種熒光抗體的復雜操作。將組織或細胞上的抗原直接與相應抗體(不標記熒光)結合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異結合的熒游標記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒游標記的第二抗體，觀察結果與直接法相同。間接法比直接法敏感性高，如果用於檢查抗原的第一抗體是人或動物的只需制備一種抗人或動物的免疫球蛋白熒光抗體

免疫熒光技術在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查抗原或抗體，如查出IgM抗體，可做為近期接觸抗原的標志，所以使用熒游標記抗IgM可診斷近期感染。除微生物學方面的應用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細胞的亞類。使用流式細胞儀(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自動檢測細胞的大小、熒光強度。針對細胞表面不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，如用異硫氰熒光素(FITC)發黃綠熒光，用羅丹明(TMRITC)發紅色熒光。由於熒光顏色不同標記兩種不同的抗體，對同一細胞進行雙標記染色。對淋巴細胞亞類鑒定起著巨大推動作用。應用間接熒光法也用於自身免疫病的抗核抗體檢查。

2.放射免疫分析法 放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)應用競爭性結合的原理，應作放射性同素標記抗原(或抗體)與相應抗體(或抗原)結合，通過測定抗原抗體結合物的放射活性判斷結果，本方法可進行超微量分析，敏感性高，可用於測定抗原、抗體、抗原抗體復合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。

放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種：

(1)液相法：將待檢標本(例如含胰島素抗原)與定時的同位素標記的胰島素(抗原)和定時的抗胰島素抗體混合，經一定作用時間後，分離收集抗原抗體復合物及游離的抗原，測定這兩部分的放射活性，計算結合率。在反應系統中，待檢標本的胰島素抗原與同位素標記的胰島素競爭奪戰性與胰島素抗體結合。非標記的抗原越多，標記抗原與抗體形成的復合物越少。非標記抗原含量與標記抗原抗體復合物的量呈一定的函數關系。預先用標準的非標記抗原作成標准曲線後，即可查出待檢標本中胰島素的含量

(2)固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然後加待檢標本，最後加標記抗體。測定固相載體的放射活性，常用的固相載體有溴化氰(CNBr)海豹化的紙片或聚苯乙烯小管

放射免疫分析法應用范圍廣泛，包括多種激素(胰島素、生長激素、甲狀腺素等)維生素、葯物、IgE等。

3.酶聯免疫分析法 酶聯免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)是當前應用最廣泛的免疫檢測方法。本法將抗原抗體反應的特異性與酶對底物高效催化作用結合起來，根據酶作用底物後顯色，以顏色變化判斷試驗結果，可經酶標測定儀作定量分析，敏感度可達ng水平。常用於標記的酶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酶(alkaline phosphatase)等。它們與抗體結合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩定性，製成酶標抗體可保存較長時間。目前常用的方法有酶標免疫組化法和酶聯免疫吸附法。前者測定細胞表面抗原或組織內的抗原;後者主要測定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。

(1)酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是與上述固相RIA相似的原理，將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行政區。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。

(2)夾心法(sandwich assay):將已知的特異抗體包裝在固相載體(塑料板凹孔或紙片上)，加入待檢標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結合，洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結合的酶標抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。

間接法(indirecr ELISA)常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標本(可能含有相應抗體)，再加入酶標抗Ig的抗全(即第二抗體)，經加底物顯色後，根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。

(3)BAS-ELISA：近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素(avidin)分子可以結合4個生物素分子(biotin)。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合，而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統(biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA)，它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統，同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。

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D. 放射免疫分析法的簡介

Radioimmunoassay RIA
利用同位素標記的與未標記的抗原同抗體發生競爭性抑制反應的放射性同位素體外微量分析方法。又稱競爭性飽和分析法。1960年美國化學家R.S.耶洛和S.A.貝爾森提出此法，耶洛因此於1977年獲得諾貝爾生理學或醫學獎。
耶洛1921年生於紐約。父母都是猶太人，她從小酷愛自然科學。在大學里，她熱衷於物理學，卻致力於醫學研究，她工作於紐約市布隆克斯區退伍軍人醫院，致力於「勝太荷爾蒙的放射免疫分析」。居里夫人自傳和核子物理學家美籍義大利人費米的講演，對她後來的事業產生了很大的影響。她渴望從事科學研究工作。然而，當時的美國，哪個大學也不同意將一筆物理學獎金給一個女人。她主動給一位傑出的化學家當非全日制秘書。由於工作出色，幾個月後，伊利諾依大學給了她一份獎學金，並給了她一個助理研究員的位置。從1941年到1945年，她把主要精力都用在三項活動上：教學、鑽研高深課題和准備核物理博士論文。她於1945年獲得博士學位。從1945年起，她邊授課，邊研究，邊著書立說，並在勃隆克斯醫院籌備和開發新的放射性同位素應用工作。
早在得獎的二十多年，耶洛便在一個偶然的機會里，發現豬胰臟的胰島素可用來治療糖尿病，可以使病人產生抗體。這種發現與當時的治療理論不太合適。因為治療葯物能引起抗體是不可思議的事，因此其發現並不為當時的人所接受。然而，這個發現卻引導近代內分泌學的研究進入了新的境界，更由此而推展，使得已往不易測定的身體中的物質得以測定。這個方法就是放射免疫測定法，又叫放射免疫測定法（radioimmunoassav，簡稱RIA）。80年代初，應用此法測定的生物活性物質已達300種以上。