熒光法是什麼檢測方法

㈠ 熒光檢測方法

熒光檢測是一種自然發光反應，通過熒光素酶與 ATP進行反應，可檢測人體細胞、細菌、黴菌、食物殘渣，在15秒鍾內得到反應結果。光照度通過專用設備進行測量，並以數字形式予以表示，在1975年首先被應用到食品工業中，在1985年在化妝品製造業中得到應用。
熒光定量：採用國際主流的熒光定量PCR技術，迅速提升技術水平。
結果穩定：檢測結果CV值與進口全自動PCR儀接近，具有自檢功能，避免錯誤數據的輸出。
封閉操作：全部檢測過程均為閉管操作，於反應管處檢測熒光，有效防止污染，解決PCR技術中最棘手之難題。
准確定量：滿足臨床對量化的需求，定量盪圍寬，可涵蓋大部分病原微生物，自動曲線擬合。
靈敏度高：利用光譜信號靈敏性的優勢，有效提高檢測靈敏度。
安全：全程無毒檢測。
操作簡便：省去後處理的煩瑣過程。
直接列印：直接列印結果，無須記錄大量數據。
升級版：FS1000有與電腦連接的數傳輸口，可以連接電腦，根據用戶需要提供先進分析軟體，全面分析實驗數據。（電腦和列印機選配件）
故障率低：維護非常簡單。
節約資源：可利用現用PCR擴增儀，最大限度節約資源。

㈡ 熒光光度法原理

方法提要

水樣用高氯酸-硫酸-鉬酸鈉消化，再用鹽酸將硒(Ⅵ)還原為硒(Ⅳ)。在酸性條件下，硒(Ⅳ)與2，3-二氨基萘反應生成有綠色熒光的4，5-苯並苤硒腦，用環己烷萃取，在激發波長376nm，發射波長520nm下，進行熒光光度法測定。

本法適用於海水、天然水中總硒的測定，若試樣不經酸處理，可直接測定四價硒的含量。方法檢出限為0.2μg/L。

儀器和裝置

熒光分光光度計。

電動振盪器。

試劑

鹽酸。

高氯酸。

硫酸。

去硒硫酸量取200mLH₂SO₄在攪拌下，徐徐加入200mL水中，加30mLHBr，混勻，置沙浴上加熱至冒白煙。

氫溴酸。

氫氧化銨。

環己烷若有熒光雜質需重蒸餾提純，用過的環己烷重蒸餾後可再使用。

EDTA溶液(0.2mol/L)稱取37gEDTA二鈉鹽於250mL燒杯中，加適量水，加熱溶解，冷卻後稀釋至500mL。

鹽酸羥胺溶液(100g/L)稱取10gNH₂OH·HCl於100mL燒杯中，用水溶解後，並稀釋至100mL。

EDTA-鹽酸羥胺混合溶液量取100mL0.2mol/LEDTA、10mL100g/L鹽酸羥胺溶液，加水稀釋至1000mL。

2，3-二氨基萘(DAN)溶液(1g/L)稱取400mgDAN於500mL燒杯中，加400mL0.1mol/LHCl溶解，然後轉入1000mL錐形分液漏斗中(漏斗頸部塞有脫脂棉)，在振盪器上振盪15min使其全部溶解。加入80mL環己烷再振盪5min，靜置分層後，收集水相，棄去有機相，如此反復純化數次，直至有機相的熒光強度降到接近純環己烷的熒光強度為止。將純化後的DAN溶液貯存於棕色瓶中，加入環己烷使其覆蓋液面約1cm厚，置於冰箱中保存，有效期一個月。

高氯酸-硫酸-鉬酸鈉混合溶液稱取7.5g鉬酸鈉(Na₂MoO₄·7H₂O)溶於150mL水中，加入200mLHClO₄和150mL去硒H₂SO₄，混勻。貯存於500mL試劑瓶中。

硒標准儲備溶液ρ(Se)=0.40mg/mL稱取0.1405g二氧化硒(SeO₂，純度99.9%)於50mL燒杯中，用適量水溶解後，移入250mL容量瓶中，加0.1mol/LHCl至標線，混勻。

硒標准溶液ρ(Se)=0.100μg/mL用0.1mol/LHCl逐級稀釋硒標准儲備溶液配製。

甲酚紅指示液(0.4g/L)稱取40mg甲酚紅於100mL燒杯中，加少量水及2滴(1+1)NH₄OH溶解，加水至100mL。

校準曲線

取6個50mL燒杯，分別加入0.00mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL和4.00mL硒標准溶液，加水稀釋至約10mL，混勻。

加5mL混合酸溶液，在沙浴中加熱消化至冒濃白煙，至溶液變黃(約2h)。取下冷卻至室溫，溶液恢復為無色，用水釋至約10mL。加5mLHCl，將燒杯放在沙浴表面加熱至溶液變黃為止。取下冷卻至室溫。

將溶液移到50mL比色管中，用少量水洗凈燒杯，洗液並入比色管中。加5mLEDTA-鹽酸羥胺混合溶液，4～5滴(0.4g/L)甲酚紅指示液，用(1+1)NH₄OH或0.1mol/LHCl調節pH為1.5～2.0(粉橙色)，加3.0mLDAN溶液，搖勻，置沸水浴中加熱5min取下冷卻到室溫。將溶液移入60mL分液漏斗中，用少量水洗滌比色管，洗液並入分液漏斗中。加3.0mL環己烷，振搖4min，分層後棄去水相。

將環己烷層從分液漏鬥口到入1cm比色皿中，在熒光分光光度計上，以376nm為激發波長，520nm為發射波長，環己烷為參比，測定硒的熒光強度I_i。以熒光強度I_i-I₀(標准空白)為縱坐標，相應硒含量(μg)為橫坐標繪制校準曲線。

分析步驟

量取5.00～50.0mL海水樣，於50mL燒杯中加5mL混合酸溶液，在沙浴中加熱消化至冒濃白煙，至溶液變黃(約2h)。以下按制定校準曲線步驟測定熒光強度I_w。同時測定分析空白熒光強度I_b。

由I_w-I_b查校準曲線得硒量，海水樣硒濃度的計算參見式(78.30)。

注意事項

1)配製DAN溶液時應在暗處進行。

2)在沸水浴上加熱5min後，用冷水冷卻的時間控制在10min內。否則結果會稍偏低。

3)甲酚紅指示劑有兩個變色范圍，當pH2～3時由紅變黃，pH7.2～8.8時由黃變紅。本方法中調節pH為1.5～2.0時至粉橙色，pH<1.5為桃紅色。因此調pH時要注意顏色變化，必要時可用精密pH試劑確證。

4)玻璃器皿用HNO₃溶液浸洗2～3d，洗凈後使用。

5)試樣制備。海水樣品用玻璃或塑料采樣器採集，水樣應及時經0.45μm濾膜(濾膜預先在0.5mol/LHCl中浸泡12h，用純水沖洗至中性，密封待用)過濾，並用HNO₃酸化至pH<2，貯存於聚乙烯塑料瓶或硬質玻璃瓶中，再以聚乙烯薄膜袋包封樣品瓶。

6)水樣體積的校正。在量取測定水樣之前向水樣加入的試劑溶液超過1%體積時，按式(78.31)進行體積校正。

7)水樣中硒含量低時，可增加水樣體積至50mL，對測定無影響。

㈢ 分子熒光分光光度法

分子熒光分光光度法是根據物質的熒光譜線位置及其強度進行物質鑒定和含量測定的方法。

由於不同的物質其組成與結構不同，所吸收的紫外-可見光波長和發射光的波長也不同，同一種物質應具有相同的激發光譜和熒光光譜，將未知物的激發光譜和熒光光譜圖的形狀、位置與標准物質的光譜圖進行比較，即可對其進行定性分析。

熒光分光光度計是最常見的實驗儀器，主要用於對經光源激發後產生熒光的物質或經化學處理後產生熒光的物質成份分析。在檢測食品安全、自然環境污染等重要的人類課題上，發揮積極的作用。

熒光分光光度計是用於掃描液相熒游標記物所發出的熒光光譜的一種儀器，有濾光片熒光計、濾光片-單色器熒光計等，通常均由以下四個部分組成：激發光源、用於選擇激發光波長和熒光波長的單色器、樣品池及測量熒光的檢測器。