均四酸酐的液相色譜分析方法

⑴ 如何使用液相色譜

現在一般說的就是高效液相色譜（HPLC），原理如下文，但具體的操作就要看具體的儀器了，因為國內外的不同廠家生產的操作方案可能有所不同，而且你去面試要使用HPLC的話建議你最好先去找台能使用的熟悉下，畢竟這玩意的價格不是一般的。而有些普通的液相色譜就很簡單了，只要你看懂了原理就能進行操作，沒有什麼特別的難度。

液相色譜法簡介

氣相色譜不能由色譜圖直接給出未知物的定性結果，而必須由已知標准作對照定性。當無純物質對照時，定性鑒定就很困難，這時需藉助質譜、紅外和化學法等配合。另外大多數金屬鹽類和熱穩定性差的物質還不能分析。此缺點可高效液相色譜法來克服。在經典液相色譜的基礎上，引入了氣相色譜的理論與技術，在70年代初建立了高效液相色譜分析法（以HPLC表示）。在常壓下操作的液相色譜，分離一個樣品往往長達幾小時至幾十小時，因此工作效率很低。人們曾對這種經典液相色譜法試用了柱前加壓或柱後減壓的辦法來提高流速，以縮短分離時間，但是結果失敗了。根據液相色譜理論，因為隨著載液（流動相）流速的提高，板高則增大，所以柱效會顯著降低。隨著生產技術的提高，人們製成了細小（<10μm）而高效的填充物，從而使柱效大大提高。但是隨著填充物粒度的減小，柱壓降顯著增大，為了得到合理的載液流速，使用了高壓；輸液泵，使流速達到1～10mL/min。從而使分析一個多組分樣品只需幾分鍾到幾十分鍾時間。隨著高效固定相、高壓泵和高靈敏度檢測器以及電子技術和計算機技術的應用，70年代以業逐步實現了液相色譜分析的高效、高速、高靈敏和自動化操作。因此人們常稱它為高效液相色譜或現代液相色譜，以區別於經典液相色譜。高效液相色譜法的分類與經典液相色譜法一致。按固定相的聚集狀態不同分為液固色譜法和液液色譜法。按分離原理不同分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠色譜法四類。

高效液相色譜所用基本概念：

保留值等色譜分析有關術語，以及分配系數、分配比、塔板高度、分離度、選擇性等方面均與氣相色譜相一致；高效液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率理論也與氣相色譜一致。因液相色譜以液體代替氣相色譜中的氣體作流動相，則速率議程H=A+B/?+C?。式中：縱向擴散項（分子擴散項）B/?對板高的影響與氣相色譜不同，由於液相色譜中組分分子在流動相中的擴散系數Dm僅為氣相色譜中的萬分之一，因此縱向擴散項對板高的影響可以忽略不計。於是影響液相色譜的主要因素是傳質項Cu。由圖14—可知，氣相色譜（GC）的流動相流速u增大時，板高H顯著增大（即柱效顯著降低），而液相色譜（LC）的流速增大時，板高增大不顯著（即柱效降低不顯著）。這說明高效液相色譜也有很高的分離效能，此外，氣相色譜的載氣權數種，其性質差別也不大，對分離效果影響也不大。而液相色譜的載液種類多，性質差別也大，對分離效果影響顯著。因此流動相的選擇很重要，並且在選擇流動相對應注意以下幾點：流動相對樣品有適當的溶解度，但不與樣品發生化學反應，也不與固定液互溶；流動相的純度要高（至少分析純）、粘度要小，以免帶進雜質和組分在流動相中擴散系數下降；流動相應與所用檢測器相匹配，不應對組分檢測產生干擾作用。高效液相色譜不但具有高效、高速、高靈敏度的特點，還由於它的流動相（載液）種類比氣相色譜的流動相（載氣）多，因此可選用兩種或多種不同比例的液體作流動相，從機時可提高選擇性。此外，液相色譜的餾分比氣相色譜易於收集。便於為紅外、核磁等方法確定化合物結構提供純樣品。由於高效液相色譜法具有以上特點，它適於分離、分析沸點高、熱穩定性差、分子量大（大於400）的氣相色譜法不能或不易分析的許多有機物和一些無機物，而這些物質占化合物總數的75～80%。因此它已廣泛用於核酸、蛋白質、氨基酸、維生素、糖類、脂類、甾類化合物、激素、生物鹼、稠環芳烴、高聚物、金屬螯合物、金屬有機化合物以及多種無機鹽類的分離和分析。但是，高效液相色譜的固定相的分離效率、檢測器的檢測范圍以及靈敏度等方面，目前還不如氣相色譜法。此外對於氣體和易揮發物質的分析方面也遠不如氣相色譜法，因此高效液相色譜法和氣相色譜法配合使用可互相取長補短，相輔相成。

1.分離原理
凝膠色譜，又稱空間排阻色譜。它是利用某些凝膠對混合物各組分因分子量不同，其阻滯作用也不同而進行分離、分析的方法。凝膠色譜的分離要理和其它色譜法不同，它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑要比分子篩大得多，一般為幾百至幾千埃。色譜柱內填充具有一定大小孔穴的凝膠。當樣品進入色譜柱後，不同大小的樣品分子（圖14—2中以黑點表示）隨流動相沿凝膠顆粒（圖14—2中以空心圈表示）外部間隙和凝膠孔穴旁流過，體積在的分子因不能滲透到凝膠孔穴里而得到排阻，因此較為順利地通過凝膠柱而較早地被流動相沖洗出來。中等體積的分子產生部分滲透作用，小分子可滲透到凝膠孔穴里去而受阻滯，因有一個平衡過程而較晚地被流動相沖洗出來。這樣，試樣組分基本上按分子大小受到不同阻滯而先後流出色譜柱，從而實現分離目的。光凝膠色譜採用水溶液作流動相進，稱為過濾凝膠色譜（HFC），而用有機溶劑為流動相時，稱為凝膠滲透色譜（GPC）。

2．固定相
凝膠色譜的固定相凝膠，是含有大量液體（一般是水）的柔軟而富於彈性的物質，是一種經過交聯而具有立柱網狀結構的多聚體。根據凝膠的交聯程度和含水量的不同，分了軟質、半硬質和硬質三種。軟質凝膠（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等）交聯度低，膨脹度大，容量大，可壓宿，不能用於高壓（使用壓力低於3.5kg/㎝2或更低），主要用於含水體系的常壓凝膠色譜，半硬質凝膠（如苯乙烯一二乙烯基苯交聯共聚凝膠），容量中等，滲透性較高，壓力可用到70kg/㎝2。適用於非水溶劑流動相；硬質凝膠（如多孔硅膠、多也玻球等），膨脹度小，不可壓縮，滲透性好，可耐高壓，適於高流速下操作。

3．流動相
在凝膠色譜中，為提高分率效率，多採用低粘度、與樣品折光指數相差大的流動相。常用的流動相有苯、甲苯、鄰二氯苯、二氯甲烷、1，2一二氯乙烷、氯仿、水等。

⑵ 高效液相色譜有幾種定量方法其中那種是比較精確的定量方法並簡述

峰面積法、峰高法、歸一法、外標法。峰面積法是比較精確的定量方法

⑶ 如何分析高效液相色譜圖

分析色譜圖的方法：

手動進樣步驟 配置好流動相，將濾嘴洗頭放入流動相頁面內，打開泵和檢測器，快跑排除氣泡，設置既定流速，穩定一段時間，讓基線跑平，用液相針吸取稱量融配脫氣後的對照（含量已標定）。

打開定量環將液相針里的液體勻速注入定量環中，拔出針頭好立刻關閉六通閥，一般隨六通閥關閉電腦自動采樣，等主峰跑完整後記錄其峰面積，一般跑兩個對照，每個對照跑兩針，共四針。

①高壓：流動相為液體，流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。

②高速：分析速度快、載液流速快，較經典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鍾，有些樣品甚至在5分鍾內即可完成，一般小於1小時。

③高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

④高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在μL數量級。

⑤應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物的分離分析，顯示出優勢。

⑥柱子可反復使用：用一根柱子可分離不同化合物

⑦樣品量少、容易回收：樣品經過色譜柱後不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

此外高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。高效液相色譜的缺點是有「柱外效應」。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

⑷ HPLC原理及基本操作是什麼

原理

高效液相色譜法儀根據各種各樣的相互作用力來分離混合物。這種相互作用力通常是分析物及分析管柱之間的一種非共價性質。

使用高效液相色譜時，液體待檢測物在不同的時間被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由於被測物中不同物質與固定相的相互作用不同，不同的物質順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，每個峰頂都代表一個另外化合物的種類，最後通過分析比對這些信號來判斷待測物所含有的物質。

以液體為流動相而設計的色譜分析儀器稱為液相色譜儀。採用高壓輸液泵，高效固定相和高壓靈敏檢測器等裝置的液相色譜儀成為高效液相色譜儀。高效液相色譜儀種類繁多，但不論何種類型的高效液相色譜儀，基本上都分為4個部分：高壓輸液裝置，進樣系統，分離系統和檢測系統。

操作

將要分離和分析的樣品混合物以不連續的小體積（通常為微升）引入滲透通過色譜柱的流動相流中。樣品的組分以不同的速度通過色譜柱，這是與吸附劑（也稱為固定相）的特定物理相互作用的函數。每個組分的速度取決於其化學性質，固定相（柱）的性質以及流動相的組成。

特定分析物洗脫（從色譜柱中出現）的時間稱為其保留時間。在特定條件下測得的保留時間是給定分析物的識別特徵。

可以使用許多不同類型的色譜柱，其中填充了粒徑，孔隙率和表面化學性質各異的吸附劑。使用較小的顆粒尺寸的包裝材料需要使用較高的操作壓力（「背壓」）的和通常改善的色譜解析度（連續的分析物從柱中出現的峰之間的分離度）。吸收劑顆粒本質上可以是疏水的或極性的。

常用的流動相包括水與各種有機溶劑的任何混溶性組合（最常見的是乙腈和甲醇）。一些HPLC技術使用無水流動相（請參見下面的正相色譜法）。

流動相的水性成分可能包含酸（例如甲酸，磷酸或三氟乙酸）或鹽以幫助分離樣品成分。在色譜分析過程中，流動相的組成可以保持恆定（「等度洗脫模式」）或變化（「梯度洗脫模式」）。等度洗脫通常在分離與固定相親和力非常不同的樣品成分時非常有效。

在梯度洗脫中，流動相的組成通常從低到高洗脫強度變化。流動相的洗脫強度由分析物的保留時間反映，高洗脫強度可產生快速洗脫（=較短的保留時間）。

反相色譜中的典型梯度曲線可能始於5％的乙腈（在水或水性緩沖液中），然後在5–25分鍾內線性增長至95％的乙腈。恆定流動相組成的周期可以是任何梯度曲線的一部分。例如，流動相的組成可以在5％的乙腈中保持1-3分鍾，然後線性變化直至95％的乙腈。

流動相的選定組成取決於各種樣品組分（「分析物」）和固定相之間的相互作用強度（例如，反相HPLC中的疏水相互作用）。根據它們對固定相和流動相的親和力，在色譜柱中進行分離過程中，分析物會在兩者之間分配。

此分配過程類似於液-液萃取過程中發生的分配過程，但該過程是連續的，而不是逐步進行的。在此示例中，使用水/乙腈梯度洗脫，一旦流動相在乙腈中的濃度更高（即，在洗脫強度更高的流動相中），則更多的疏水性組分將較晚洗脫（從色譜柱中洗脫）。

流動相組分，添加劑（例如鹽或酸）和梯度條件的選擇取決於色譜柱和樣品組分的性質。通常對樣品進行一系列的試驗，以便找到可以充分分離的HPLC方法。

用途

高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的應用於化學和生化分析中，常用於醫葯品、化學、環保、生命科學、與食品工業的研究上。

高效液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別，它的特點是採用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，可將液體混合物中的成分分離、成分定性及定量分析。適於分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。例如：可檢測分析食品中的三聚氰胺的含量。