常見的致突變研究常用的研究方法

1. 遺傳毒性試驗的實驗方法

近十幾年,隨著遺傳毒理學相關領域特別是分子生物學的研究進展,遺傳毒性測試評價方法也在不斷改進。據報道,目前已建立的遺傳毒性短期檢測法已超過200種。根據其檢測的遺傳學終點可分為4種類型:1檢測基因突變;2檢測染色體畸變;3檢測染色體組畸變;4檢測DNA原始損傷。
1現行組合試驗方案由於一種遺傳毒性檢測方法通常只能反映一個或兩個遺傳學終點。沒有一種檢測方法能涵蓋所有的遺傳學終點,故需用一組試驗配套進行試驗。200多種檢測方法中,真正經過驗證有合適靈敏度和特異度的大概不到10種。目前多數國家規定,如體內誘變試驗顯示1個或以上試驗呈陽性結果,則需要進行生殖細胞遺傳毒性測試。
2各類遺傳毒性試驗方法的研究進展
2.1檢測基因突變
遺傳毒性試驗
2.1.1Ames試驗Ames試驗是檢測化學物質基因突變的常用方法。常規的Ames試驗選用四個測試菌株(TA97、TA98、TA100、TA102),最近有人提出增加TA1535測試菌株,該菌株特別適用於檢測混合物的致突變性。目前出現的新生菌株具有更高的敏感性和特異性,如YG7014、TG7108,缺乏編碼O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基化轉移酶的ogtST基因,專用於對烷化劑引起的DNA損傷檢測;引入乙醯轉移酶基因的YG1024、YG1029菌株,對硝基芳烴和芳香胺的敏感性比原菌株高100倍以上[4]。測試代謝活化系統一般採用由Aro-clor1254(PCBs)誘導大鼠肝微粒體酶的S9;國外也有用人肝S9的報道,試驗證明其代謝活性明顯高於鼠S9[5,6]。為了克服S9制備上的困難和不穩定性,Josephy等將沙門氏菌的芳香胺N-乙醯轉移酶基因和人類細胞色素P-450基因Cyp1A2引入細胞,構建了在無外源S9時也可檢出芳香胺誘變性的Ames測試菌株如DJ4501A2[7]。
2.1.2TK基因突變試驗TK基因突變試驗是一種哺乳動物體細胞基因正向突變試驗,近年來其應用價值有明顯的提高。TK基因編碼胸苷激酶,該酶催化胸苷的磷酸化反應,生成胸苷單磷酸(TMP)。如果存在三氟苷(TFT)等嘧啶類似物,則產生異常的TMP,摻入DNA中導致細胞死亡。如受檢物能引起TK基因突變,胸苷激酶則不能合成,而在核苷類似物的存在下能夠存活。TK基因突變試驗可檢出包括點突變、大的缺失、重組、染色體異倍性和其他較大范圍基因組改變在內的多種遺傳改變。試驗採用的靶細胞系主要有小鼠淋巴瘤細胞L5178Y以及人類淋巴母細胞TK6和WTK1等。其基因型均為tk+/-。Honma(本間正充)和張立實(1999)指出原用染毒時間3～6h對於充分檢出斷裂劑和錘體來說這個時間太短,獲陰性結果時應延長至24h。據資料顯示對於同一陽性受檢物,WTK1細胞的突變頻率遠高於TK6細胞,認為與WTK1存在p53基因突變有關。Do-brovolsky(1999)建立了tk+/-轉基因小鼠,可用於體內試驗。
2.1.3轉基因小鼠基因突變試驗轉基因小鼠基因突變試驗可在整體狀態下檢測基因突變,比較不同組織(包括生殖腺)的突變率,確定靶器官,對誘發的遺傳改變作精確分析等[8]。1989年Gossen等報道了LacZ轉基因小鼠突變測試系統。近年來,國外已陸續發展了多種用於突變檢測的轉基因動物,其中3種已投入商品化生產,MutaTM小鼠、Big-BlueTM小鼠和Xenomouse小鼠,它們分別採用大腸桿菌乳糖操縱子的LacZ和/或Lacl作為誘變的靶基因。陳建泉等人(1997)已經以穿梭質粒pESnx載體,以xy1E基因因為誘變靶基因建立了攜帶xy1E的轉基因小鼠,並對轉基因小鼠進行了繁殖建系。並已實驗證明xy1E轉基因小鼠是一個研究體內基因突變的有效模型,它可望成為一種新的轉基因小鼠突變檢測系統[9]。Heddle等(2000)建立了1個種gptdelta轉基因小鼠。HiroyukiHayashi等(2003)將載有E.coligpt基因和λ噬菌體的red/gam基因λEG10DNA整合到SD大鼠每個單倍體基因組q24～q31位點。這種轉基因大鼠對乙基亞硝基脲(ENU)和苯並芘(B[a]P)的肝臟毒性顯示了很好的敏感性,它也有助於研究遺傳毒性物質對小鼠和大鼠的種間差異[10]。
2.1.4反向限制性酶切位點突變分析法(,iRSM)由英國威爾士大學分子遺傳和毒理中心建立並完善的[11]。iRSM適用於快速檢測誘變劑所致體內外DNA的突變,但這些突變的特點是使某一酶切位點變為另一酶切位點。該方法建立者Jenkins等首先將iRSM應用於化學誘變劑所致動物體內p53基因的突變檢測,取得了良好的結果:小鼠分別口服N-乙基N-亞硝基脲(ENU)、2-乙醯氨基芴(2-AAF)和二甲基醯肼(DMH)3天後,以iRSM方法相應地檢測小鼠脾、骨髓和肝組織p53基因第6內含子區域的Apa→Ava位點反向突變。結果表明ENU誘發肝組織p53基因突變的發生率為33%,2-AAF使肝組織突變的發生率為25%,這一陽性突變率反映出了不同誘變劑對相應組織的致突變強度,進一步驗證了該方法的高靈敏度和准確性。它具有靈敏度高、快速、操作簡便、以及突變檢測部位明確等優點,應當說是一種較具實用價值和生命力的突變檢測手段。但是,iRSM的不足之處是僅能檢測誘發限制性酶切位點反向的DNA突變。根據文獻資料分析,化合物致突的發生具有一定的規律性,即結構類似的一組化合物常常引起一些特定序列較固定的鹼基改變。例如,烷化劑和芳香胺類雖易使一連串鳥嘌呤(G)3′端G發生突變[12,13],這可能與該部位電荷密集有關,多數活性氧生成物質的DNA致突作用也具有類似規律[14];CpG二核苷常常是DNA加成物致突變作用部位[15],所以CpG突變的檢測在化合物致突檢測中具有重要意義,而CpG突變常引發某些固定酶切位點的變化。很顯然,iRSM可較廣泛地應用於遺傳毒性化合物致突作用的檢測。
2.2檢測染色體和染色體組畸變
2.2.1微核試驗傳統的體內微核試驗仍然是檢測化學物質染色體損傷的基本方法。目前微核試驗方法主要有以下改進:1體外微核試驗常用細胞有中國倉鼠肺細胞(CHL)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)及中國倉鼠成纖維細胞(V79)等,近年開始有用L5178Y小鼠淋巴瘤細胞和人的類成淋巴細胞TK6。也有用敘利亞倉鼠胚胎(SHE)細胞和BALB/c3T3細胞。體外試驗比體內試驗易於操作和控制。缺點是對直接作用的化合物有可能出現假陽性。2周圍血微核試驗優點是可重復采樣,自身對照,減少實驗動物數。李尊愛(1999)報道剛斷乳不久的小鼠(4～6周齡)用於外周血網織紅細胞微核試驗比年齡更大的敏感些[16]。3胞質分裂阻滯法微核試驗(CB-MNT)很好地排除了細胞分裂的影響。該法中,雙核細胞是只分裂了一次的細胞,其結果更加穩定敏感。CB-MNT可觀察到多種遺傳學終點。觀察不同分裂期的細胞比例,計算核分裂指數能檢測誘變物對細胞周期的影響。還可檢測切除修復,次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)位點變異,凋亡。認為該試驗可使計數值提高,達到傳統方法的兩倍或以上。但也偶小於兩倍的結果(李來玉,1996)。最近Garriott和Phelps等推薦了關於體外雙核細胞微核試驗的幾個參數條件:細胞鬆弛素B不影響試驗結果;計數2000個雙核細胞;長時間暴露沒有必要;結果用趨勢檢驗分析;根據相應的細胞毒性選擇適當的濃度[17]。
2.2.2染色體畸變試驗染色體畸變試驗是檢測化學物質影響染色體數量和結構的基本方法。在化學物質安全性評價中常選體外CHL細胞染色體畸變、精原細胞染色體畸變試驗等檢測化學物質對染色體的影響。為了准確觀察誘發的畸變頻數,本試驗收獲細胞的時間應盡量提前至大多數細胞處於染毒後第1次有絲分裂時(Tucker,1996)。對於染色估數目改變,原則上只適合超倍體的觀察。因為塗片時可能人為地把染色體推出細胞外(Tucker,1997),Danford曾建議在制備標本時減弱低滲處理能力,以免漲破細胞膜,從而能准確觀察亞二倍體。經研究,認為以0.094mo1/LKC1弱低滲液處理2min～3min是達此目的的最佳條件(樓鐵柱,1997)。
2.2.3熒光原位雜交(FISH)技術熒光原位雜交最早由Bauman(1980)建立,後由Lucas(1989)首先應用於染色體畸變分析。其原理是按檢測目標准備恰當的DNA序列作為探針,並用生物素標記,對載玻片上待測標本中的DNA雜交,最後通過雜交位點的熒光觀察染色體結構或數目的改變。應用特殊染色體和染色體某區域的熒光探針可在體內檢測4種類型的細胞遺傳學終點[18]。1檢測中期細胞染色體畸變。2應用亞染色體區域的探針檢測間期染色體斷裂和非整倍體。3應用中心粒探針和/或抗著絲點抗體檢測微核的形成。Schriever-Schwemmet等利用CREST間接免疫熒光法,以及小鼠次要和主要衛星DNA探針,在小鼠骨髓細胞證明了受試物引起微核的來源[19]。4哺乳動物精子非整倍體檢測。徐德祥(1999)用雙色FISH方法對丙烯腈接觸男工精子性染色體數目畸變進行了檢測,證明FISH技術用於檢測精子染色體數目畸變實驗結果穩定可靠。
2.3檢測DNA原始損傷2.3.1單細胞凝膠電泳技術單細胞凝膠電泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)是Ostling等(1984)首創的,以後經Singh等(1988)進一步完善而逐漸發展起來的一種快速檢測單細胞DNA損傷的實驗方法,因其細胞電泳形狀頗似慧星,又稱慧星試驗(cometassay)。Kizilian(1999)改進了一些試驗條件,能明顯將細胞調亡和細胞壞死的形象與「彗星」區分。MarkS.Rundell等(2003)報道彗星試驗測行的損傷主要是由致突變劑引起的[20]。RichardD.Bowden等(2003)研究出了一種新的分析試驗結果的彗星尾圖譜,可以更加准確的分析彗星的長度及密度[21]。SCGE是評價遺傳毒性損害非常敏感的實驗,可以檢測到每1.657×10-37kg中0.1個DNA的斷裂。與經典的染色體畸變、微核、SCE相比,SCGE可以用於活細胞DNA的檢測,也能用於死亡細胞DNA的分析,使SCGE不僅可以研究低劑量下的生物效應,也可用於研究高劑量下的生物效應;同時SCGE又可提供DNA修復能力的信息,這使得SCGE非常適用於評價受試物的遺傳毒性

2. 常用的基因突變檢測方法有哪些

1、焦磷酸測序法

測序法的基本原理是雙脫氧終止法，是進行基因突變檢測的可靠方法，也是使用最多的方法。

但其過程繁瑣、耗時長，靈敏度不高，對環境和操作者有危害，故在臨床應用中存在一定的限制。

焦磷酸測序法適於對已知的短序列的測序分析，其可重復性和精確性能與SangerDNA測序法相媲美，而速度卻大大的提高。

焦磷酸測序技術產品具備同時對大量樣品進行測序分析的能力。

為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進行單核苷酸多態性研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術操作平台。

2、微數字聚合酶鏈反應

該方法為將樣品作大倍數稀釋和細分，直至每個細分試樣中所含有的待測分子數不超過1個，再將每個細分試樣同時在相同條件下聚合酶鏈反應後，通過基因晶元逐個計數。

該方法為絕對定量的方法。

3、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析技術

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。

該法一般用於檢測已知的突變位點。

因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。

這也是「微量證據」的威力之所在。

由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。

到如今2013年，PCR已發展到第三代技術。

1976年，台灣科學家錢嘉韻，發現了穩定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。

PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右）。

DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。

基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

4、高效液相色譜法

該方法是基於發生錯配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特徵的差異而進行檢測的，可檢測出含有單個鹼基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段。

與測序法相比，該法簡單、快速，不僅可用於已知突變的檢測，還可用於未知突變的掃描。

但只能檢查有無突變，不能檢測出突變類型，結果判斷容易出錯。

5、單鏈構象異構多態分析技術

依據單鏈DNA在某一種非變性環境中具有其特定的第二構象，構象不同導致電泳的遷移率不同，從而將正常鏈與突變鏈分離出來。

與測序法相比，靈敏性更高。

3. 化學物致癌作用的研究方法有哪些

國際環境致突變物致癌物防護委員會（icpemc）告蔽1983年提出把致突變試驗所反映的遺傳學終點分為5類：
dna完整性的陸做改變（形成加合物、斷裂、交聯）；
dna重排或交換；
dna鹼基序列改變；
染色體完整性早友衡改變；
染色體分離改變。
其中第3實際指基因突變，而第4和第5依次指染色體結構改變和數目改變。

4. 環境毒理學的實驗方法

環境污染物對機體毒作用的評定，主要是通過以下幾種動物實驗方法進行的：
急性毒性試驗：其目的是探明環境污染物與機體作短時間接觸後所引起的損害作用，找出污染物的作用途徑、劑量與效應的關系，並為進行各種動物實驗提供設計依據。一般用半數致死量、半數致死濃度或半數有效量來表示急性毒作用的程度。
亞急性毒性試驗：研究環境污染物反復多次作用於機體引起的損害。通過這種試驗，可以初步估計環境污染物的最大無作用劑量和中毒閾劑量，了解有無蓄積作用，確定作用的靶器官，並為設計慢性毒性試驗提供依據。
慢性毒性試驗：探查低劑量環境污染物長期作用於機體所引起的損害，確定一種環境污染物對機體的最大無作用劑量和中毒閾劑量，為制訂環境衛生標准提供依據。
為了探明環境污染物對機體是否有蓄積毒作用，致畸、致突變、致癌等作用，隨著毒理學的不斷進展，人們又建立了蓄積試驗、致突變試驗、致畸試驗和致癌試驗等特殊的試驗方法。
環境毒理學的研究主要以動物實驗研究為主，觀察實驗動物通過各種方式和途徑，接觸不同劑量的環境污染物後出現的各種生物學變化。實驗動物一般為哺乳動物，也可利用其他的脊椎動物、昆蟲以及微生物和動物細胞株等。
用動物實驗來觀察環境污染物對機體的毒作用，條件容易控制，結果明確，便於分析，是評定環境污染物毒作用的基本方法。但動物與人畢竟有差異，動物實驗的結果，不能直接應用於人。因此，一種環境污染物經過系統的動物毒性試驗後，還必須結合環境流行病學對人群的調查研究結果進行綜合分析，才能作出比較全面和正確的估價。
隨著人類對環境污染物認識的不斷深入，環境毒理學將在多個方向發展，其中主要是探討多種環境污染物同時對機體產生的相加、協同或拮抗等聯合作用；深入研究環境污染物在環境中的降解和轉化產物以及各種環境污染物在環境因素影響下，相互反應形成的各種轉化產物所引起的生物學變化；一步研究致畸作用的機理，完善致突變作用的試驗方法，找出致癌作用與致突變作用的確切關系；深入研究環境污染物對動物神經功能、行為表現以及免疫機能的早期敏感指標；深入研究環境污染物的化學結構同它們的毒性作用的性質和強度的密切關系，以便根據化學結構，作出毒性的估計，減少動物毒性試驗，並為合成某些低毒化合物提供依據。

5. 在醫學遺傳學中常用什麼方法檢測基因突變

SNP檢測，
樓上答的挺多一看就是網上摘的，但有點錯誤，我更正和補充一下。 主觀填空題 1.干係 2.基因組DNA 3.遺傳物質 4.染色體（或DNA）復制一次 5.交叉遺傳 6.細胞癌基因 7.點突變 8.完全顯性遺傳 9.羅伯遜易位 10.重排 四、名詞解釋 聚合酶鏈式反應(PC...
11多重PCR 12正確 13正確 14正確 15正確 16正確 17錯誤 18正確 19正確 20錯誤
1.減數分裂是指生殖細胞成熟過程中(DNA復制一次 )後，細胞連續分裂二次。 2.發生於近端著絲粒染色體間的易位稱為(著絲粒融合 )。 3.在一個腫瘤細胞群體中，佔主導地位的克隆就構成其(干係 ) 4.結構異常是指由於染色體斷裂、重接後，形成結構改變...
醫學遺傳學英文名稱：medical genetics定義：應用遺傳學的理論與方法研究遺傳因素在疾病的發生、流行、診斷、預防、治療和遺傳咨詢等中的作用機制及其規律的遺傳學分支學科。 遺傳學在醫學中的應用，包括，生理、病理和葯理的遺傳學分析。遺傳學...
遺傳學是研究生物的遺傳和變異，即研究親子間的異同的生物學分支學科。 遺傳學的研究范圍包括遺傳物質的本質、遺傳物質的傳遞和遺傳信息的實現三個方面。遺傳物質的本質包括它的化學本質、它所包含的遺傳信息、它的結構、組織和變化等；遺傳物質...