bliss是什麼方法

① LD50的測定

LD50的測定方法很多，如:目測機率單位法、加權機率單位法(Bliss氏法)、寇氏法(Karber氏法)及序貫法等，其中Bliss法是比較推薦使用的方法。此法對劑量分組無嚴格要求，不需要劑量組有0%和100%死亡率，是目前公認最准確的測定方法。但本法計算繁瑣，故現多採用計算機程序計算。

我國衛生部規定，Bliss法是作為新葯LD50測定評定必須採用的方法。

(1)bliss是什麼方法擴展閱讀

在毒理學中，半數致死量（median lethal dose），簡稱LD50（即Lethal Dose, 50%），是描述有毒物質或輻射的毒性的常用指標。按照醫學主題詞表（MeSH）的定義，LD50是指「能殺死一半試驗總體的有害物質、有毒物質或游離輻射的劑量」。這測試最先由J.W. Trevan於1927年發明。

定義

半數致死量（lethal dose 50%, LD50）：是指能夠引起試驗動物一半死亡的葯物劑量，通常用葯物致死劑量的對數值表示。

LD50及相應置信區間是由劑量-反應模型得出的最常用的統計量。

LD50是半數致死劑量，指在預定時間之內，如96h，導致50%被暴露個體死亡的劑量。

半數致死劑量

指使實驗動物一次染毒後，在既定實驗期間和條件下統計學上半數實驗動物死亡所使用的毒物劑量。

LD為Lethal dose(致死劑量)的縮寫

LD50是半數致死劑量，指使實驗動物一次染毒後，在14天內有半數實驗動物死亡所使用的毒物劑量。特別提示，LD50中50為下角標。

LD50=0.1mg/kg 表示在一次性攝入0.1mg*BW(體重)劑量的毒性物質後，14天內導致一半被測動物死亡。

② 簡述信息組織的思想方法

信息組織即信息的有序化與優質化，也就是利用一定的科學規則和方法，通過對信息外在特徵和內容特徵的表徵和排序，實現無序信息流向有序信息流的轉換，從而使信息集合達到科學組合實現有效流通，促進用戶對信息的有效獲取和利用。 信息組織具有：類聚性，系統性，動態性，多重性，綜合性。
（1）信息選擇：從採集到的、處於無序狀態的信息流中甄別出有用的信息，剔除無用的信息，是信息組織過程的第一步。 （2）信息分析：按照一定的邏輯關系從語法、語義和語用上對選擇過的信息內、外特徵進行細化、挖掘、加工整理並歸類的信息活動。 （3）信息描述與揭示：也稱為信息資源描述，根據信息組織和檢索的需要，對信息資源的主題內容、形式特徵、物質形態等進行分析、選擇、記錄的活動。 （4）信息存貯：將經過加工整理序化後的信息按照一定的格式和順序存貯在特定的載體中的一種信息活動。 [編輯]
編輯本段信息組織的類型
1、按信息表現形式劃分
（1）文字信息組織 （2）圖像信息組織 （3）聲音信息組織 （4）視頻信息組織
2、按信息的加工程度劃分
（1）一次信息組織 （2）二次信息組織 （3）三次信息組織
3、按信息的傳播載體劃分
（1）文獻信息源 （2）非文獻信息源 非文獻信息源特指網路環境下沒有以傳統文獻載體形式出現的信息源，如程序代碼、網頁、超文本等。為了學習的方便，我們統稱為網路信息源。
（1）信息組織的滲透性
信息組織的滲透性指信息組織存在於各種信息揭示、存貯和檢索活動之中。
（2）信息組織的依附性
信息組織的依附性指信息組織無法獨立存在，它要以信息的識別、揭示等活動為前提。
（3）信息組織的增效性
信息組織的增效性指信息組織可以增加信息傳播、檢索、利用的效率，是其他信息加工活動和利用信息的保障。
編輯本段信息組織的原則
1.客觀性原則
信息組織中進行描述和揭示的基本依據就是信息本身（the item obtained），因此，我們描述和揭示信息的外在特徵和內容特徵必須客觀而准確，要根據信息本身所反映的各種特徵加以科學地反映和序化，形成相應的信息組織的成果。
2.系統性原則
系統性原則要求在信息組織中把握好這四個關系： （1）宏觀信息組織與微觀信息組織的關系 （2）信息組織部門與其他部門的關系 （3）信息組織工作各個環節之間的關系 （4）不同信息處理方法之間的關系
3.目的性原則
信息組織具有鮮明的目的性，必須圍繞用戶的信息需求開展工作，注意信息機構的目標市場的需求狀態及其變化特徵，滿足成本收益對稱的原則。
4.現代化原則
信息組織現代化原則包括思想觀念現代化和技術手段現代化兩個方面。 信息組織的思想觀念現代化集中體現在信息組織的標准化上，即信息組織工作的一致性、信息組織方法的規范性、信息組織系統的兼容性和信息組織成果的通用性。
編輯本段信息組織的要求
(1) 信息特徵有序化。
一是要將內容或外在特徵相同或者相關的信息集中在一起，把無關的信息區別開來；二是集中在一起的信息要有系統、有條理，按一定標識呈現某種秩序，並能表達某種意義；三是相關信息單元之間的關系要明確化，並能產生某種關聯性，或者能給人某種新的啟示。
(2) 信息流向明確化。
現代管理科學的基本原理表明，信息作用力的大小取決於信息流動的方向。信息整序要做到信息流向明確化。首先，要認真研究用戶的信息需求和信息行為，按照不同用戶的信息活動特徵確定信息的傳遞方向；其次，要注意根據信息環境的發展變化不斷調整信息流動的方向，盡量形成信息合力。
(3) 信息流速適度化。
信息流速的不斷加快使人們感受到巨大的信息壓力，眼花繚亂的信息流可能會降低決策的效率。同時，人們面對的決策問題在不斷地發展變化，信息需要也在不斷地更新。為此必須適當控制信息流動速度，把握信息傳遞時機，提高信息的效用。
編輯本段信息組織的目的
信息組織的目的可以概括為「實現無序信息向有序信息的轉換」。具體地說，信息組織的目的應包括： ①減少社會信息流的混亂程度； ②提高信息產品的質量和價值； ③建立信息產品與用戶的聯④節省社會信息活動的總成本。
編輯本段信息組織的理論基礎
信息組織是由來已久的一種人類社會實踐活動，在其發展過程中，不斷地從相關學科的理論和方法中汲取營養，使自身逐漸得到充實和完善。 （1）系統理論 系統科學的思想是20世紀20年代由奧地利學者路得維希.馮.貝塔朗菲（Ludwig Von Bertalanffy）在研究理論生物學的時候提出來的，他把系統定義為「相互作用的諸要素的復合體」，認為系統是處於一定的相互關系中並與環境發生關系的各個組成部分的總體。系統具有整體性、內部相關性、環境相關性、層次性、有序性、目的性等特徵。信息組織使信息有序化，使有組織的信息整體功能大於各個信息單元的功能之和。 （2）耗散結構理論 耗散結構理論由比利時布魯塞爾學派領導人伊利亞.普里高津（Ilya Prigogine）提出。其基本思想有兩點：一是系統內部非平衡是有序之源；二是開放系統通過與外界交換物質、能量而增加、維持有序性。信息組織通過與外界交換物質、能量與信息，對信息整序加工使信息系統成為遠離平衡態的開放系統。因此，耗散結構理論可作為信息組織的理論基礎。 （3）協同性理論 協同性由德國科學家哈肯（Haken）於1970年提出，是一門研究系統進化普遍規律的科學，它研究由許多子系統構成的系統是如何通過協作從無序到有序演化的規律。由於信息由許多信息單元構成，如何建立各個信息單元之間的協同作用機制，使信息由無序向有序轉化是信息組織的基本目標。 （4）突變理論 突變理論由法國數學家托姆（R. Thom）提出，它用形象而精確的數學模型來揭示和預測事物的連續性中斷的質變過程。突變理論的一個重要觀點是「突變是產生有序性的重要源泉」。突變理論為信息組織理論的發展與完善提供了理論基礎。 （5）知識組織理論 知識組織理論最早由英國著名的分類法學家布利斯（Bliss）提出。所謂知識組織，是指對知識客體進行諸如整理、加工、揭示、控制等一系列組織化過程，是關於知識組織的理論與方法。知識組織可分為主觀知識的組織和客觀知識的組織。主觀知識的組織在人的大腦中進行，表現為復雜的神經生理活動，人工智慧、認知心理學等重點研究主觀知識組織的內在機理；客觀知識的組織是通過人的認知進行分類，並憑借一定的方法完成的。信息組織主要關注客觀知識的組織活動。 （6）信息自組織理論 信息自組織是信息組織方法的拓展，是信息組織理論研究中的新課題。不藉助外部控制而能實現從無序到有序的轉變，並維持穩定有序狀態的系統稱為自組織系統。信息自組織是指作為信息系統組成要素的信息，由於人與人之間、人與系統其他要素之間存在的相關性、協同性和默契性而形成特定結構與功能的過程，也就是信息系統無需外界指令而能自行組織信息，自我有序化和優化的過程。近年來，信息總量的持續增長、信息技術的飛速發展，使信息系統顯著地具備了自組織的條件，特別是網路信息已經具有自組織的開放性、遠離平衡和非線性相關等特徵。因此，研究信息自組織理論對於網路信息的組織具有非常重要的理論與實踐意義。
編輯本段圖書信息
第三節 分類標引的方法與規則 一、辨類的方法 二、分類標引的基本規則 三、分類標引的一般規則 四、各學科信息的分類標引規則 五、確定分類法使用本與圖書改編 六、同類書區分 第四節 主題標引的方法與規則 一、主題概念分解與查表選詞的方法 二、選擇標引詞的一般規則 三、各類型主題與各類型文獻的主題標引規則
第七章 信息組織中的自然語言應用
第一節 自然語言在信息組織中的應用概述 一、自然語言的演化 二、自然語言區別於受控語言的特點 三、自然語言處理及其在信息組織和檢索中的應用 第二節 自然語言在信息組織中的應用 一、自動標引的實現基礎——自動分詞 二、自然語言標引 三、自動分類 第三節 自然語言檢索系統與自然語言檢索 一、自然語言檢索系統概述 二、自然語言檢索 三、全文檢索 四、搜索引擎的自然語言檢索 五、自然語言檢索系統的優點及存在的不足 第四節 後控制檢索 一、後控制機制概述 二、國內外後控詞表研究及其應用現狀 三、網路檢索系統中的後控制技術
第八章網路信息組織
第一節 網路信息類型與特點 一、網路信息及其類型 二、網路信息的環境特點和組織的難點 三、網路信息組織的目標 第二節 網路信息的分類組織 一、傳統分類法應用於網路信息組織 二、網路信息分類法與分類模式 三、網路信息自動分類 第三節 網路信息的主題組織 一、基於網路的敘詞表的發展 二、敘詞表在網路多媒體信息組織中的應用 三、主題法在網關中的應用 第四節 基於本體的信息組織 一、語義網信息組織新模式 二、本體基本原理 三、網路本體描述語言 四、本體構造 五、本體標注 第五節 網路信息組織方式 一、文件方式 二、資料庫方式 三、主題樹方式 四、搜索引擎方式 五、Web2.0信息自組織方式 第六節 網路信息重組與知識挖掘 一、網路信息重組與導航 二、網路知識挖掘

③ 小鼠灌胃 處死 解剖

目的：觀察「酒花素油劑」小鼠口服和大鼠皮膚用葯的毒性反應。方法：小鼠灌胃給予不同濃度的「酒花素油劑」(各劑量間比值為0.85)，觀察死亡情況，用Bliss法計算LD 50 。大鼠背部脫毛，塗以不同濃度的「酒花素油劑」，塗葯面積約占體表面積的10%，破損皮膚組用針尖劃破表皮。給葯後觀察大鼠的體重及中毒反應。結果：小鼠口服「酒花素油劑」後的LD 50 為557.06 mg/kg，中毒表現主要為肢體抽搐和呼吸困難。大鼠完整皮膚對濃度為臨床用濃度10倍的「酒花素油劑」能較好耐受，破損皮膚對7倍於臨床用濃度的「酒花素油劑」亦能較好耐受。結論：「酒花素油劑」口服為低毒性物質，完整皮膚和破損皮膚用葯均較為安全。

「酒花素油劑」為上海華光啤酒廠生產的，用於促進慢性瘡瘍及燒傷創口等癒合的外用制劑。為了考察「酒花素油劑」的安全性，本文擬觀察「酒花素油劑」一次給予小鼠口服後所產生的毒性反應及死亡情況，並觀察完整皮膚及破損皮膚的大鼠在短期內接觸「酒花素油劑」後所產生的毒性反應。

1 材料

1.1 動物：昆明種小鼠，體重18～22 g，雌雄各半；SD大鼠，體重170～230 g，雌雄各半，由第二軍醫大學實驗動物中心提供。

1.2 葯品：「酒花素」及中性植物油(溶劑)由華光啤酒廠提供。根據實驗要求，將「酒花素」溶於中性植物油中，配製成不同濃度的「酒花素油劑」。

2 實驗方法

2.1 小鼠口服LD50〔1〕

根據預試結果，在葯物劑量為366～970 mg/kg的范圍內，將小鼠按體重均勻分為7組，每組10隻(�♀各5隻)，各劑量間距為0.85，灌胃給葯體積為每10 g體重0.1 ml。另設一溶劑對照組，僅給中性植物油0.8 ml/只。

小鼠禁食12小時後灌胃給葯，給葯後即開始觀察動物的毒性反應情況，及時記錄死亡數。死亡動物立即進行解剖，觀察內臟器官的病變情況。未死動物連續觀察9天，9天後處死，解剖，觀察臟器變化。

用Bliss法計算LD 50 ，採用計算機「NDST程序」進行運算。

2.2 大鼠皮膚急性毒性實驗〔2〕

實驗動物分為完整皮膚和破損皮膚兩部分，每個部分又分為大、中、小三個劑量組，劑量間距為0.7，每組10隻大鼠。另設溶劑對照組，每組6隻大鼠。

大鼠在氯胺酮(90 mg/kg ip)麻醉下，進行背部脫毛(用剃刀仔細剪去背部的毛)，脫毛范圍約為4.5 cm×7 cm(約占體表面的10%左右)。在此脫毛區內均勻塗以不同濃度的「酒花素油劑」及溶劑，約0.6 ml/只，塗完後用無毒塑料薄膜覆蓋，綳帶包紮。破損皮膚組大鼠在背部脫毛區用針尖劃破表皮，以滲血為度，然後再塗以不同濃度的「酒花素油劑」。給葯後即開始觀察動物的全身毒性反應，死亡動物立即進行屍體解剖，肉眼觀察各臟器的病變情況，10天後處死大鼠，大體解剖，肉眼觀察全身各器官的變化情況。

3 結果

3.1 小鼠口服LD 50

小鼠灌胃給葯後，死亡動物約在0.5～2小時內出現呼吸急促、煩躁等表現，隨後出現肢體抽搐，死亡前有明顯的驚厥表現。死亡一般發生在給葯後的1～6小時內，個別發生在12～48小是內。死後立即屍檢可見，小鼠因死前的肌肉強直而表現為屍體僵硬，心臟停跳於收縮狀態。內臟重要器官(心、肺、肝、脾、腎及消化道等)未見充血、水腫及明顯的器質性變化。存活動物多數有一過性的呼吸急促表現，24小時內活動稍差，食慾減少。24小時(個別48小時)後逐漸恢復活動和攝食，一般情況良好，無其他不良反應的表現發生。連續觀察9天後處死小鼠，大體解剖未見肉眼可見的病理變化。溶劑對照組10隻小鼠給葯後無明顯的毒性反應出現，觀察10天後處死，大體解剖亦無異常發現。

各劑量組的死亡情況見表1，死亡率無明顯的性別差異。

用Bliss法計算得LD 50 =577.06 mg/kg,95%可信限范圍為505.74～658.43 mg/kg。

3.2 大鼠皮膚急性毒性實驗

各劑量組大鼠的死亡情況及給葯前後的體重變化情況見表2。

表1 小鼠口服「酒花素油劑」後LD 50 計算(Bliss法)

劑量(mg/kg)
對數劑量(X)
動物數(只)
死亡動物數(只)
死亡率(%)
機率單位(Y)

970
2.987
10
10
100
6.75

824
2.916
10
8
80
6.20

701
2.846
10
7
70
5.66

596
2.775
10
6
60
5.11

506
2.704
10
4
40
4.56

430
2.633
10
2
20
4.01

366
2.563
10
0
0
3.46

表2 大鼠皮膚用「酒花素油劑」後的毒性反應

組
別
葯物濃度(%)
動物數(只)
死亡動物數(只)
體重 (g,x±s)

用葯前 用葯後
完
整
皮
膚
A
53.67
10
0
206±19
210±24

B
37.57
10
0
207±21
220±20

D
溶劑
6
0
198±19
206±22

破
損
皮
膚
A
53.67
10
2
200±20
204±23

B
37.57
10
0
202±18
207±21

C
26.30
10
0
198±19
199±24

D
溶劑
6
0
206±22
208±20

在完整皮膚的大鼠中，兩個用葯組及溶劑對照組均無明顯的毒性表現，用葯後飲食、活動無明顯變化。各組動物給葯局部均未發現明顯的紅、腫等刺激反應，1周後脫毛區開始長毛。連續觀察10天後處死大鼠，大體解剖未見明顯的臟器異常變化。

破損皮膚大鼠用葯後，大劑量組在4～24小時內有2隻死亡，死前出現明顯的呼吸困難及輕度肌肉抽搐，死後屍體解剖無明顯的異常發現。另有兩只大劑量組及1隻中劑量組的大鼠在用葯後8～12小時內出現一過性的呼吸困難。其餘各用葯組及溶劑對照組的大鼠均未見明顯的毒性反應，僅少數動物在用葯當天食慾稍差。連續觀察10天，大鼠飲食、活動均無異常，體重變化亦不明顯。大鼠皮膚破損區創口第二天開始結痂，無明顯的紅腫及潰爛表現，亦無感染發生。創口約1周左右癒合，無明顯疤痕。觀察10天，部分大鼠脫毛局部已開始長毛，10天後處死，大體解剖未發現肉眼可見的異常變化。

4 討論

酒花素是從啤酒花中提取的有效成分，主要由蛇麻酮、草酮等組成。已有的研究資料表明，酒花素有一定的抗菌和促進肉芽組織增生的作用。本實驗的結果顯示，大鼠在用葯面積占體表面積10%的情況下，破損皮膚對濃度為26.30%的「酒花素油劑」能較好耐受，對37.57%的濃度亦能耐受，且破損皮膚創口癒合較快，無感染發生。該兩濃度分別為臨床用葯濃度的5倍和7倍(臨床用葯濃度為5%)。完整皮膚對於臨床用葯濃度10倍劑量的「酒花素油劑」亦能耐受，不出現明顯的中毒反應。作為溶劑的中性植物油用在破損皮膚和完整皮膚上均無明顯的毒性反應。小鼠口服該葯的LD 50 為577.06 mg/kg，屬低毒物質。以上結果提示，「酒花素油劑」臨床應用較為安全。

④ IL-2活性測定問題

實驗前應明確的問題

1.選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由於不同細胞貼壁後面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

2.葯物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是葯物的有效濃度和時間。

3. 時間點的設定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，最後得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什麼時候變得平坦了（到了平台期）那個時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑製表現的最明顯）。

4.培養時間。200ul的培養液對於10的4～5次方的增殖期細胞來說，很難維持68h，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨於靜止，影響結果，我們是在48h換液的。

5.MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。

6.理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。

7.實驗時應設置調零孔，對照孔，加葯孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞碸。對照孔和加葯孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞碸，不同的是對照孔加溶解葯物的介質，而加葯組加入不同濃度的葯物。

8.避免血清干擾。用含15％胎牛血清培養液培養細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由於試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小於10％胎牛血清的培養液進行。在呈色後，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。

實驗步驟

貼壁細胞：

1.收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2.5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的葯物,原則上，細胞貼壁後即可加葯，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加葯.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況

3.5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。若葯物與MTT能夠反應，可先離心後棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍後，再加入含MTT的培養液。

5.終止培養，小心吸去孔內培養液。

6.每孔加入150ul二甲基亞碸，置搖床上低速振盪10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

7.同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞碸），對照孔（細胞、相同濃度的葯物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞碸）

懸浮細胞：

1）收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml，按次序將①補足的1640（無血清）培養基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養液稀釋 lg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100(儲存液100 1640）。

2）置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。

3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4 h。（懸浮細胞推薦使用WST-1，培養4 h後可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）

4）離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞碸，置搖床上低速振盪10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。

5）同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞碸），對照孔（細胞、相同濃度的葯物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞碸），每組設定3復孔。

MTT的配製

MTT一般最好現用現配，過濾後4ºC避光保存兩周內有效，或配製成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那麼多,尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。

MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作台上的照明燈關掉.

配製MTT時用用PBS<ph=7.4>溶解,也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。

PBS配方:

Nacl 8g

Kcl 0.2g

Na2HPO4 1.44g

KH2PO4 0.24g

調ph 7.4

定容1L

關於細胞的接種(鋪板)

細胞過了30代以後就不要用了,因為狀態不好了;培養板要用好的（最好進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。

接種時最好按照預實驗摸索出的密度接種, 因為細胞密度在10000/ml左右時，所測得的OD值的區間即細胞抑制率（或者增值率）的所呈現的線性關系最好，結果最可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯，太密細胞可能都會凋亡，因為細胞長的太快營養會不夠，最後導致死亡。且而細胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關系不佳。故而MTT細胞密度多採用10000/ml，100ul/孔。

細胞密度要根據不同細胞的特點來定.如果你做的葯品對細胞具有刺激作用那麼取小點的細胞濃度，如果你做的葯品對細胞具有抑製作用那麼取大點的細胞濃度，這樣與對照的區別更明顯，數據更好。懸浮細胞每孔的細胞數可達到105,貼壁細胞可為103-104.

其它的聲音：

1.首先細胞的接種密度一定不能過大，一般每孔1000個左右就夠了，我認為寧少勿多。尤其是對於腫瘤細胞。10000/孔是太高了，這樣即使葯物有作用，MTT方法也是表現不出的，最佳點板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會很大。

2.MTT本身就是比較粗的實驗，增殖率10%左右的波動都不算奇怪。特別是新手，20％的波動也是常見的，所以很可能是技術原因引起的，特別是種板技術一定要過關。

3.我做的是腫瘤細胞的MTT實驗,這種細胞長的很快一開始我是用100000/ML的濃度來接種的,結果細胞長的太滿結果是沒有梯度也沒有線性關系.後來調整濃度,用過40000~80000/ML的濃度都做過MTT實驗,結果發現做的結果比較好點的是60000~70000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組,由於細胞少,葯物作用的梯度還是有,只是沒有很好的線性關系.還有根據細胞生長速度以及葯物的特性(有時間依賴性和濃度依賴性的葯物)來確定培養時間是48小時還是72小時.

注意細胞懸液一定要混勻，已避免細胞沉澱下來，導致每孔中的細胞數量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會在8%左右。另外，吹散次數過多也會影響細胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。

首先說說我的一點經驗：

1.吹打時懸液總量不能太多，達到吸管吸液量的3到4倍，可能比較容易混勻。10ml的離心管裡面最好裝3~4ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細胞懸液。。。

2.吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量過多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過少，吹打的力度就不夠，吹打就會不均勻。如果是吸液量1ml多的吸管，總液量在5ml左右為益

3.吸的時候要在懸液底部，然後提起來一點，但是吹下去的時候不要離開液面，否則容易吹打出氣泡。

4.吹打次數100左右，就可以吹打均勻了（有人認為加細胞前吹打30－50次基本就差不多均勻了。加細胞的時候每接種2孔反復吹打3次，每吹打3次後槍頭垂懸與細胞懸液中5秒鍾，然後再以一定的速度吸取懸液。）

5.向每孔中用槍頭加入細胞時不要太快，否則你會發現細胞在加入的瞬間會由於槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周邊很少，這種不均勻的分散會產生接觸抑制，影響細胞的生長。所以速度不能太快也不能太慢。我習慣每塊板加完後平握手中，向左3下，向右3下，在往返回復3下移動，目的是使得細胞能分散的均勻些。（鋪板技術是MTT實驗的關鍵，也是基礎，一定要練好。曾經有同學用漩渦振盪器混勻細胞，最後細胞全死了，建議不要採用這種方法混勻細胞。

加入MTT

個人認為MTT最關鍵的是你的細胞數目和你加入真正起作用的的MTT的適當比例，具體細胞數目和真正起作用的的MTT之間的關系確實不好確定，我認為MTT多加一些比少加好一些

MTT的量各家報道不同，一般是過量的，所以10ul即夠了。如果不使用96孔板，培養基超過100ul，MTT按照10%的比例加入.加入MTT以後振盪一下讓MTT與培養基混勻，不過這個應該關系不大。

如加入MTT後都有個別孔立即變為藍黑色，則污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的

因為血清中白蛋白對大部分的葯物都有結合效應，所以可以單獨將葯物和MTT加在一起，看會不會起反應。如果不起反應，就不用去除含葯物的培液，直接加MTT即可。

如何清除上清

百家爭鳴：

1.加DMSO前要把液體吸掉，但培養液里的紫色結晶可能會吸去，可在這之前先用平板離心機離心96孔板，2000r，5分鍾，然後吸掉上清(如果是懸浮細胞，則推薦此法,懸浮細胞要離心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圓底型96孔板,清除上清時注意不要把下面的結晶顆粒吸掉,建議各孔吸棄150-160ul即可)。

2.我每次將MTT加入後，再孵育四個小時，然後用離心機離心1000G,5min。但是用槍小心地吸上清，還是會將一小部分藍色結晶吸出。所以還是建議翻轉倒扣的方法吧！

3.另外，可以直接將板翻轉倒扣（墊幾層濾紙）2－3次，比用「吸」的辦法更不容易使細胞脫離出來。可以輕拍，或者傾斜一點幫助吸液，發現紫色結晶幾乎沒有肉眼可見的掉脫，但前提是你本身細胞貼壁要比較牢，半貼壁生長的細胞容易脫離。假如葯物作用時間長的話，陰性對照組可能由於細胞過多而使加入MTT後形成的結晶漂起來，這樣就不能直接倒掉上清。

4.做MTT時，這一步驟一定要小心，不要採用倒的方式。因為貼壁不牢的細胞會被倒掉，從而影響OD值。懸浮細胞，不要翻板，離心後也不要翻板，這個方法害死人。

5.加完MTT反應3－4h後，從培養箱取出96孔板的動作要輕柔，避免振盪結晶,使其滑落.你可以試著將96孔板傾斜30度角，然後用槍尖慢慢吸，有的細胞可以用排槍一起吸，有的則要耐心的一個個用槍頭吸，槍尖的力度和方向要保證每個孔都一致。不要讓槍頭接觸到孔底，且一旦傾斜孔板後就不要反復傾斜放平，這樣也會使結晶脫落。

6.用醫用的注射器加上針頭吸取液體的，吸取時要把板子斜放，沿著壁吸取就好了！這次MTT我用1ml針頭仔細吸培養液,覺得比其它方法可靠,一般不會吸走紫色結晶.

避免清除上清而改進的方法

由於一般可離心96孔板的離心機不好找。既使是貼壁細胞做MTT時，用DMSO溶解得到結果也不好，不是得不到預期結果就是可重復性差。

解決方法1:用以下文獻方法：周建軍等，評價抗癌物質活性的改良MTT方法，中國醫葯工業雜志，1993，24（10）：455-457

具體方法：

配三聯溶解液：10%SDS，5%異丁醇，0.012mol/LHCL，蒸餾水溶解。

三聯溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用雙蒸水溶解配成100ml溶液

操作：在培養板上加一定密度的細胞懸液，90ul／孔；如需給葯，則再於同時(懸浮細胞)或4h後(貼壁細胞)加入不同濃度的葯物10ul／孔，均設三復孔。另外，每塊板上另沒一個調零孔(只加培養液，不含細胞和葯物)。培養2d後，加入MTT溶液20ul／孔，繼續培養4h，然後加入上述三聯液100ul／孔，於37度放置過夜後，用酶標儀測各孔A570值。

優點：簡化操作，提高了可靠性。

解決方法2：日本同仁有一種新試劑CCK-8試劑， CCK-8試劑可用於簡便而准確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST–8[其化學名稱為：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲 染料（Formazan dye）。生成的甲 物的數量與活細胞的數量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。CCK-8試劑中已預先配入了進行細胞增殖和毒性分析所需的成分，無需再用緩沖液或培養基進行稀釋；同時，CCK-8試劑無需任何放射性同位素和有機溶劑。因此，無需特別的技巧，就可使每一位使用者准確、快速地得到重現性好的實驗結果。

★優 點

1、簡 便 只需一步即可得到結果

2、省 時 毋需預制，即開即用

3、安 全 毋需放射性同位素和有機溶劑

4、快 速 省去了溶解除沉操作

5、靈敏度高 靈敏度高於MTT

6、重現性好 步驟少；無損失；結果准確

就是比較貴，如果經費充足，用這個是不錯的。

★進行細胞增殖分析的使用方法:

1、接種細胞懸液100μl於96孔板內，預先置於37℃，5% CO 2飽和濕度培養箱內培養。

2、在每個孔內加入10μl的CCK-8試劑。

3、把培養板放在培養箱內培養1-4小時*。

4、在450nm波長處測定吸光度，參比波長為600nm或600nm以上。

解決方法3：使用MTS

解決方法4：

加入DMSO

在同一批實驗中最好不要更換DMSO。加DMSO前把孔中液體盡量棄干凈，沒有去掉上清直接加DMSO，一是沉澱會很難溶解.二培養液的顏色在檢測時也能被測到,會對最後結果造成影響。但前提是不能把細胞也一起吸掉，因為這樣帶來的誤差要遠遠大於培養液沒棄干凈帶來的誤差,所以要在保證細胞不被吸掉的前提下，盡量把培養液吸掉。如果培養液沒棄干凈，空白孔也要留有等量的培養液，這樣在檢測時可以盡量去除培養液的影響，DMSO的量也可為100ul或150ul.

1.加了DMSO後用振盪器輕輕振盪5－10min, 時間控制盡量嚴格一點,放置時間長了會影響結果,值會偏大,且結果不可信.

2.加入DMSO後可用排槍反復抽吸助溶，溶解後盡快檢測。如果實驗孔不多，建議用此法，因其比振盪溶解效果好。

3.或放入37度放孵箱15分鍾溶解結晶。

振盪是為了讓甲臢溶解，這樣才能更好的測量吸光度，振盪96孔板有專的振盪器，目的:扎破氣泡.有氣泡存在時,由於其對光的反射與折射作用(酶標儀的原理是通過測定特定波長透過樣品的吸光度推測樣品內特定物質的濃度),會導致結果偏移.

OD值的測定

至於測定波長的選擇是因顯色溶液而異的，對於DMSO，溶解後呈紫（紅）色，490nm有最大吸收值,而ATCC公司的MTT試劑盒用的不是DMSO，它的測定波長是570。(就如ELISA實驗選用OPD作底物測定波長是492，選用TMB顯色液則用450);而對於SDS和酸化異丙醇，則選用570nm，並且建議以655nm作為參考波長。

DMSO溶後10分鍾內測，越放顏色越深，而SDS做為溶解液測吸收光值，其值可在三天內保持不變.

細胞密度偏大測出的吸光度也會偏大，細胞密度小吸光度也會偏小；另外跟細胞狀態也有關系，細胞狀態不好的話，吸光度值也會低的；細胞數目少，或者是培養的時間短，OD值也會偏低。如果各個孔的孔間差異性特別明顯的話說明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很可能是細菌污染。

復孔直接的OD值差別一般應在0.1－0.15，差別太大考慮：1.接種細胞數不均勻，或是接種太多，應保證每孔一致，一般是每孔1000－10000個。可以細胞細胞計數後，加入細胞懸液，再補培養基到預定體積，並輕輕吹打幾次，使細胞均勻分布，這樣比直接加入預定體積的細胞懸液要好，接種時應加含血清培養基。2.貼壁時間：18－24h，如果不夠，未懸浮的細胞會被吸掉。

一般為了實驗的准確，每個濃度可以設5－6個復孔，可以最後統計時，可以除去一個最高值和一個最低值，或者除去其中數據離譜的值，這些離譜數字的出現與細胞是否污染，細胞是否在培養期間死去，是否培養液蒸發過多，加MTT液是否准確，在37℃，5％二氧化碳培養箱中孵育時間是否一定（1－4小時）等有密切的關系，當然測定OD值的儀器工作狀態是否正常也非常重要！(一般開機預熱20min)。

MTT方法的吸收度在0.2～0.8之間誤差較小。這和分析化學中的lambert-beer定律有關， 對朗伯-比爾定律的偏離在吸光光度分析中，經常出現標准曲線不呈直線的情況，特別是當吸光物質濃度較高時，明顯地看到通過原點向濃度軸彎曲的現象（吸光度軸彎曲)。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進行定量，將會引起較大的誤差。在吸光光度分析中，儀器測量不準確也是誤差的主要來源。任何光度計都有一定的測量誤差。這些誤差可能來源於光源不穩定，實驗條件偶然變動，讀數不準確等。

在光度計中，透射比的標尺刻度均勻。吸光度標尺刻度不均勻。對於同一儀器，讀數的波動對透射比為一定值；而對吸光度讀數波動則不再為定值。吸光度越大，讀數波動所引起的吸光度誤差也越大透射比很小或很大時，濃度測量誤差都較大，即光度測量最好選吸光度讀數在刻度尺的中間而不落兩端。待測溶液的透射比T在15%~65%之間，或使吸光度A在0.2~0.8之間，才能保證測量的相對誤差較小。當A=0.434(或透射比T=36.8%)時，測量的相對誤差最小。

其它的聲音：

1.最好用570nm波長的濾光片，因為MTT在這個波長的吸光度是峰值，換句話說靈敏度高。用其它波長的也有，一般是490nm，但我的經驗靈敏度降低一半。

2.我們用的BIO-TEK公司的ELx800,一般值在2以下都是可靠的,如果復孔之間值相差太大就要考慮是否是實驗過程中的誤差. 我曾經看到園子的有些帖子報道說OD值大概在0.2-1.2范圍內與活細胞數有較好的線性關系，但OD值在0.3-0.9范圍內可能更佳，若你的OD值不在這個范圍內則你實驗的細胞數可能不太合適，應調整你的細胞數。

邊緣效應

96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不養細胞，否則這四行的數據會偏高或偏低,96孔板在培養箱中，由於濕度不夠，而培養箱由於具有一定的溫度，由於溫度梯度使得邊緣的孔水分蒸發較快，導致培養基中各種成分濃度變化增大，導致細胞狀態不同。對於這種現象，要保證培養箱中的濕度，減少開關培養箱的次數和時間。解決方法:將孔板周圍的一圈孔全部不用，影響非常大，而且最外一圈一定要加水、PBS或者培養液，只要能防止蒸發就可以.

關於如何計算IC50

(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg 最大劑量

I:lg(最大劑量/相臨劑量)

P:陽性反應率之和

Pm:最大陽性反應率

Pn:最小陽性反應率

舉個例子：各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入

計算公式：

Pm=0.95

Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1

Xm=lg0.1=-1

lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025

IC50=0.00025

(2)Bliss法:自己查閱書籍

(3)IC50計算軟體，見下面附件

（4）自己用EXCEL做趨勢線來求IC50，關於LD50的方法與此相似！

（5）在線求IC50或EC50：http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm

結果統計學處理

所有數值以x±s表示，應用SPSS軟體進行方差分析，p<0.05時為相差顯著，p<0.01時為相差非常顯著。可以以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生線，專門公式求IC50。或計算抑制率。細胞死亡率%=OD對照組-OD實驗組/OD對照組

excel表中可以做兩兩比較的T-test,這個你可以參考一下；你的數據應該用多個樣本均數的T-test，方差分析也可。用的軟體是SPSS或者SAS。

孔板的重復利用:

培養板要用好的（最好進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。一般貼壁生長的細胞用重復利用的培養板效果不是很好，因為培養板表層在生產時塗有一層促進細胞貼壁的物質，在清洗後多半會失去。懸浮或是半懸浮生長的細胞還可以。建議不要用太多次，即使是進口的板子使用次數也不要超過3次,底值最好在測得值的1/3一下。

強烈建議培養板不要重復使用:1、泡酸是可以，但是泡完酸的板子很不利於細胞的生長，會出現帖壁不好，細胞生長緩慢等情況.2、這樣的板子消毒滅菌很不徹底，如果有萬一,則因小失大.3、重復用的板子洗不幹凈在培養過程中易出現雜質.

重復利用時

做法1：

洗凈後用2％NaoH浸泡4小時，再用1％稀鹽酸浸泡4小時，沖洗15遍，蒸餾水沖洗3遍，烘乾，UV照射過夜(紫外2小時以上消毒即可)

做法2:

泡酸2－4小時，老師讓我們別超過4小時，（普通的玻璃儀器是過夜）。撈出，沖洗干凈，烘乾後，UV 照射過夜。估計跟其他收集在一起，鈷60照射消毒.

做法3:

1.做完MTT後用大水流盡量將板沖凈，然後用洗衣粉水泡幾個小時（小心最好讓洗衣粉先化開）。2.用自來水沖凈洗衣粉水，倒扣晾乾.3.重鉻酸鉀加濃硫酸配成的酸液中浸泡過夜泡洗液(六小時以上即可)後自來水洗凈（20次左右）每個孔都要處理4.用去離子水沖洗3遍，雙蒸水沖洗3遍，烤乾5.超凈台中紫外線照射2個小時左右，就可以用了，不可以高壓。

做法4:

1、測完值的96孔板甩掉孔內培養液，放入超聲中超10-30分鍾，晾乾(或烘乾)備用。

此步驟可最大程度的洗去污垢及細胞。

2、每孔加入50-100ul的胰酶(0.05%)，我一般加60ul，加完胰酶後水平振盪96孔板以使胰酶均勻覆蓋於細胞表面，室溫下放置至細胞被消化脫落為止。假如你想消化快一點的話可將96孔板放到37度培養箱內(胰酶在37度時的活力最大)。

對於頑固貼附在壁上的細胞，此步驟最為有效。

3、甩掉胰酶，自來水下沖洗，晾乾(或烘乾)備用。

如果不烘乾就泡酸，那麼96孔板殘留的水分將稀釋酸液，長期以往泡酸的效果下降。

4、將晾乾的96孔板泡酸(中強酸)過夜，撈起後自來水下沖洗10遍；雙蒸水沖洗3遍。三蒸水沖洗3遍。烘乾備用。泡酸時特別注意時間不要太長了，否則板子變黃，影響最後的OD值的測定。

5、做實驗前，96孔板至少在紫外燈下照射30分鍾，但不能長期照射。紫外線長期照射可使板變黃，我的兩塊板放在超靜台上忘了拿出來，一直照了兩個星期，等我從超靜台上取出板已經變成黃色。

註：

1、在實驗中若你測得某一個孔的數值偏高，雖然有很多因素會導致數值偏高，但是如果是板底的污點引起的話你可以消除。拿出96孔板擦一擦值偏大孔的板底部，再測值。你會發現孔高的值又會到正常水平。因為咱們做實驗時手不可避免的接觸96孔板板底留下痕跡，這些痕跡就會使吸光度升高。

2、96孔板洗的次數多了，板底自然留下劃痕，這就會導致讀數的不均而影響實驗結果。你不妨在做實驗前測一次96孔板的值(此值為初值)，實驗測得的為後值。後值減去初值就接近實驗的真實值。