❶ 酶標儀原理_酶標儀使用說明
酶標儀的檢測原理
光是電磁波，波長100nm～400nm稱為紫外光， 400nm～780nm之間的光可被人眼觀察到，大於780nm稱為紅外光。人們只所以能夠看到色彩，是因為光照射到物體上被物體反射回來。綠色植物之所以是綠色，是因為植物吸收了光中的紅色光譜。酶標儀測定的原理是在特定波長下，檢測被測物的吸光值。
檢測單位：
光通過被檢測物，前後的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關系。
檢測單位用OD值表示， OD是optical delnsity（光密度）的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度， OD＝1og（1／trans），其中trans為檢測物的透光值。根據Bouger-amberT-beer法則，OD值與光強度成下述關系：
E＝OD=logΙ0/Ι其中E表示被吸收的光密度， Ι0 為在檢測物之前的光強度，Ι為從被檢測物出來的光強度。
OD值由下述公式計算：
E＝OD=C×D×E
C為檢測物的濃度
D為檢測物的厚度
E為摩爾因子
在特定波長下測定每一種物質都有其特定的波長，在此波長下，此物質能夠吸收最多的光能量。如果選擇其它的波長段，就會造成檢測結果的不準確。因此，在測定檢測物時，我們選擇特定的波長進行檢測，稱為測量波長。
但是每一種物質對光能量還存在一定的非特異性吸收，為了消除這種非特異性吸收，我們再選取一個參照波長，以消除這個不準確性。在參照波長下，檢測物光的吸收最小。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。
Anthos 酶標儀檢測值計算
儀器中的檢測器接收透過被檢測物的光能量，轉換成二進位數字信號，最大為4095。儀器定義沒有光源下的透光值為 0％，沒有檢測物的透光值為100％。則實際檢測中，檢測物的透光值均在 0％一100％之間。透光值
的計算如下：
T＝（Meas—Min）／（Max—Min）
其中T為透光值， Meas為檢測的二進位數值， Min為在 0％的情況下檢測的二進位數值， Max為在100％的情況下檢測的二進位數值，舉例如下：
MaX=3600 Mn=20 Meas＝30
T=（30-20）/3600-20)＝0．0028
OD＝1og（1/T）=1og（1/0.0028）=2.552
Anthos 酶標儀的中心定位
儀器會自動對酶標孔進行中心定位，中心定位是要消除酶標孔底的凸凹引起的厚薄不均伍茄差帶來檢測的不準確。在對每一個酶標儀進行檢測時，儀器其實要進行35個點的測量，選取最中間的5個點的均值為本孔的OD值。
光源的參照通道
參照通道是用來校準由於電壓不穩或燈泡磨損帶來的影響。
酶標儀的用途和其它提示
用於ELISA試劑的測定，廣泛用於各種實驗室，包括臨床實驗室。
質量控制
質量控制是試劑檢測的重要因素。請按照試劑說明書的要求進行質量控制腔皮。 空白校正
有一些試劑盒的說陰書將空白孔設置為空氣，其它大多數空白孔的設置是用試劑來設置的，請按照試劑盒的說明書要求進行。
檢測結果的解釋
由於有相當多的因素會影響檢測的結果，如不同的酶標板，檢測試劑的體積，都會造成OD值的不，因此，只有使用同一酶標板反應的試劑檢測結果才能比較和分析。對結果的臨床解釋請依照試劑盒的說明書進行。
酶標儀的使用注意事項
1、工作環境
酶標儀是一種精密的光學儀器，因此良好的工作環境不僅能確保其准確性和穩定性，還能夠延長其使用壽命。根據DIN VDE 0871條例，儀器應放置在無磁場和干擾電壓的位置。依據DIN 45 635 －19條例：
儀器應放置在低於40分貝的環境下。
為延緩光學部件的老化，應避免陽光直射。
操作時環境溫度應在15℃－40℃之間，環境濕度在15％－85％之間。
操作電壓應保持穩定。
操作環境空氣清潔，避免水汽，煙塵。
保持乾燥、干凈、水平的工作檯面，以及足夠的操作空間。
2、操作注意事項
酶標儀的功能是用來讀取酶聯免疫試劑盒的反應結果，因此要得到准確結果，試劑盒的使用必須規范。許多醫院在使用酶標儀之前是通過目測判斷結果，操作過程隨意性較大，在使用酶標儀後如果不能及時糾正操作習慣，會造成較大誤差。在酶標儀的操作中應注意以下事項：
使用加液器加液，加液頭不能混用。
洗板要洗納高幹凈。如果條件允許，使用洗板機洗板，避免交叉污染。
嚴格按照試劑盒的說明書操作，反應時間准確。
在測量過程中，請勿碰酶標板，以防酶標板傳送時擠傷操作人員的手。
請勿將樣品或試劑灑到儀器表面或內部，操作完成後請洗手。
如果使用的樣品或試劑具有污染性、毒性和生物學危害，請嚴格按照試
劑盒的操作說明，以防對操作人員造成損害。
如果儀器接觸過污染性或傳染性物品，請進行清洗和消毒。
不要在測量過程中關閉電源。
對於因試劑盒問題造成的測量結果的偏差，應根據實際情況及時修改參數，以達到最佳效果。
使用後蓋好防塵罩。
出現技術故障時應及時與廠家聯系，切勿擅自拆卸酶標儀。
酶標儀及洗板機選購指南
酶標儀（Microplate Reader）是對酶聯免疫檢測（ EIA）實驗結果進行讀取和分析的專業儀器。酶聯免疫反應通過偶聯在抗原或抗體上的酶催化顯色底物進行的，反應結果以顏色顯示，通過顯色的深淺即吸光度值的大小就可以判斷標本中待測抗體或抗原的濃度。 酶標儀廣泛地應用在臨床檢驗、生物學研究、農業科學、食品和環境科學中，特別在近
幾年中，由於大量的酶聯免疫檢測試劑盒的應用，使得酶標儀在生殖保健領域中應用越來越廣泛，同時促進了生殖健康技術水平提高 。
目前國內許多計生站系統開展了酶免檢測項目，如：乙肝五項、愛滋病檢測、優生優 育系列檢測、激素檢測等。過去多數採用目測方法，報出的結果缺乏科學的依據。例如：某弓形蟲檢測試劑盒中，臨界值規定為：陰性對照品的 OD 值×2.5，通過目測無法判斷標本孔的反應顏色是否超過臨界值。肉眼進行兩孔之間的顏色比較可能還行，但比較一孔的顏色是否超過另一孔顏色的2.5倍就不可能。
國內多家權威機構，如衛生部臨床檢驗中心和計劃生育系統等多次強調酶標儀的重要性，並要求酶聯免疫檢測試劑應使用酶標儀判讀，酶免試劑的質控也應使用酶標儀，並提供酶標儀測定的原始數據，而各廠家的試劑盒說明書沒有是讓用目測的。同時酶免檢測的 項目往往是一些實質性的感染和病變（如：肝炎、愛滋病、優生優育等），判讀更要求嚴謹，由誤診引起的糾紛很難處理。另外，住院手術病人術前的丙肝、愛滋等 EIA 試劑檢測是避免因輸血引起感染引發的醫療事故糾紛的必要手段，正逐漸被許多單位所採用。
我國免疫診斷方法主要有如下三種：酶免（EIA）、放免（RIA）和發光，在市場上的情況如下：
方法 所處市場周期
放免 衰退期
酶免 成長期
發光 進入期
放免技術由於試劑的污染和有效期等問題在國際和國內市場逐漸被淘汰，而化學發光試劑和設備比較昂貴，使得其在國內的普及特別在計生系統普及需要較長時間，EIA 技術穩定，試劑價格合理，供應充，酶免技術在中國市場處於成長期，因此購買酶標儀正合適宜。 尤其要提到的是，在中國的計劃生育和婦幼保健系統配備酶標儀已經迫在眉睫。早在幾年以前, 世界衛生組織已建議對孕婦進行 TORCH五項常規篩查，但是遺憾的是由於缺乏酶標儀和洗板機等設備，RCH的檢測在中國還未能普遍開展。TORCH 感染在圍產醫學中稱為TORCH綜合症，由於孕婦, 胎兒和新生兒都易被感染, 它已受到全世界婦產科和兒科的極大重視。妊娠期感染不僅危害母體，往往還可對胎兒和新生兒產生嚴重影響。通過胎盤可引起子宮內感染而導致流產、早產、死胎或胎兒生長遲緩和畸形，通過產道和母乳可引起新生兒感染。如累及神經系統可造成不同程度的智力障礙以及各種癱瘓、失聰、失明等嚴重後遺症，影響人口素質，因而 TORCH 感染與優生優育有極為重要的關系。因此，RCH（IgG和gM）檢查通常也稱為優生優育十項檢查。目前，TORCH的檢測方法主要有放免（RIA）和酶免(EIA)。由於放免方法需要特殊儀器，且有放射危害，目前正被酶免（EIA）方法取代。EIA方法具有特異性強，靈敏度高，簡單快速，成本低等優點，只要配備有酶標儀和其他相應的設備 ，多數普通實驗室均可方便地開展 。 很顯然, 盡快在計生系統普及酶標儀等設備是一個迫切的需求。
這項工作的落實將有助於提高診治水平，降低母嬰發病率，從而提高整個國民的健康素質。目前市場上提供的EIA試劑越來越多，如：T3、T4、TSH、TORCH 系列、不孕系列、各種癌症標志物、傷寒、副傷寒等，另外通過母嬰傳播的性傳播疾病(如淋病、梅毒、HIV)和肝炎（如HBV、HCV)，以及胎兒的抗體，新生兒TSH的測定，疫苗反應等，市場上也都有成套 EIA 試劑盒供應。使用酶標儀有利於拓展檢測項目，提高檢測水平，其社會效益和 經濟效益並舉。
酶標儀單、雙波長檢測的比較
發布時間04年05月10日 13時59分
鄒榮良
在用酶聯免疫法測定抗原或抗體時，不論是定量試驗還是定性試驗都要求使用酶標儀進行測定。一般的酶標儀在測定中均有單波長和雙波長的模式，並且採用的都是垂直光路。但在日常工作中有時會不太重視單波長和雙波長的選擇，對使用單、雙波長給測定結果帶來的較大差異也不很了解，並且實際工作中也出現了使用單波長檢測導致抗HCV部分弱陽性的漏檢。因此，本人就酶標儀在選擇單、雙波長使用方面談談個人的體會，供同道參考。
一 材料和方法
1.材料 由上海科華公司提供的乙肝表面抗原測定試劑盒；eppendorf 20-20ul的移液器。
2.儀器 上海科華公司的ST-360酶標儀和BIO-RAD 550酶標儀。
3.方法 底物液配製：底物液A、B各5ml混合，加入微量酶標記物，再加入5ml終止液，呈微黃色，混勻待用；利用上海科華公司提供的乙肝表面抗原試劑盒的酶標板，用94孔中准確加入150ul配製好的上述底物液，另2孔中加入150ul已終止的空白底物液作空白。在BIO-RAD 550酶標儀上分別進行450nm單波長和450nm及655nm（無630nm）的雙波長檢測，在ST-360上分別進行450nm單波長和450nm及630nm的雙波長檢測吸光度各兩次。
二 結果
1.分別對所得結果進行統計，發現單、雙波長測定結果有較大的差異，雙波長測定結果的CV值遠小於單波長測定，結果見表1。
2.對ST-360兩次重復測定結果進行分析，結果基本一致，見表2。
表1 酶標板吸光度在兩台酶標儀上的測定統計結果
表2 ST-360酶標儀兩次吸光度測定統計結果
三 討論
1.酶標儀與分光光度計、自動生化分析儀等的吸光度測定有所不同，一般分光光度計是水平光路，而酶標儀則是垂直光路，但測定原理相同，都是使用朗伯-比耳定律，測定的都是樣本的吸光度。垂直光的特點是標本吸光度受液體濃縮或稀釋的影響小，不足之處是受被測樣本液面是否水平、酶標板透光性、孔底是否平整等的影響較大。
2.酶標儀在用單波長測定吸光度時，除受到測定干擾（樣本的濁度、干擾色等）和電路干擾（包括噪音、漂移、電壓等）等因素外，受液體表面張力的影響也很大。在檢測過程中，由於液體表面張力的作用，液體的表面不是一個平面，而是形成一個凹面，從側面看似凹透鏡，這樣不可避免會影響光路的正常通過。由於凹液面的影響，光線在通過液體時，除正常被液體吸收一部分外，尚有部分被折射和反射（如光線通過凹透鏡那樣），影響吸光度的檢測。而酶標儀使用的又是通過光導纖維傳播的點光源，如果每次能在同一部位檢測，吸光度的重復性將得到保證，但由於機械運動等造成的誤差，不可能保證每孔都在相同部位被檢測，因此造成了孔與孔之間有一定的差異。結果見表1，整塊板單波長檢測的CV在3%以上，吸光度最高值和最低值的相對誤差達17%以上。
3.在雙波長測定中，減少了測定干擾和電路干擾，因此測定結果明顯好轉，結果見表1，整塊板樣本的CV在2%以下。ST-360在進行穩定性觀察中，如表2所示，兩次檢測結果基本一致，這表明ST-360的穩定性較好。同時，從表1也可以看到，科華公司生產的ST-360與BIO-RAD 550的檢測結果一致，兩者的檢測性能基本相同。
4.由於液體表面張力的不同，導致單波長測定時的誤差較大。並且用不同的洗滌劑會影響到最後加入底物和終止液後的液面情況，用加入表面活性劑的洗滌液清洗後，形成的液面更凹，對單波長檢測的影響更大，並且與表面活性劑的濃度成正比。而且中性蒸餾水洗滌後，單、雙波長檢測的結果基本一致。
5.在酶聯免疫法測定抗原抗體中，由於所使用的底物不論是鄰苯二胺（OPD）-H2O2，還是四甲基聯苯胺（TMB）-H2O2，顯色終止後，在630nm和655nm處的吸光度值都只有吸收峰處（492nm/450nm）吸光度值的1%以下，因此，利用雙波長檢測，不會影響檢測靈敏度。建立在進行酶聯免疫檢測時，酶標儀比色應該首選雙波長。這樣可以提高臨界值處標本的分析正確度，減少實驗誤差。
❷ 乙肝表面抗原（發光法）
乙肝表面抗原由於檢測的方法不同，判斷結果的參考值有所不同：
1、ng/ml表示法。如果乙肝表面抗原正常值(ng/ml)大於0.18ng/ml，那麼就表示該患者體內有乙肝病毒，乙肝表面抗原而被視為陽性結果，反之被認為是陰性。
2、S/CO值表示法。如果乙肝表面抗原正常值(S/CO)大於1S/CO，那麼就表示該患者體內有乙肝病毒，乙肝表面抗原而被視為陽性結果，反之被認為是陰性。
3、S/N值表示法。AXSYM免疫分析儀得到S/N的值，如果乙肝表面抗原正常值(S/N)大於2.1S/N，那麼就表示該患者體內有乙肝病毒，乙肝表面抗原而被視為陽性結果，反之被認為是陰性。
4、美國雅培化學發光法，參考值：0-0.05；在0-0.05之間為陰性，超過為陽性。
由上述各種檢測方法的參考值可以看出你的表面抗原11357無論是那種檢測方法，都高出很多是為陽性結果。但表面抗原滴度高，不一定肝臟損害就嚴重，還需要進一步檢查肝功、乙肝病毒DNA、B超等，根據結果對病情作出綜合判斷，從而決定下一步治療措施。