『壹』 自噬相關研究如何做
你初步研究思路是什麼呢，是觀察自噬情況嗎，還是一個整體的自噬研究呢，先對細胞進行自噬誘導或抑制，然後對自噬過程進行觀察和檢測。自噬檢測方法也很多種，是傳統的WB還是通過GFP-LC3呢？呵呵，先說說你的想法吧。
『貳』 自噬2021-08-03
1、 自噬的定義： 細胞自噬是真核生物中進化保守的對細胞內物質差轎進行周轉的重要過程。該過程中一些損壞的蛋白或細胞器被雙層膜結構的自噬小泡包裹後，送入溶酶體(動物）或液泡（酵母和植物）中進行降解並得以循環利用。
2、 自噬的過程： 從一張圖片開始：
步驟1：細胞接受自噬誘導信號後，在胞漿的某處形成一個小的類似「脂質體」樣的膜結構，然後不斷擴張，但它並不呈球形，而是扁平的，就像一個由2層脂雙層組成的碗，可在電鏡下觀察到，被稱為Phagophore，是自噬發生的鐵證之一。
步驟2：Phagophore不斷延伸，將胞漿中的任何成分，包括細胞器，全部攬入「碗」中，然後「收口」，成為密閉的球狀的autophagosome，我把它翻譯為「自噬體」。電鏡下觀察到自噬體是自噬發生的鐵證之二。有2個特徵：一是雙層膜，二是內含胞漿成分，如線粒體、內質網碎片等。
步驟3：自噬體形成後，可與細胞內吞的吞噬泡、吞飲泡和內體融合（加了個「可」字，意思是這種情況不是必然要發生的）。
步驟4：自噬體與溶酶體融合形成autolysosome，期間自噬體的內膜被溶酶體酶降解，2者的內容物合為一體，自噬體中的「貨物」也被降解，產物（氨基酸、脂肪酸等）被輸送到胞漿中，供細胞重新利用，而殘渣或被排出細胞外或滯留在胞漿中。
3 、自噬的特性：
1）自噬是細胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎對細胞不利。事實上，細胞正常情況下很少發生自噬，除非有誘發因素的存在。這些誘發因素很多，也是研究的熱門。既有來自於細胞外的（如外界中的營養成分、缺血缺氧、生長因子的濃度等），也有細胞內的（代謝壓力、衰老或破損的細胞器、折疊錯誤或聚集的蛋白質等）。由於這些因素的經常性存在，因此，細胞保持了一種很低的、基礎的自噬活性以維持自穩。
2）自噬過程很快，被誘導後8min即可觀察到自噬體（autophagosome）形成，2h後自噬溶酶體（autolysosome）基本降解消失。這有利於細胞快速適應惡劣環純慶粗境。
3）自噬的可誘導特性：表現在2個方面，第一是自噬相關蛋白的快速合成，這是准備階段。第二是自噬體的快速大量形成，這是執行階段。
4）批量降解：這是與蛋白酶體降解途徑的顯著區別
5）「捕獲」胞漿成分的非特異性：由於自噬的速度要快、量要大，因此特異性不是首先考慮的，這與自噬的應急特性是相適應的。
6）自噬的保守性：由於自噬有利於細胞的存活，因此無論是物種間、還是各細胞類型之間（包括腫瘤細胞），自噬都普遍被保留下來（誰不喜歡留一手呢？）。
4 、自噬過程的調控： 從上面總結的自噬特點中可以看出，自噬這一過程一旦啟動，必須在度過危機後適時停止，否則，其非特異性捕獲胞漿成分的特性將導致細胞發生不可逆的損傷。這也提醒我們在研究自噬時一定要動態觀察，任何橫斷面的研究做鎮結果都不足以評價自噬的活性。目前，已經報告了很多因素能誘導細胞發生自噬，如飢餓、生長因子缺乏、微生物感染、細胞器損傷、蛋白質折疊錯誤或聚集、DNA損傷、放療、化療等等，這么多刺激信號如何傳遞的、哪些自噬蛋白接受信號、又有哪些自噬蛋白去執行等很多問題都還在等待進一步解答中。
關於傳遞自噬信號的通路目前比較肯定的有：
抑制類
1）Class I PI3K pathway（PI-phosphatidylinositol，磷脂醯肌醇）與IRS (Insulin receptor substrate)結合，接受胰島素受體傳來的信號（血糖水平高抑制自噬）
2）mTOR pathway（mammalian target of rapamycin）
mTOR在人類中的同源基因是FRAP1（FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1），是一個絲/蘇氨酸蛋白激酶。能接受多種上游信號，如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受營養和能量的變化,rapamycin是最典型最常用的自噬激動劑.
激活類
1）Class III PI3K
結構上類似於Class I PI3K，但作用相反。3-MA是Class III PI3K的抑制劑,因此3-MA可以作為自噬的抑制劑.
5 、自噬的研究方法： 正常培養的細胞自噬活性很低，不適於觀察，因此，必須對自噬進行人工干預和調節，經報道的工具葯有：
（一）自噬誘導劑
1）Bredeldin A /Thapsigargin / Tunicamycin ： 模擬內質網應激
2
）Carbamazepine/L-690，330/ LithiumChloride（氯化鋰）： IMPase 抑制劑 （即Inositolmonophosphatase，肌醇單磷酸酶）
3
）Earle's平衡鹽溶液： 製造飢餓
4
）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3KPathway抑制劑
5
）Rapamycin：mTOR抑制劑
6
）Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑
（二）自噬抑制劑
1
）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑
2
）Bafilomycin A1：質子泵抑制劑
3
）Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumenalkalizer（溶酶體腔鹼化劑）除了選用上述工具葯外，一般還需結合遺傳學技術對自噬相關基因進行干預：包括反義RNA干擾技術（Knockdown）、突變株篩選、外源基因導入等。
細胞經誘導或抑制後，需對自噬過程進行觀察和檢測，常用的策略和技術有：
1）觀察自噬體的形成
由於自噬體屬於亞細胞結構，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特徵為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體（AV1）的特徵為：雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體（AV2）的特徵為：單層膜，胞漿成分已降解。（autophagic vacuole，AV）
2）在熒光顯微鏡下採用GFP-LC3等融合蛋白來示蹤自噬形成：(常用)
GFP-LC3單熒光指示體系：由於電鏡耗時長，不利於監測（Monitoring）自噬形成。我們利用LC3在自噬形成過程中發生聚集的現象開發出了GFP-LC3指示技術：無自噬時，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當於一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。雙熒光指示體系：漢恆生物科技（上海）有限公司已開發出用於表達mRFP-GFP-LC3融合蛋白的病毒產品。mRFP用於標記及追蹤LC3，GFP的減弱可指示溶酶體與自噬小體的融合形成自噬溶酶體，即由於GFP熒光蛋白對酸性敏感，當自噬體與溶酶體融合後GFP熒光發生淬滅,此時只能檢測到紅色熒光。
3）利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成。
自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3-I）會酶解掉一小段多肽，轉變為（自噬體）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。
(Note：LC3抗體對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。方法2和3需結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響)
4) 利用Western Blot檢測p62蛋白來評價自噬以及自噬流的強弱:起初自噬所降解的底物被認為是隨機的,但是後來的研究表明有些蛋白是選擇性降解的,在這些蛋白之中研究的最為透徹的是p62蛋白，p62蛋白水平的多少與自噬流的強弱有著反比例關系。
5）MDC或者Cyto-ID染色：包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬於非特異性的。
6）Cell Tracker TM Green染色：主要用於雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬於非特異性的。
6、自噬體的發生： 目前認為，自噬體的膜不是直接來源於高爾基體或內質網，而是在胞漿中重新生成的，但具體的機制尚不清楚。當beclin-1被活化後，胞漿中先形成很多個membrane source（自噬體膜發生中心），在它們不斷擴展的過程中(phagophore到autolysosome)，VMP1蛋白由內質網和高爾基體轉位到自噬體膜上（VMP1又叫TMEM49，已知唯一與自噬有關的 跨膜 蛋白），同時，MAP1-LC3由胞漿型（即LC3-I）轉位到自噬體膜（即LC3-II），LC3這一轉變過程可被Western Blot和熒光顯微鏡檢測到，現已成為監測自噬體形成的推薦方法。
7、自噬與細胞死亡的關系：
有必要說明一下的是，細胞死亡是一個非常復雜的過程，為了研究方便，需進行分類，但我們思考時不要局限於這些 人為的分類，而應注重於現象本身來研究其背後的機制。
一直以來人們從不同角度、用不同方法來觀察細胞的死亡，並把細胞的死亡方式分為2類：壞死和凋亡，因為兩者有著明顯的區別，其中最主要的區別之一就是細胞膜的通透性——壞死細胞的細胞膜喪失了完整性，內容物被釋放出來，染料可自由進入細胞，而凋亡細胞保持完整，無內容物釋放，染料也被排斥。很多實驗亦根據這一原理來設計以區分壞死和凋亡，這將在後面一一介紹，如同剛剛說明的那樣，這些實驗只能說明細胞膜的通透性（必要條件，不是充分必要條件），而不能用來證實壞死細胞或凋亡細胞。一般認為壞死是被動的，不可控的，而凋亡是主動的，可控的。為了強調這一點，凋亡被定義為程序性細胞死亡（program celldeath，PCD）。但無論是壞死還是凋亡，都是一個過程，是需要時間的（尤其是凋亡，從啟動到完成，細胞要執行很多反應），而且細胞死亡後都有「屍體」。
在研究自噬與凋亡的關系時，人們發現細胞死亡前胞漿中存在大量的自噬體或自噬溶酶體，但這樣的細胞缺乏凋亡的典型特點，如核固縮（pyknosis）, 核破裂（karyorhexis）、細胞皺縮（shrinkage）、沒有凋亡小體的形成等，被稱為自噬樣細胞死亡（autophagic celldeath，ACD），它是一種新的細胞程序性死亡，為了與凋亡區別，被命名為Type II cell death，相應的，凋亡為Type I cell death，壞死為Type III cell death。盡管這樣，但對於自噬是否是細胞死亡的直接原因目前還存在很大的爭議。到底是Cell death by autophagy（自噬引起死亡）還是Cell death with autophagy（死亡時有自噬發生，但不是直接原因）？對此，自噬研究領域「大牛」級專家Levine Beth在一篇nature的Review中表達了自己的觀點。由於在形態學上2者無明顯區別，但通過阻斷自噬，觀察細胞的結局可區分開來：Cell death by autophagy細胞存活，而Cell death with autophagy細胞死亡。
8、自噬與腫瘤的關系：
與凋亡（在腫瘤細胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被優先保留的。無論是腫瘤細胞還是正常細胞，保持一種基礎、低水平的自噬活性是至關重要的。因為細胞中隨時產生的「垃圾」（破損或衰老的細胞器、長壽命蛋白質、錯誤合成或折疊錯誤的蛋白質等等）都需要及時清除，而這主要靠自噬來完成，因此， 自噬具有維持細胞自穩的功能 ；如果將自噬相關基因突變失活，如神經元會發生大量聚集蛋白，並出現神經元退化。同時，自噬的產物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物質又可為細胞提供一定的能量和合成底物，可以說， 自噬就是一個 「 備用倉庫 」 。如Atg-5缺陷的小鼠在出生後喝上第一口奶之前就會餓死。更重要的是，自噬活性可在代謝應激（飢餓、生長因子缺乏、射線、化療等）時大大增強，表現為胞漿中迅速涌現大量自噬體，這一現象被稱為「自噬潮」（autophagic flux），廣泛用於自噬形成的監測。自噬潮為細胞度過危機提供了緊急的營養和能量支持，有利於細胞的存活。
鑒於自噬的上述作用，自噬可為腫瘤細胞帶來幾大好處：
1
）腫瘤細胞本身就具有高代謝的特點，對營養和能量的需求比正常細胞更高，但腫瘤微環境往往不能如意，如腫瘤發生初始期到血管發生之前、腫瘤長大發生血管崩塌時、腫瘤細胞脫離原發灶遊走時等都會出現營養不足或供應中斷，而此時提高自噬活性可以有助於度過這一危機。
2）當化療、放療後，腫瘤細胞會產生大量的破損細胞器、損壞的蛋白質等有害成分，而此時提高自噬活性可及時清除這些有害物質，並提供應急的底物和能量為修復受損DNA贏得時間和條件。由於自噬減少了腫瘤細胞在代謝應激時發生壞死的機會，而對於腫瘤細胞群體而言，需要一部分細胞發生壞死，以引發適度的炎症（有利於血管的長入、吸引免疫細胞分泌生長因子等）。研究發現，很多類型的腫瘤在代謝應激時會「組成性」活化PI3K信號以抑制自噬（由於凋亡通路已受阻，抑制自噬會促進壞死），但具體機制尚不清楚。
自噬與腫瘤的關系可能是雙重的。①對不同的細胞，自噬的作用可能不同。②相同的細胞在不同的外部因素作用時，自噬的作用可能不同。③在腫瘤發生發展的不同階段，自噬的作用可能不同。腫瘤生長的早期階段自噬增強，是由於此時腫瘤的血管化作用不足，癌細胞的營養供給有限，需要通過自噬為自身提供營養。腫瘤進入發展階段後基因變異積累，使包括 Beclin 1在內的眾多抑癌基因失活，自噬活力降低。④對單個細胞和對整個腫瘤阻滯的作用可能不同。自噬功能不全的細胞易於壞死，但是壞死組織產生的細胞因子（包括部分生長因子）反而會促進腫瘤的生長。上述各種假設均有待證實。腫瘤為細胞分化障礙性的疾病已得到肯定，但自噬在腫瘤細胞的分化抑制過程中起著什麼樣的作用，自噬水平提高是抑制分化甚至導致去分化還是促進分化等問題尚未解決。
9、在研究自噬相關蛋白時，需對其進行定位。由於自噬體與溶酶體、線粒體、內質網、高爾基體關系密切，為了區別，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位：
Lamp-2：溶酶體膜蛋白，可用於監測自噬體與溶酶體融合。
LysoTrackerTM探針：有紅或藍色可選，顯示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito：載體，轉染後表達一個融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質定位信號），可用來檢測線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）。
MitoTracker探針：特異性顯示活的線粒體，熒光在經過固定後還能保留。
Hsp60：定位與線粒體基質，細胞死亡時不會被釋放。
Calreticulin（鈣網織蛋白）：內質網腔
Note：這些蛋白均為胞漿蛋白，爬片或胰酶消化的細胞在做免疫熒光前需先透膜（permeabilize），可採用0.1%SDS處理
自噬與細胞死亡經常需一起考慮，下面介紹一些檢測細胞死亡的方法：
1）△ψmdissipation（線粒體跨膜電位的消失）：TMRM發紅色熒光，DiOC6（3）發綠色熒光。
2）Phosphatidylserine Externalization（磷脂醯絲氨酸外翻）：Annexin V-FITC（綠色）染細胞膜。
3）檢測線粒體產生的ROS：無熒光的HE（hydroethidine，氫化乙啶）可被ROS氧化為EthBr（ethidium bromide，溴乙啡啶），發紅色熒光。NAO（nonylacridine orange，烷化吖啶橙，可發熒光）能與非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反應而失去熒光。
4）線粒體IMS蛋白的釋放：AIF，細胞色素c，分別用熒光二抗染色。
5）Capase 3a 染色：用熒光二抗染色，胞漿彌散分布。
6）細胞膜完整性檢測：DAPI（藍色）、Hoechst 33342或PI（紅色）染核。胞膜完整的細胞（活細胞和早中期凋亡細胞）排斥，可聯用annexin V。
10、如何用實驗區分Cell death by autophagy和Cell death with autophagy？
第一步：利用上述方法證實細胞死亡
第二步：證實細胞死亡前發生了自噬
第三步：在形態學上區別開「自噬樣死亡」與凋亡
第四步：利用遺傳學手段（反義RNA干擾Knockdown掉Atg基因或hVps34）或工具葯抑制自噬
第五步：細胞存活則為Cell death by autophagy，反之，細胞死亡則為Cell death with autophagy。
自噬的抑制根據自噬形成的過程，自噬的抑制也分為不同的階段，包括自噬的起始階段，自噬泡和溶酶體融合階段，以及溶酶體內的降解階段。目前常用的一些抑制葯物如下：
1）對自噬體形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制劑（如3-MA, Wortmannin，LY294002等），這些葯物均可干擾或阻斷自噬體形成。3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）是磷脂醯肌醇3激酶的抑制劑，可特異性阻斷Autophagy中自噬體的形成，被廣泛用作Autophagy的抑制劑。另外，渥曼青黴素（Wortmannin）、LY294002 也可用作Autophagy的抑制劑。
2）對自噬體與溶酶體融合的抑制：對自噬體與溶酶體融合過程進行阻斷也能起著抑制自噬的作用，這些葯物有巴伐洛黴素A1、長春鹼、諾考達唑等。巴伐洛黴素A1（Bafilomycin A1）是一種來源於灰色鏈黴菌的大環內酯類抗生素，分子式C35H58O9，是空泡型H+-ATP酶的特異性抑制劑，具有抗菌、抗真菌、抗腫瘤等作用。當突觸小泡經歷胞外分泌時，巴伐洛黴素A1可以避免小泡重新酸化。有研究表明，在已發生自噬的腫瘤細胞中加入巴伐洛黴素A1，可使蛋白降解被抑制，自噬體增多而自噬溶酶體數目減少，並且自噬體中的酸性磷酸酶的活性也明顯降低，從而證明其阻斷了自噬體與溶酶體的融合過程。這種阻斷是可逆的，在去除了葯物作用後，自噬體仍可以與溶酶體融合形成自噬溶酶體，繼續自噬進程。
3）對溶酶體降解的抑制:自噬體與溶酶體融合後最終被溶酶體中的水解酶水解，它首先經過囊泡酸化，達到所需的PH值後經多種蛋白酶作用使囊內容物降解，降解產物在細胞內再循環利用。對溶酶體的降解進行抑制，使得被降解的囊泡內容物大量蓄積於溶酶體內，而不能釋放出來進入細胞內再循環利用，這也同樣起著抑制自噬的作用。因此，蛋白酶抑制劑，如E64d、Pepstatin A等，在抑制溶酶體降解的過程中發揮著自噬抑制劑的作用。E64d和Pepstatin A均屬於蛋白酶抑制劑，二者以1：1的比例聯用可以抑制自噬。有研究表明，在結腸癌細胞系中聯用E64d及Pepstatin A，可明顯抑制溶酶體的降解從而阻斷自噬的進展，而自噬體的形成並沒有受到明顯影響。
11 、自噬領域的大牛們：
1）YoshinoriOhsumi博士。日本科學家，克隆了第一個酵母自噬基因Atg1以及LC3，主要成果在酵母模型下自噬研究；
2
）Daniel J. Klionsky博士。美國科學家，主要成果在酵母模型的自噬研究。最早在《Science》上發表綜述介紹自噬，2005年創辦了第一本自噬雜志《Autophagy》；2007年舉辦了第一次自噬國際會議，為自噬的宣傳做了大量工作。
3
）Noboru Mizushima博士。日本科學家，2001年主要報道了Atg5的功能，被認為是哺乳動物分子機制研究的第一環，以及參與克隆自噬標志物LC3，而且制備了一些ATG基因敲除老鼠以及LC3轉基因老鼠；
4
）Beth Levine博士。美國科學家，首先克隆了第一個哺乳動物自噬基因Beclin 1；
5
）Guido Kroemer博士。法國科學家，是細胞凋亡和死亡領域中引用率第一的科學家。在細胞凋亡研究中作出了卓越貢獻而且涉獵及其廣泛。目前也從事自噬研究，例如p53，Bcl2家族與細胞自噬。
6
）Tamotsu Yoshimori博士。日本科學家，2000年克隆了目前廣泛使用的自噬標志物LC3文章的通訊作者，而且也參與了2010年ATG5機制研究，是通訊作者之一。在方法學上也有關鍵貢獻。目前主要研究ATG14和ATG16。值得注意的是，上述三位日本科學家合作緊密，克隆了目前大部分的ATG基因，經常共享文章通訊作者。
7
）Patrice Codogno博士。法國科學家，2000年首先證實了PI3K信號通路在自噬的作用，I型抗自噬，III型促自噬，是自噬信號通路的開拓者。
8
）Ana Maria Cuervo博士。美國科學家，是分子伴侶自噬的開拓者。
9
）David Rubinsztein博士。英國科學家，2004年首次報道了mTOR與自噬的關系，抑制mTOR促進自噬。目前利用rapamycin誘導自噬成為經典模型之一。2010年Nature的報道首次證實了自噬對mTOR的負反饋調節。
12 、自噬信號通路：
1 ） KEGG
2 ） Abcam
3 ） CST
4) Enzo
13、我在做自噬課題中的一些心得：
自噬小體的增多有兩種可能：一是形成增加即自噬被誘導；另外一種是自噬體成熟受抑即自噬體不能和溶酶體結合。該怎麼來判斷呢？
自噬體增多，也就是「自噬潮」出現的原因一是形成增多，二是與溶酶體融合受阻（如使用了氫化氯喹或氯喹，另外，溶酶體的酶抑制劑和質子泵抑制劑的使用亦有可能影響溶酶體與自噬體或異噬泡的融合），使自噬體不能降解而積聚，這種積聚造成的自噬體增多的效應要大於自噬體誘導劑效應的數倍之多。
鑒於這樣的原因，單純的GFP-LC3熒光斑點增多不足以作為自噬激活的證據，可聯用多個方法來判斷：
1
）加用自噬體與溶酶體融合的抑制劑，如氯喹，觀察自噬潮的變化。
2
）或加用LC3和溶酶體示蹤物在熒光顯微鏡下觀察共定位情況。
3
）或Knockdown掉LAMP-2基因（溶酶體膜蛋白）。
4
）檢測胞漿長壽蛋白的降解。
WesternBlot
檢測LC3時除了上述的原因外，還有幾個需考慮到的地方：
1
）抗體的親和力：有報道認為LC3抗體對II型LC3的親和力較高
2
）結合於自噬體內層膜的LC3-II在與溶酶體結合後被降解。
3
）自噬過程很快，一個自噬體從產生到降解僅需2~3個小時或更短，其中自噬體形成階段更迅速，數分鍾即可完成，而溶酶體降解階段耗時相對較長。因此，設置多個檢測時間點（time frame）是非常重要的。