紫外分析方法驗證

1. 紫外分光光度法的驗證內容和要求

驗證內容？？可否理解為能做什麼？
一般來說，用紫外分光光度計來檢測，都是測的微量或痕量離子的含量（一般是濃度），一般其測定需要藉助顯色劑或退色劑。測定時首先需要配標准溶液，然後測待測樣品，得到的吸光度值在標准曲線上查找得到對用的濃度。
要求？檢測的要求還是被測物的要求？
監測的時候，一般需要先校正光度計，然後用空白走基線，然後才能開始測定。測定的時候需要有穩定的電壓，所以很多時候需要穩壓器。
被測物：一般要求被測物中離子的含量不要太高，一般到g/L就足夠大了，據我所知，常被監測的濃度范圍是ppm或ppb級的。被測物最好不要有太多雜質，不然會干擾測定的，所以測實際樣品是一般需要預處理；最好不要有顏色，這樣必定會干擾測定；一定不能有固體！

2. 如何驗證紫外線的存在

紫外線的最大特點是熒光效應
所以，可以讓光照射熒光物質看看能否發光來檢測光線中有沒有紫外線。
順便介紹下紫外線的發現就能更詳細的明白如果驗證紫外線的存在
1801年的一天，有一位研究太陽光譜的科學家突然想要了解太陽光分解為七色光後有沒有其它看不見的光存在。當時他手頭正好有一瓶氯化銀溶液。人們當時已知道，氯化銀在加熱或受到光照時會分解而析出銀，析出的銀由於顆粒很小而呈黑色。這位科學家就想通過氯化銀來確定太陽光七色光以外的成份。他用一張紙片醮了少許氯化銀溶液，並把紙片放在白光經棱鏡色散後七色光的紫光的外側。過了一會兒，他果然在紙片上觀察到醮有氯化銀部分的低片變黑了，這說明太陽光經棱鏡色散後在紫光的外側還存在一種看不見的光線，這位科學家把這種光線稱為紫外線。
這位科學家就是里特，1776年12月16 日，里特誕生於德國的西里西亞。小時候因家境貧寒，沒有念過幾年書。14歲時就去一家葯店當了學徒。在學徒期間，里特貪婪地閱讀了許多書籍，懂得了不少化學和物理學知識。憑著刻苦的自學，20歲那年，他考進了耶拿大學，後來在化學和電生理學方面作出的不少貢獻。1799年，他用伽伐尼電池成功地從硫酸銅溶液中電解出銅，由此得出靜電與伽伐尼電之間是一致的結論。他還正確指出產生伽伐尼電流的原因是伽伐尼電池內部發生了化學反應，從而成為正確解釋伽伐尼電流成因的第一個人。1802年，里特製作了第一個干電池，1803年研製成功蓄電池。
里特在物理學方面的主要貢獻就是發現了紫外線。紫外線是比紫光波長更短的輻射，是太陽光譜中的一部分，人們用肉眼是看不見的。強烈的紫外光照射，對人體，生物都有害，但適量的紫外光卻可使用感到精神爽快，可以促進機體的新陳代謝，紫外光在醫學上還被用來殺菌。另外，人們根據紫外線的「光激發光」 (紫外線誘發物質發光) 現象，還創造了一種新分析方法，即熒光分析，它不僅可以檢測物質的結構，而且還可以很清楚地發現人眼難以發現的機器零件的裂縫。
紫外線的發現給人類帶來了福音，可它的發現者里特卻由於家境貧寒，生活清苦，正在他充滿憧憬向科學高峰攀登時，卻被肺病奪去了生命，在死時年僅34歲。

3. 紫外—可見吸收光譜分析方法

4.3.1.1 定性分析

無機元素的定性分析應用紫外—可見分光光度法比較少，主要採用原子發射光譜法或化學分析法。在有機化合物的定性分析鑒定及結構分析方面，由於紫外-可見吸收光譜較為簡單，光譜信息少，特徵性不強，並且不少簡單官能團在近紫外光區及可見光區沒有吸收或吸收很弱，在應用時也有較大的局限性。但是，這種方法可適用於不飽和有機化合物，尤其是共軛體系的鑒定，以此推斷未知物的骨架結構。此外，還可配合紅外光譜法、核磁共振波譜法和質譜法等常用的結構分析法進行定性鑒定和結構分析，不失為一種有利的輔助方法。

吸收光譜的形狀、吸收峰的數目和位置及相應的摩爾吸光系數，是定性分析的光譜依據，而最大吸收波長λ_max及相應的ε_max是定性分析的最主要參數。比較法有標准物質比較法和標准譜圖比較法兩種。利用標准物質比較，在相同的測量條件下，測定和比較未知物與已知標准物的吸收光譜曲線，如果兩者的光譜完全一致，則可以初步認為它們是同一類化合物；利用標准譜圖或光譜數據比較，對於沒有標准物質或標准物質難於得到的物質，此方法適用。

4.3.1.2 結構分析

紫外—可見分光光度法可以進行化合物某些基團的判別，共軛體系及構型、構象的判斷。

(1)某些特徵基團的判別

有機物的不少基團(生色團)，如羰基、苯環、硝基、共軛體系等，都有其特徵的紫外或可見光吸收帶，紫外-可見分光光度法在判別這些基團時，有時是十分有用的。如在270～300nm處有弱的吸收帶，且隨溶劑極性增大而發生藍移，就是羰基產生吸收帶的有力證據；在184nm附近有強吸收帶、204nm附近有中強吸收帶、260nm附近有弱吸收帶且有精細結構，則是苯環的特徵吸收，等等。

(2)共軛體系的判斷

共軛體系會產生很強的K吸收帶，通過繪制吸收光譜，可以判斷化合物是否存在共軛體系或共軛的程度。如果一化合物在210nm以上無強吸收帶，可以認定該化合物不存在共軛體系；若215～250nm區域有強吸收帶，則該化合物可能有兩至三個雙鍵的共軛體系，如1，3-丁二烯，λ_max為217nm，ε_max為21000；若260～350nm區域有很強的吸收帶，則可能有三至五個雙鍵的共軛體系，如癸五烯有五個共軛雙鍵，λ_max為335nm，ε_max為118000。

(3)異構體的判斷

包括順反異構及互變異構兩種情況的判斷。

順反異構體的判斷：生色團和助色團處於同一平面時，會產生最大的共軛效應。由於反式異構體的空間位阻效應小，分子的平面性較好，共軛效應強，因此λ_max及ε_max都大於順式異構體。

互變異構體的判斷：某些有機化合物在溶液中可能有兩種以上的互變異構體處於動態平衡中，這種異構體的互變過程常伴隨有雙鍵的移動及共軛體系的變化，因此會產生吸收光譜的變化。最常見的是某些含氧化合物的酮式與烯醇式異構體之間的互變。例如，乙醯乙酸乙酯就是酮式和烯醇式兩種互變異構體，它們的吸收特性不同，酮式異構體在近紫外光區時λ_max為272nm(ε_max為16000)；烯醇式異構體的λ_max則為243nm(ε_max為16000)。兩種異構體的互變平衡與溶劑有密切關系，在像水這樣的極性溶劑中，由於羰基可能與H₂O形成氫鍵以降低能量達到穩定狀態，所以酮式異構體占優勢；而在像乙烷這樣的非極性溶劑中，則形成分子內的氫鍵且形成共軛體系，以使能量降低達到穩定狀態，所以烯醇式異構體比率上升。

此外，紫外—可見分光光度法還可以判斷某些化合物的構象(如取代基是平伏鍵還是直立鍵)及旋光異構體等。

4.3.1.3 定量分析

紫外—可見分光光度法定量分析的常見方法有以下幾種。

(1)單組分的定量分析

如果在一個試樣中只要測定一種組分，且在選定的測量波長下，試樣中其他組分對該組分不幹擾，那麼進行單組分的定量分析較為簡單。一般有標准對照法和標准曲線法兩種。

標准對照法：在相同條件下，平行測定試樣溶液和某一濃度c_S(應與試液濃度接近)的標准溶液的吸光度A_x和A_S，則由c_S可計算出試樣溶液中被測物質的濃度c_x。

A_S=Kc_S，A_x=Kc_x，c_x=c_SA_x/A_S

由於標准對照法僅使用單個標准，引起誤差的偶然因素較多，故結果往往較不可靠。

標准曲線法：是實際分析工作中最常用的一種方法。配製一系列不同濃度的標准溶液，以不含被測組分的空白溶液作為參比，測定標准系列溶液的吸光度，繪制吸光度-濃度曲線，稱為校準曲線(包括標准曲線或工作曲線)。在相同條件下測定試樣溶液的吸光度，從校準曲線上找出與之對應的未知組分的濃度。

此外，有時還可以採用標准加入法(做法與原子吸收光譜法相同)。

(2)多組分的定量分析

根據吸光度具有加和性的特點，在同一試樣中可以同時測定兩種或兩種以上的組分。假設要測定試樣中的兩種組分為A、B，如果分別繪制A、B兩純物質的吸收光譜，可能有三種情況，如圖4.12所示。圖4.12 a表明兩組分互不幹擾，可以用測定單組分的方法分別在λ₁、λ₂測定A、B兩種組分；圖4.12 b表明A組分對B組分的測定有干擾，而B組分對A組分的測定無干擾，則可以在λ₁處單獨測量A組分，求得A組分的濃度c_A，然後在λ₂處測量溶液的吸光度及A、B純物質的和，根據吸光度的加和性則可以求出c_B；圖4.12c表明兩組分彼此互相干擾，此時在λ₁、λ₂處分別測定溶液的吸光度

及

，而且同時測定A、B純物質的

、

及

、

，然後列出聯立方程，解得c_A、c_B。

現代岩礦分析實驗教程

式中：M_r為衍生物的相對分子質量，扣除生色團的相對分子質量後得到該化合物的相對分子質量；l為吸收介質厚度(cm)。

(2)氫鍵強度的測定

溶劑效應對吸收光譜的影響表明，溶劑極性增大，會引起吸收帶的藍移和紅移，主要是由於溶質分子與溶劑分子的相互作用而引起的，如果它們之間具有可形成氫鍵的基團，則是由於形成氫鍵所引起的，因而可以通過吸收波長的移動程度來測定氫鍵的強度。

(3)在電化學研究方面的應用

分光光度法與電化學結合，構成了一個嶄新的研究領域——光譜電化學。光譜電化學技術包括透射技術、鏡反射技術和內反射技術三種。以分光光度法為測量手段，研究某些無機物、有機物和生物物質在電極上的電化學行為，可以同時獲得氧化還原體系的吸收光譜和氧化還原電位，以此研究所發生的電化學反應的歷程及動力學；還可以測定發生電化學反應所轉移的電子數、標准電位、摩爾吸光系數以及反應中間產物或最終產物的擴散系數等。光譜電化學發展很快，在研究無機、有機和生物化學氧化還原機理和均相反應動力學等方面將會發揮極大的作用。

4. 紫外方法驗證時定量限、檢測限怎麼做

分別取上述6個濃度的線性測試溶液，按照紫外分光光度計操作規程，用1cm吸收池，在231nm波長處，測定各自吸收度。
4.3.3
線性統計：
以吸收度為縱坐標，測試溶液的濃度為橫坐標，用EXCEL軟體進行線性回歸分析，記錄線性回歸方程和線性相關系數r。相關系數r應大於0.99。
4.3.4
檢測限，定量限根據線性數據中得到的線性回歸數據，計算方法的檢測限，定量限。檢測限為：LOD=3.3×SD/B定量限為：LOQ=10×SD/B據非法規資料，具體怎麼來的我也弄不清楚！我也在做清潔驗證的紫外方法驗證，現在我檢測限採用產生吸收度0.01的濃度為檢測限

5. 原料葯清潔驗證可以用紫外檢測方法嗎

最好還是別用，紫外不如液相可以留下明確的驗證圖譜，而紫外自能有一個數字的記錄，畢竟驗證是給別人看的，要拿出有說服力的證據，至少證據可以保留存檔吧。此外，紫外沒有選擇性，一旦測定波長不能檢測到殘留的物質，結果可能出現假陰性。如果在驗證開始就准備編數據自欺欺人，還是紫外，將來驗證的時候好編，也拿不到什麼把柄，一旦出問題就是你來負責，你看看那個更合適。

6. 如何利用紫外可見分光光度法對葯品含量進行測定

對於已經上葯典或取得生產批件，有質量標準的項目，直接按照葯品質量標准規定的實驗方法測定即可。對於處在研究過程，還沒有質量標準的新葯，應首先建立含量測定的分析方法，進行嚴格的方法學驗證後即可以測定。方法學驗證的工作包括：測定波長選擇、樣品的穩定性、靈敏度研究、專屬性研究、線性范圍研究、准確度研究、精密度研究和耐受性研究等，這些工作完成後，證明方法的可行性後，就可以測定葯品的含量了。如果是生物樣品，還要考慮樣品的前處理方法。