㈠ 葯物中測定某物質含量的常用方法有那些(3種以上)
方法的驗證：
訂入質量標準的含量測定法不同於一般質量考察的方法，須經過嚴格的方法學驗證，不同原理的測定法具有不同的驗證內容及要求：
（1）容量分析法的驗證：①精密度：用原料葯精製品考察方法精密度，平行試驗5個樣本的RSD≤0.2%；②准確度：以測定原料精製品（含量>99.5%）的回收率（測定值與理論值的比值）計算，應在99.7%～100.3%之間（n＝5,RSD≤0.1%）；③滴定終點確定的依據：包括滴定曲線的繪制，如用指示劑法確定終點，應用電位法校準終點顏色，提供指示劑顏色與電位變化情況的對比結果；④耐用性：考察測定條件（供試液穩定性、樣品提取次數、時間等）有微小變動時，測定結果不受影響的承受程度，如測試條件要求苛刻時則應在方法中註明。
（2）HPLC法的驗證：①精密度：RSD≤2%（n＝5）；②准確度：用於制劑時，要考察輔料的影響，將一定量葯物加到按處方比例配製的輔料中（為標示量的80%～120%）製成高、中、低三個劑量，混合均勻後，每個劑量取三份樣品，按擬定方法測定回收率，應在98%～102%之間（n＝9,
RSD≤2%）。③線性范圍：用已知含量的精製品配製一系列濃度的溶液（n＝5～7），用濃度C對峰面積A或峰高h或被測物的響應值之比進行回歸處理，線性方程的相關系數r≥0.999，截距應趨於零，並提供線性關系圖；④專屬性：輔料、有關物質或降解產物峰對主葯峰應無干擾；⑤耐用性：考察測定條件（供試液穩定性、流動相組成和pH值、不同品牌或批號的同類色譜柱、柱溫、流速、樣品提取次數、時間等）有微小變動時，測定結果不受影響的承受程度，如測試條件要求苛刻時則應在方法中註明；⑥靈敏度：作為常量分析法，此項可不作主要要求。
（3）UV法的驗證：①精密度：RSD≤1%（n＝5）；②准確度：方法同HPLC法，回收率應在98%～102%之間（n＝9,
RSD≤2%），同時要求輔料、有關物質或降解產物在測定波長處無吸收。③線性范圍：用已知含量的精製品配製一系列濃度的溶液（n＝5～7，吸收度A在0.2～0.7間），用濃度C對峰面積A或峰高h或被測物的響應值之比進行回歸處理，線性方程的相關系數r應≥0.999，截距應趨於零，並提供線性關系圖；④耐用性：考察測定條件（供試液穩定性、樣品提取次數、時間、比色法中顯色劑用量、反應溫度、時間、pH值等）有微小變動時，測定結果不受影響的承受程度，如測試條件要求苛刻時則應在方法中註明；⑤靈敏度：作為常量分析法，此項可不作主要要求。
吸收度A在0.2～0.8間其線形關系好，利用標准品建立標准曲線後，受測溶液做適當的稀釋，使其吸收度在0.2～0.8，如果太小或太大，都將影響測定的准確性的。
㈡ 檢出限的檢出限與測定限
1檢出限
為某特定分析方法在給定的置信度內可從樣品中檢出待測物質的最小濃度或最小量。所謂「檢出」是指定性檢出，即判定樣品中存有濃度高於空白的待測物質。
檢出限除了與分析中所用試劑和水的空白有關外，還與儀器的穩定性及雜訊水平有關。在靈敏度計算中沒有明確雜訊的大小，因而操作者可以將檢測器的輸出信號，通過放大器放到足夠大，從而使靈敏度相當高。顯然這是不妥的，必須考慮雜訊這一參數，將產生兩倍雜訊信號時，單位體積載氣或單位時間內進入檢測器的組分量稱為檢出限。
則：
D = 2N / S
式中：
N——雜訊（mV或A）；
S——檢測器靈敏度；
D——檢出限，其單位隨S不同也有三種：
Dg=2N / Sg,單位為mg/ml
Dv=2N / Sv,單位為ml/ml
Dt=2N / St,單位為g/s
有時也用最小檢測量（MDA）或最小檢測濃度（MDC）作為檢測限。它們分別是產生兩倍雜訊信號時，進入檢測器的物質量（g）或濃度(mg/ml)。
不少高靈敏度檢測器，如FID、NPD、ECD等往往用檢出限表示檢測器的性能。
靈敏度和檢出限是兩個從不同角度表示檢測器對測定物質敏感程度的指標，前者越高、後者越低，說明檢測器性能越好。
從而可見，測量方法的檢出限於分析空白值、精密度、靈敏度密切相關。他是分析方法的一個綜合性的重要計量參數。
2檢出限的計算方法
1）在《全球環境監測系統水監測操作指南》中規定：給定置信水平為95%時，樣品測定值與零濃度樣品的測定值有顯著性差異即為檢出限（D.L）。這里的零濃度樣品是不含待測物質的樣品。
D.L = 4.6σ
式中：
σ— 空白平行測定（批內）標准偏差（重復測定20次以上）。
2)國際純粹和應用化學聯合會（IUPAC）對分析方法的檢出限D.L作如下規定。
在與分析實際樣品完全相同的條件下，做不加入被測組分的重復測定（即空白試驗），測定次數盡可能多（試驗次數至少為20次）。
算出空白觀測值的平均值Xb和標准偏差Sb。在一定置信概率下，被檢出的最小測量值XL以下式確定：
XL= Xb+ K』Sb
式中：
Xb—— 空白多次測得信號的平均值；
Sb—— 空白多次測得信息的標准偏差；
K』—— 根據一定置信水平確定的系數。
與XL-Xb(即K』 Sb)相應的濃度或量即為檢出限:
D.L = XL- Xb/ K = k』Sb/ K
式中：
k——方法的靈敏度（即校準曲線的斜率）。為了評估Xb和Sb，實驗次數必須至少20次。
1975年，IUPAC建議對光譜化學分析法取k』=3。由於低濃度水平的測量誤差可能不遵從正態分布，且空白的測定次數有限，因而與k』=3相應的置信水平大約為90%。
此外，尚有將K』取為4、4.6、5及6的建議。
3）美國EPASW-846中規定方法檢出限：MDL=3.143δ(δ重復測定7次)
4）在某些分光光度法中，以扣除空白值後的與0.01吸光度相對應的濃度值為檢出限。
5）氣相色譜分析的最小檢測量系指檢測器恰能產生與雜訊相區別的響應信號時所需進入色譜柱的物質的最小量，一般認為恰能辨別的響應信號，最小應為雜訊的兩倍。最小檢測濃度系指最小檢測量與進樣量（體積）之比。
6）某些離子選擇電極法規定：當校準曲線的直線部分外延的延長線與通過空白電位且平行於濃度軸的直線相交時，其交點所對應的濃度值及為該離子選擇電極法的檢出限。
光度分析中，雖然吸光度最小測讀值為0.001，靈敏度也以A=0.001所相應的被測物濃度表示，但實際上慣常以A=0.05相應的被測物濃度作為有充分置信度的測定限，即最小能夠可靠測定的濃度。這是因為，在吸光度A接近零的情況下，測定值與真實值之比即相對誤差趨向無限大。
其次，由於比色皿的成對性不易做到完全匹配，尤其是使用已久的比色皿的成對性不易保證，因此吸光度很小的測量值在不同操作者、不同試驗室之間常會不一致，除非操作者很有經驗，十分注意比色皿成對性對測量的影響，並在每次測量時予以試驗校正。
測定限
測定限為定量范圍的兩端，分為測定上限與測定下限。
1測定下限
在測定誤差能滿足預定要求的前提下，用特定方法能准確地定量測定待測物質的最小濃度或量，稱為該方法的測定下限。
測定下限反映出分析方法能准確地定量測定低濃度水平待測物質的極限可能性。在沒有（或消除了）系統誤差的前提下，他受精密度要求的限制（精密度通常以相對標准偏差表示）。分析方法的精密度要求越高，測定下限高於檢出限越多。
美國EPASW-846中規定4MDL為定量下限（RQL），即4倍檢出限濃度作為測定下限，其測定值的相對標准偏差約為10%。日本JIS規定定量下限為10倍的MDL。
2測定上限
在限定誤差能滿足預定要求的前提下，用特定方法能夠准確地定量測定待測物質的最大濃度或量，稱為該方法的測定上限。
對沒有（或消除了）系統誤差的特定分析方法的精密度要求不同，測定上限也將不同。
測定限對於定量分析，進一步計算才能得到與分析物有關的值（例如，各個結果的平均值）。因此，條件更加苛刻，所以測定限總是高於檢出限。
3檢測限有三種常用的表示方式
（1）儀器檢測下限
可檢測儀器的最小訊號，通常用信噪比來表示,當信號與雜訊之比大於等於3時，相當於信號強度的試樣濃度，定義為儀器檢測下限。
（2）方法檢測下限
即某方法可檢測的最低濃度。通常用低濃度曲線外推法可求的方法檢測下限。
（3）樣品檢測下限
即相對於空白可檢測的樣品最小含量。樣品檢測下限定義為：其信號等於測量空白溶液的信號的標准偏差的3倍時的濃度。
檢測下限是選擇分析方法的重要因素。樣品檢測下限不僅與方法檢測下限有關，而且與空白樣品中空白含量以及空白波動情況有關。只有當空白含量為零時，樣品檢測下限等於方法檢測下限。
然而，空白含量往往不等於零，空白大小受環境對樣品的污染，試劑純度、水質純度、容器的質地及操作等因素的影響。因此，由外推法可求得方法檢測下限可能很低，但由於空白含量的存在，以及空白含量的波動，樣品檢測下限可能要比方法檢測下限大得多。從實用中考慮，樣品檢測下限較為 有用和切合實際。
最佳測定范圍
1最佳測定范圍（也稱有效測定范圍）
指在限定誤差能滿足預定要求的前提下，特定方法的測定下限至測定上限之間的濃度范圍。在此范圍內能夠准確地定量測定待測物質的濃度或量。
最佳測定范圍應小於方法的適應范圍。對測量結果的精密度（通常以相對標准偏差表示）要求越高，相應的最佳測定范圍越小。
2方法的線性范圍
方法的線性范圍是指信號與樣品濃度呈線性的工作曲線直線部分。通常把相當於10倍空白的標准偏差相應的濃度定為方法的線性范圍的定量檢測下限。取工作曲線中高濃度時，彎曲處作為方法的線性范圍的定量檢測上限。
好的分析方法要有寬的線性范圍。有的分析方法線性范圍只有一個數量級，有的分析方法線性范圍可達5～6個數量級。同一分析方法可用常量、微量、痕量的物質分析。
校準曲線
校準曲線包括標准曲線和工作曲線，前者用標准溶液系列直接測量，沒有經過預處理過程，這對於樣品往往造成較大誤差；而後者所使用的標准溶液經過了與樣品相同的消解、凈化、測量等全過程。
凡應用校準曲線的分析方法，都是在樣品測得信號值後，從校準曲線上查得其含量（或濃度）。因此，繪制准確的校準曲線，直接影響到樣品分析結果的准確與否。此外，校準曲線也確定了方法的測定范圍。
1校準曲線的繪制
用一系列被測物標准溶液，按照標准方法規定的步驟，將被測物轉變為有色溶液。制備好的標准系列和空白，在方法選定的波長下，測定吸光度。已被測物濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制校準曲線。
對標准系列，溶液以純溶劑為參比進行測量後，應先作空白校正，然後繪制標准曲線。
標准溶液一般可直接測定，但如試樣的預處理較復雜致使污染或損失不可忽略時，應和試樣同樣處理後再測定。
校準曲線的斜率常隨環境溫度、試劑批號和貯存時間等實驗條件的改變而變動。
因此，在測定試樣的同時，繪制校準曲線最為理想，否則應在測定試樣的同時，平行測定零濃度和中等濃度標准溶液各兩份，取均值相減後與原校準曲線上的相應點核對，其相對差值根據方法精密度不得大於5%～10%，否則應重新繪制校準曲線。
2校準曲線的檢驗
1）線性檢驗: 即檢驗校準曲線的精密度。對於以4～6個濃度單位所獲得的測量信號值繪制的校準曲線，分光光度法一般要求其相關系數 | r | ≥0.9990，否則應找出原因並加以糾正，重新繪制合格的校準曲線。
2）截距檢驗：即檢驗校準曲線的准確度，在線性檢驗合格的基礎上，對其進行線性回歸，得出回歸方程 y= a+bx ，然後將所得截距a與0作t檢驗，當取95%置信水平，經檢驗無顯著性差異時，a可做0處理，方程簡化為y= bx，移項得x=y/b。在線性范圍內，可代替查閱校準曲線，直接將樣品測量信號值經空白校正後，計算出試樣濃度。
當a與0有顯著性差異時，表示校準曲線的回歸方程計算結果准確度不高，應找出原因予以校正後，重新繪制校準曲線並經線性檢驗合格。在計算回歸方程，經截距檢驗合格後投入使用。
回歸方程如不經上述檢驗和處理，就直接投入使用，必將給測定結果引入差值相當於解決a的系統誤差。
3)斜率檢驗: 即檢驗分析方法的靈敏度，方法靈敏度是隨實驗條件的變化而改變的。在完全相同的分析條件下，僅由於操作中的隨機誤差導致的斜率變化不應超出一定的允許范圍，此范圍因分析方法的精度不同而異。例如，一般而言，分子吸收分光光度法要求其相對差值小於5%，而原子吸收分光光度法則要求其相對差值小於10%等等。
3校準曲線的控制
被測物轉變為有色溶液的反應稱為顯色反應或發色反應。顯色反應的介質PH條件、顯色劑用量、顯色反應的時間和溫度、為消除共存物干擾而加入的掩蔽劑、甚至加試劑的順序，都要按照方法步驟的要求執行。有時，標准系列雖然不像實際試樣那樣組成復雜，但仍要求與試樣進行同樣的處理步驟，以便控制校準曲線上的數據點的空白、回收率等因素。
建立校準曲線時，測量吸光度的參比有兩種選擇。
第一種方法用純溶劑作參比，兩個比色皿都放溶劑時，「樣品比色皿」 的吸光度測定值為比色皿成對性校正值，此後所有樣品吸光度測定值都須扣除此值，進行校正。然後，以純溶劑為參比，測定空白及標准系列的吸光度，繪制校準曲線。
第二種方法直接用空白為參比。當兩個比色皿都放空白時，測定比色皿成對性校正值，然後測定標准系列的吸光度，繪制校準曲線。兩種方法得到的兩條校準曲線互相平行，但第一種方法可測定空白的水平，後一種方法不能測定空白，理論上校準曲線通過原點。若空白為零，兩條校準曲線重合。無論用什麼作參比，實樣測定時應該使用與建立校準曲線相同的比色皿和同樣的參比。
比色皿的成對性校正對於使用已久的比色皿是必要的，尤其是測量吸光度很小的樣品時，校正可保證測量值的可靠性和重復性。
一.分析空白的主要來源和控制措施
1環境對樣品的玷污
主要是由空氣中的污染氣體和沉降微粒引起的。普遍實驗室中每立方米空氣中含有數百微克的微粒。這些微粒含有多種元素，因而可引起多種和痕量元素的玷污。來自環境的玷污不但顯著，而且變動性大。應採取局部或整個實驗室的防塵與空氣凈化措施。
2試劑對樣品的玷污
試劑對樣品的玷污隨試劑用量而變化。對一定的試劑用量是恆定的。樣品處理過程中用量最多的是水和酸。
3器皿對樣品玷污
貯存、處理樣品所用的一切器皿，如燒杯、瓶子、過濾器、研缽等，由於其材質不夠純或者未洗滌干凈均可能玷污樣品。在痕量分析中應選用高純惰性材料製成的器皿， 並運用合適的清洗技術。聚四氟乙烯、透明的合成石英的高壓聚乙烯是比較合適的器皿材料。
4分析測試者對樣品的玷污
分析測試者用手觸摸樣品可引起多種元素的玷污；分析測試者的化妝品常常不知不覺地帶來許多元素的玷污；分析測試者使用的內服和外用葯物也常常玷污樣品；以及分析測試者若不注意個人衛生也會引起樣品的玷污。所以，分析測試者不但要具有正確熟練的操作技巧，而且要知道自身對樣品可能帶來什麼玷污，以採取消除玷污的必要措施。
二.分析空白的監測和空白值的扣除
空白值波動較大，往往在百分之幾十，甚至百分之幾百的水平上波動。因而痕量與超痕量分析中，扣除空白是比較困難的，也是不可靠的。可靠並行之有效的方法是把分析空白降至可以忽略不記的程度，同時在分析過程中作空白的平行測定，以監視分析過程。若分析空白明顯的超過正常值，則表明本次分析測定過程有嚴重的玷污，平行樣品的測定結果不可靠。
在分析空白主要來自試劑的玷污時，空白值比較穩定，若有必要，可以扣除空白值。為獲得可靠的空白值，應進行多次重復測定，算出空白值及其置信限：B ±t0.95(SB/n2)。
答案來自
㈢ 常用生化檢測項目分析方法舉例及參數設置
常用生化檢測項目分析方法舉例及參數設置
常用生化檢測項目有哪些你知道嗎?你對常用生化檢測項目了解嗎?下面是我為大家帶來的關於常用生化檢測項目分析方法舉例及參數設置的知識，歡迎閱讀。
一、常用生化檢測項目
1.終點法檢測常用的有總膽紅素(氧化法或重氮法)、結合膽紅素(氧化法或重氮法)、血清總蛋白(雙縮脲法)、血清白蛋白(溴甲酚氯法)、總膽汁酸(酶法)、葡萄糖(葡萄糖氧化酶法)、尿酸(尿酸酶法)、總膽固醇(膽固醇氧化酶法)、甘油三酯(磷酸甘油氧化酶酶法)、高密度脂蛋白膽固醇(直接測定法)、鈣(偶氮砷Ⅲ法)、磷(紫外法)、鎂(二甲苯胺藍法)等。以上項目中，除鈣、磷和鎂基本上還使用單試劑方式分析因而採用一點終點法外，其它測定項目都可使用雙試劑故能選用兩點終點法，包括總蛋白、白蛋白測定均已有雙試劑可用。
2.固定時間法苦味酸法測定肌酐採用此法。
3.連續監測法對於酶活性測定一般應選用連續監測法，如丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶、鹼性磷酸酶、γ谷氨氨醯基轉移酶、澱粉酶和肌酸激酶等。一些代謝物酶法測定的項目如己糖激酶法測定葡萄糖、脲酶偶聯法測定尿素等，也可用連續監測法。
4.透射比濁法透射比濁法可用於測定產生濁度反應的項目，多數屬免疫比濁法，載脂蛋白、免疫球蛋白、補體、抗"O"、類風濕因子，以及血清中的其他蛋白質如前白蛋白、結合珠蛋白、轉鐵蛋白等均可用此法。
二、分析參數設置
分析儀的一些通用操作步驟如取樣、沖洗、吸光度檢測、數據處理等，其程序均已經固化在存儲器里，用戶不能修改。各種測定項目的分析參數(analysisparamete)大部分也已設計好，存於磁碟中，供用戶使用;目前大多數生化分析儀為開放式，用戶可以更改這些參數。生化分析儀一般另外留一些檢測項目的空白通道，由用戶自己設定分析參數。因此必須理解各參數的確切意義。
一、分析參數介紹
(一)必選分析參數
這類參數是分析儀檢測的前提條件，沒有這些參數無法進行檢測。
1.試驗名稱 試驗名稱(test code)是指測定項目的標示符，常以項目的英文縮寫來表示。
2.方法類型(也稱反應模式) 方法類型(assay)有終點法、兩點法、連續監測法等，根據被檢物質的檢測方法原理選擇其中一種反應類型。
3.反應溫度 一般有30℃、37℃可供選擇，通常固定為37℃。
4.主波長 主波長(primary wavelength)是指定一個與被測物質反應產物的光吸收有關的波長。
5.次波長 次波長(secondary wavelength)是在使用雙波長時，要指定一個與主波長、干擾物質光吸收有關的波長。
6.反應方向 反應方向(response direction)有正向反應和負向反應兩種，吸光度增加為正向反應，吸光度下降為負向反應。
7.樣品量 樣品量(sampling volum)一般是2μl～35μl，以0.1μl步進，個別分析儀最少能達到1.6μl。可設置常量、減量和增量。
8. 第一試劑量 第一試劑量(first regengt volum)一般是20～300μl，以1μl步進。
9. 第二試劑量 第二試劑量(second regengt volum)一般也是20～300μl，以1μl步進。
10.總反應容量 總反應容量(total reacting volum)在不同的分析儀有一個不同的規定范圍，一般是180～350μl，個別儀器能減少至120μl。總反應容量太少無法進行吸光度測定。
11.孵育時間 孵育時間(incubate time)在終點法是樣品與試劑混勻開始至反應終點為止的時間，在兩點法是第一個吸光度選擇點開始至第二個吸光度選擇點為止的時間。
12.延遲時間 延遲時間(delay time)在連續監測法中樣品與反應試劑(第二試劑)混勻開始至連續監測期第一個吸光度選擇點之間的時間。
13.連續監測時間 連續監測時間(continuous monitoring time)在延遲時間之後即開始，一般為60～120s，不少於4個吸光度檢測點(3個吸光度變化值)。
14.校準液個數及濃度 校準曲線線性好並通過坐標零點的，可採用一個校準液(calibrator);線性好但不通過坐標零點，應使用兩個校準液;對於校準曲線呈非線性者，必須使用兩個以上校準液。每一個校準液都要有一個合適的濃度。
15.校準K值或理論K值 通過校準得到的K值為校準K值(calibrate coefficient)或由計算得出的K值為理論K值。
16.線性范圍 即方法的線性范圍(linearity range)，超過此范圍應增加樣品量或減少樣品量重測。與試劑/樣品比值有關。
17.小數點位數 檢測結果的小數點位數(decimal point digit)。
(二)備選分析參數
這類分析參數與檢測結果的准確性有關，一般來說不設置這類分析參數，分析儀也能檢測出結果，但若樣品中待測物濃度太高等，檢測結果可能不準確。
1.樣品預稀釋 設置樣品量、稀釋劑量和稀釋後樣品量三個數值，便可在分析前自動對樣品進行高倍稀釋。
2.底物耗盡值 底物耗盡值(substrate exhaust limit)在負反應的酶活性測定中，可設置此參數，以規定一個吸光度下降限。若低於此限時底物已太少，不足以維持零級反應而導致檢測結果不準確。
3.前區檢查 免疫比濁法中應用，以判斷是否有抗原過剩。將終點法最後兩個吸光度值的差別(ΔA)設置一個限值，如果後一點的吸光度比前一點低，表示已有抗原過剩，應稀釋樣品後重測。
4.試劑空白吸光度范圍 超過此設定范圍表示試劑已變質，應更換合格試劑。
5.試劑空白速率 連續監測法中使用，是試劑本身在監測過程中沒有化學反應時的變化速率。
6.方法學補償系數 用於校準不同分析方法間測定結果的一致性，有斜率和截距兩個參數。
7.參考值范圍 對超過此范圍的測定結果，儀器會列印出提示。
(三)某些參數的特殊意義
1.最小樣品量 最小樣品量是指分析儀進樣針能在規定的誤差范圍內吸取的最小樣品量。一般分析儀的最小樣品量是2μl，目前也有小至1.6μl的。在樣品含高濃度代謝產物或高活性酶濃度的情況下往往需採用分析儀的最小樣品量作為減量參數，從而使分析儀檢測范圍(與線性范圍不同)的上限得以擴大。
2.最大試劑量 方法靈敏度很高而線性上限低的檢測項目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法測定，以往手工法操作時樣品量10μl，試劑量4ml，這樣試劑量/樣品量比例(R/S)為200，線性上限則為60g/L。此法移植到分析儀上後，R/S卻很難達到200，致使線性上限變低。因此對這類檢測項目最大試劑量非常重要。
3.彈性速率 在酶活性測定中，當酶活性太高，在連續監測期中已不呈線性反應時，有些儀器具有彈性速率(flexrate)功能，能自動選擇反應曲線上連續監測期中仍呈線性的吸光度數據計算結果，使酶活性測定的線性范圍得以擴大。如AST可從1000U/L擴展至4000U/L，從而減少稀釋及重測次數、降低成本。
4.試劑空白速率 當樣品中存在膽紅素時，膽紅素對鹼性苦味酸速率法或兩點法測定肌酐有負干擾。因為膽紅素在肌酐檢測的波長505nm有較高光吸收，而且膽紅素在鹼性環境中可被氧化轉變，因而在肌酐反應過程中膽紅素的光吸收呈下降趨勢。若在加入第一試劑後一段時間內設置試劑空白速率，因為此段中苦味酸尚未與肌酐反應，而膽紅素在第一試劑的鹼性環境中已同樣被氧化轉變，因而以第二試劑加入後的速率變化，減去試劑空白速率變化，便可消除膽紅素的負干擾，見圖7-8。
二、單波長和雙波長方式
(一)概念
採用一個波長檢測物質的光吸收強度的`方式稱為單波長(mono-wavelength)方式。當反應液中含有一種組分，或在混合反應液中待測組分的吸收峰與其它共存物質的吸收波長無重疊時，可以選用。在吸光度檢測中，使用一個主波長和一個次波長的稱雙波長方式。當反應液中存在干擾物的較大吸收、從而影響測定結果的准確性時，採用雙波長方式更好。
(二)雙波長的作用
雙波長(di-wavelength)測定優點是①消除噪音干擾;②減少雜散光影響;③減少樣品本身光吸收的干擾。從光源，到比色杯、單色器、檢測器的整個光路系統中，均存在著隨時間發生變化的不穩定的檢測信號，即噪音，而雙波長檢測是同時進行的，兩種波長檢測產生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干擾。當樣品中存在非化學反應的干擾物如甘油三酯、血紅蛋白、膽紅素等時，會產生非特異性的光吸收，而干擾測定結果的准確性。採用雙波長方式測定可以部分消除這類干擾，提高檢測的准確性。
(三)次波長的確定方法
當被測物的主波長確定之後，再選擇次波長。如根據甘油三酯等干擾物吸收光譜特徵，選擇次波長，使干擾物在主、次波長處有盡可能相同的光吸收值，而被測物在主、次波長處的光吸收值應有較大的差異。一般來說，次波長應大於主波長100nm。以主波長與次波長吸光度差來計算結果。
(四)雙波長的具體應用
對於某些反應速度快且無法設置為兩點終點法的分析項目，尤其是單試劑分析中，可以利用雙波長的方式來部分消除樣品本身的光吸收干擾。目前用單試劑法測定的項目應用雙波長的為血清總蛋白(雙縮脲法)主波長500nm，次波長576nm;血清白蛋白(溴甲酚氯法)主、次波長分別為600和700nm;鈣(偶氮砷Ⅲ法)主、次波長分別為 660、770nm;磷(紫外比色法)主、次波長為340、405nm，鎂(二甲苯胺藍法)主、次波長為505和 600nm。
三、單試劑和雙試劑方式
反應過程中只加一次試劑稱單試劑方式，加兩次試劑便為雙試劑方式。目前的生化分析儀大多可用雙試劑方式分析，其優點是：①可提高試劑的穩定性，多數雙試劑混合成單一工作試劑時，其穩定時間縮短;②能設置兩點終點法，來消除來自樣品本身的光吸收干擾;③在某些項目檢測時能消除非特異性化學反應的干擾。如血清ALT測定，血清中的內源性丙酮酸及其它酮酸也可與試劑中的指示酶(乳酸脫氫酶)起反應，使結果偏高。若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一試劑，使其它酮酸與指示酶反應之後再加入含有α-酮戊二酸的第二試劑，啟動真正的ALT酶促反應生成丙酮酸，而丙酮酸與乳酸脫氫酶的反應消耗的NAD+能真正反映ALT的活性，從而消除以上副反應的影響。
四、測定過程的自動監測
各種自動生化分析儀或多或少都具有對測定過程進行各種監測的功能，以便在沒有人"監督"化學反應的情況下提高檢測的准確性。高檔分析儀的監測功能更強。
1.試劑空白監測 每種試劑都有一定的空白吸光度范圍，試劑空白吸光度的改變往往提示著該試劑的變質：如利用Trinder反應為原理的檢測試劑會因酚被氧化為醌而變為紅色;鹼性磷酸酶、γ-谷氨醯轉移酶、澱粉酶等檢測試劑會因基質分解出硝基酚或硝基苯胺而變黃;有些試劑久置後變渾濁。這些情況均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶等負反應檢測項目，其試劑在放置過程中空白吸光度會因NADH自行氧化為NAD+而下降等。
試劑空白的測定方法有兩種：①每瓶試劑在使用前通過對試劑空白校準來確定試劑空白吸光度，這種方式適用於先取樣品後加試劑的分析儀。②每個樣品測定前均檢測試劑空白吸光度，適用於先加試劑後取樣品的分析儀。
2.試劑空白變化速率監測 一些酶試劑在反應溫度下不穩定，其空白吸光度可隨著時間逐漸發生變化，這種變化的主要原因與工具酶或輔酶的純度有關，且因試劑的組成和生產廠家的不同而不同。這種變化會影響測定結果的准確性，一般使結果偏高。如果設置此項監測，分析儀在結果計算時會自動減去試劑空白變化速率。在以監測NAD(P)H減少為指示反應的酶活性測定中，空白速率可監測並消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降;在色素原為底物的酶活性測定中，空白速率可監測並消除底物自身分解造成的吸光度升高。有關空白速率監測在膽紅素對鹼性苦味酸速率法測定肌酐負干擾消除中的作用，已如前述。
3.樣品信息監測 由於樣品的溶血、脂濁、黃疸會對測定結果產生非化學反應的干擾。根據溶血、脂濁、黃疸的光譜吸收特性，用雙波長或多波長檢測其性質和程度，一般是測定樣品在600nm/570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小來分別判斷樣品溶血、脂濁和黃疸程度。然後在結果計算時自動減去這部分干擾，這將有利於提高分析結果的可靠性。
4.結果可靠性監測
(1)終點監測：終點法測定要判斷所選的測光點是否到達終點或平衡點。一些分析儀在所選終點後再選一個測光點，比較這兩點吸光度的差異來判斷反應是否到達終點。
(2)線性期監測：連續監測法選擇時間-吸光度反應曲線上的線性期來計算酶活性或被測物濃度，因此儀器要確定此連續監測期是否呈線性。其監測方法為①將連續監測到的各吸光度值進行線性回歸，計算出各點的方差，根據方差值的大小來判斷是否呈線性;②取連續監測期開始若干點的變化速率與連續監測期最後若干點的變化速率進行比較，來判斷是否為線性期。
5.底物消耗的監測 在連續監測法測定酶活性時，如果在監測期內吸光度上升或下降超過其底物耗盡值，則說明該樣品酶活性非常高，底物將被耗盡，監測期的吸光度將偏離線性，使測定結果不可靠。此時不列印結果或列印結果同時也列印出底物耗盡提示，該樣品應稀釋一定的倍數重新測定。此監測對於採用負反應分析酶活性的方法甚為重要。見圖7-9
6.方法線性范圍監測 每種待測物分析都有一個可測定的濃度或活性范圍，樣品結果若超過此范圍，分析儀將顯示測定結果超過線性范圍的提示，多數分析儀會自動將樣品減量或增量重新測定。
;㈣ 自動生化參數的選擇線性范圍
自動生化分析儀參數設置
自動生化分析儀是一種把生化分析中的取樣、加試劑、去干擾物、混合、恆溫反應、自動監測、數據處理以及實驗後清洗等步驟進行自動化操作的儀器，它完全模仿並代替了手工操作，目前已經成為醫療機構進行臨床診斷所必可不少的儀器之一。它的應用大大提高了生化檢驗的准確性、精密度和工作效率，適應了臨床醫學發展對檢驗醫學的要求，然而這一切不僅需要生化分析儀的技術基礎，也需要儀器內每個項目都有一組最優化的分析參數。並且目前大多數生化分析儀為開放式，封閉式的儀器一般也會另外留一些檢測項目的空白通道由用戶自己設定分析參數，因此我們有必要了解生化分析儀各個分析參數的基本含義以及設置方法。
1.試驗名稱常以項目的英文縮寫來設置，如總蛋白設置為TP，白蛋白設置為ALB等。 2.方法類型生化分析儀常用的方法有終點法、連續監測法、比濁法等，根據被檢物質的檢測原理等選擇其中一種分析方法。
2.1終點法又稱為平衡法，是基於反應達到平衡時反應產物的吸收光譜特徵及其對光吸收強度的大小對物質進行定量分析的一類方法，有一點終點法和兩點終點法兩類。一點終點法的特點是使用一種或兩種試劑，當待測物與試劑反應達到終點時，測定混合溶液的吸光度來計算待測物的濃度，該法常用的有總蛋白雙縮脲法、白蛋白溴甲酚綠法、葡萄糖氧化酶法等，手工操作的大多數方法都是一點終點法。兩點終點法也稱固定時間法，如果是單試劑分析，當測定波長同干擾物質的吸收光譜有重疊時，通過選用兩點終點法可消除樣品空白引起的干擾，其分析過程是在樣品與試劑混合後經過一段延滯期讀取一個點A1，一定時間後再讀取A2，然後比較標准和測定的ΔA（ΔA=A2-A1）值，求得待測物的濃度。肌酐苦味酸法就是一個典型的單試劑兩點法的例子。如果是雙試劑分析，選用二點終點分析法除了可消除樣品空白引起的干擾外，還可消除內源性干擾物質的干擾，其分析過程是加入試劑1後讀取A1，加入試劑2後讀取A2，A1相當於讀出樣品空白值，A2才是實際呈色反應，然後比較標准和測定的ΔA（ΔA=A2-A1）值，求得待測物的濃度。為了提高終點法檢測的准確性，選擇該法時應設置終點法零點讀數、樣品空白等兩個分析參數，前者是在反應前即開始讀數，可以扣除反應前試劑和樣品混合液的空白讀數；後者是樣品加空白試劑所得到的吸光度，反應需要佔用一個比色杯。
2.2連續監測法又稱動態分析法、速率法等，基本原理是在酶促反應的最適條件下，用物理、化學或酶促反應的分析方法，在反應速度恆定期（零級反應期）內連續觀察和記錄一定反應時間內底物或產物量的變化，以單位時間酶反應初速度計算出酶活力的大小和代謝物的濃度。具體方法有兩點速率法和多點速率法：兩點速率法是通過觀察在零級反應期內兩個時間點的吸光度，用兩個點的吸光度的差值（ΔA）除以時間（分），計算出每分鍾的吸光度變化值；多點速率法是在零級反應期內每隔一定時間（2-30s）進行一次監測，連續監測多次，求出單位時間內的反應速度，這種方法又可分為最小二乘法、多點δ法、回歸法、帶速率時間法等。該法具有明顯的優點就是大大提高了分析速度和准確性，主要適用於酶活性及其代謝產物的測定。在連續監測法過程中，即使不加樣品，試劑中的底物也會自動降解得到一個結果，因此應設置試劑空白速率，不同批號試劑的試劑空白速率不一樣，其值為以水代樣品測得的項目結果，樣品測定結果應扣除試劑空白速率的數值。
2.3比濁法自動生化分析儀一般只能做透射免疫比濁分析，當光線通過一定體積的含免疫復合物的溶液時，由於溶液中存在的抗原-抗體復合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光的減少，測定的光通量和抗原抗體復合物的量成反比。它常用於終點法測定，目前主要用於血清特種蛋白的檢測，如載脂蛋白、微量蛋白、急性時相反應蛋白、免疫球蛋白以及某些葯物監測等。但是如果樣品中待測抗原濃度過高，抗原與抗體形成的免疫復合物分子將會
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變小，而且易發生解離，使濁度反而下降，因此免疫比濁分析過程中必須設置前區檢查，比較分析過程中後兩個讀數點的差別，如果後一點比前一點的吸光度低，則表示抗原已過剩，應將樣品稀釋後重測。
3.反應溫度自動生化分析儀通過溫度控制系統保持溫度恆定，以保證反應的正常進行，其保持恆溫的方式有三種：乾式恆溫器加熱、水浴式循環加熱、恆溫器循環間接加熱。恆溫控制器可以對25℃、30℃、37℃三種溫度進行恆溫，根據需要可以任意選擇，半自動生化分析儀恆溫器屬於這種。全自動生化分析儀的溫度控制器一般只能控制37℃一種溫度，少數也可以控制30℃和37℃兩種溫度。
4.反應波長當測定體系中只有一種組分或混合溶液中待測組分的吸收峰與其他共存物質的吸收波長無重疊時，可選用單波長，如果待測物質有幾個吸收峰，可選用吸光度最大的一個波長，或者選擇在吸收峰處吸光度隨波長變化較小的某個波長。當被檢溶液混濁或存在較多的干擾物質時，測定過程中會出現光散射和非特異性光吸收，從而影響測定結果的准確性，此時可用雙波長甚至多波長測定，以提高測定結果的准確性，而在實際應用中選擇輔助波長主要用於消除脂血、溶血、黃疸的干擾。由於脂質、血紅蛋白、膽紅素在較寬的波長范圍內有較強的光吸收，常常同測定波長有重疊，此時測得的吸光度包含待測物質的吸光度和干擾物質的吸光度，因此必須選用合適的輔助波長來消除干擾物質的吸光度。輔助波長的設置原則是根據測定波長選擇輔助波長，要求干擾物質在測定波長同輔助波長有相同的吸光度。
5.反應方向有正向反應和負向反應兩種，反應過程中吸光度增加為正向反應，吸光度下降為負向反應。
6.樣品量與試劑量樣品與試劑量的確定一般按照試劑說明書上的比例，並結合儀器的特性進行設置，亦可根據手工法按比例縮減或重新設計，但要考慮到檢測靈敏度、線性范圍，盡可能將樣品稀釋倍數大些，以降低樣品中其他成分的影響。在樣品與試劑量的設置過程中主要應注意以下幾個方面：①稀釋水量，添加樣品稀釋水的是為了洗出粘附在采樣針內壁上的微量血清，減少加樣誤差，添加試劑稀釋水是為了避免試劑間的交叉污染，兩種稀釋水的量應在復溶試劑時按比例扣除。如果採用液體試劑盒時因不再用水，無法扣除稀釋水量，所以兩種稀釋水應盡量減少，以免試劑被過量稀釋。②最小樣品量，即分析儀進樣針能在規定的誤差范圍內吸取的最小樣品量，隨著技術的不斷改進，儀器的最小樣品量逐漸減小，目前有少至1.6μl的。在樣品含高濃度代謝產物或高活性酶濃度的情況下往往需採用分析儀的最小樣品量作為減量參數，從而使儀器的檢測范圍上限得以擴大。③總反應容量，在不同的分析儀有一個不同的規定范圍，在設置的時候樣品量和試劑量之和不能超過這一范圍。該值受儀器的光路系統所影響，直射式光路由於光束較寬，難於減少所測試反應液體積，集束式光路則是通過一個透鏡使光束變窄，可檢測低至180μl的反應液混合體，近年來又出現了點光源技術，它的光束更小，照射到樣品杯時僅為一個點，可使反應液的量降至120μl.④試劑量/樣品量比值，不要為節省試劑而過分地減少試劑用量，因為在終點比色法中，縮小試劑量/樣品量比值會降低線性范圍，遇高濃度樣本會因試劑量不足而使結果偏低。
7.分析時間分析時間包括孵育時間、延遲時間、監測時間等，選擇不同的分析方法應選擇相應的分析時間。
7.1孵育時間選擇終點法時設置，在一點終點法是樣品與試劑混勻開始至反應終點為止的時間，在兩點終點法是第一個吸光度選擇點開始至第二個吸光度選擇點為止的時間。在設置孵育時間時，有些分析方法要特別注意，如選擇溴甲酚綠法測定血清白蛋白時，由於血清中α1-球蛋白、轉鐵蛋白等也可與溴甲酚綠呈色，盡管其反應速率較白蛋白為慢，但是實際上當血清與白蛋白混合時，「慢反應」已經發生，因此為減少非特異性結合反應，應在溴甲酚綠與血清混合後30s讀取吸光度。當選擇酶法的Trinder反應測定葡萄糖、總膽固醇、甘
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油三酯時，由於37℃酶反應較慢，因此必須測定這些酶試劑反應達到終點的時間，自動分析儀用試劑盒一般可以在全部加樣後5分鍾內反應完全，所以應選擇分析儀的最大反應時間。
7.2延遲時間選擇連續監測法或兩點終點法時設置，即在樣品與反應試劑（第二試劑）混勻開始至第一個吸光度選擇點之間的時間。在連續監測法過程中，當酶與底物混合後需要一定的時間讓酶激活，直至線性反應期才能開始監測，有的項目需要用工具酶將內源性代謝產物耗盡，消除干擾。一般單試劑法只需要30s，常用項目中谷氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶需要特別注意，但是對於雙底物反應或需要輔酶參與者，通常為1-3min.7.3監測時間酶促反應延滯期後，在過量底物的存在下，反應速率加快並達到穩定的階段，即酶促反應以恆定的速率進行，不受底物濃度的影響，這段時間稱為線性反應期或零級反應期，自動生化分析儀的監測時間即為此期。連續監測法在零級反應期至少應監測90-120s或至少4點（3個ΔA），少於3個ΔA不能稱為連續監測法，因為不能計算線性度；監測時間過長則容易發生底物耗盡，可測范圍變窄。醫學教育網搜集整理。
8.計算因子（F值）和實測F值用連續監測法進行酶活性測定時，不需作標准管或標准曲線，根據摩爾吸光系數很容易進行酶活性濃度的計算。先測定在線性范圍內每分鍾吸光度的變化（ΔA/min），以U/L代表酶活性濃度時，則可按下式進行計算： U/L，t℃=△A/min×F==△A/min×V×106/（ε×V×L）
式中V：反應體系總體積（ml）；106：將mol換算成μmol；ε：摩爾吸光系數（cm2/mol）；v：樣品體積（ml）；L：比色杯光徑（cm）。當條件固定時，從理論上講V、v和L均為固定值，ε值為常數，所以F值是恆定的。F值對酶的測定十分重要，過高雖然測定的線性較寬，但重復性差，反之精密度雖好，但檢測線性窄，因此應根據實際情況進行合理的設置和應用。但是在臨床實際工作中，儀器諸多因素如波長的准確性、半波寬的大小、比色杯光徑及磨損與清潔度、溫控的准確性、加樣系統狀況等若不符合要求或發生變化都會影響指示物的ε值或上述公式中的相關項，因此應在具體儀器條件下，定期檢查和實際測定指示物的實測ε值和F值。因為純NAD（P）H溶液不穩定，所以NAD（P）H的ε值需用葡萄糖己糖激酶法實測，實際操作為將某一濃度的葡萄糖溶液重復5-10次測定，得到相應的一組吸光度A值，求出Aˉ±s，注意s必須低於規定的批內允許值，再根據下面兩個公式分別計算出NAD（P）H的實測ε值和F值：
式中C為標准液濃度（mol/L）。其他一些色素源指示物在不同的介質環境中，其ε值會發生程度不等的變化，對5-硫代-2-硝基苯甲酸、對硝基苯酚、對硝基苯胺等這些可得到高純而穩定的指示物，可將其配製在一定的介質中，按臨床標本用的現場試劑和儀器測定吸光度求實測ε值及F值。
9.線性度是非線性比率的界線，常用%表示，其計算公式為，式中：k1為連續監測時間2/3內前讀數時間的斜率，k2為後2/3讀數時間的斜率，k3為總的斜率，一般設置為15%.對一些酶活性項目，可以適當放寬，當不需要設置檢查界限時，設置其為0.線性百分數大，說明Δk之間已不成線性；超過極限值說明底物不足，檢測結果會變低，應稀釋後重測。 10.底物耗盡限額選擇連續監測法或兩點終點法時設置，不同型號分析儀的設計不一樣，有的為零點與監測第一點吸光度的差額，有的為吸光度上升或下降至指定吸光度（MAX-OD/MIN-OD）的數值。超過限額說明樣品的酶活性非常高，底物消耗太快，在儀器程序規定的線性反應期內吸光度的變化往往不代表真正的酶活力，導致結果偏低，該樣品應稀釋一定的倍數重新測定。
㈤ 線性范圍如何確定為何線性范圍越寬越好
採用校準曲線法定量，並至少具有6個校準點（包括空白），濃度范圍盡可能覆蓋一個或多個數量級，每個校準點至少以隨機順序重復測量2次，最好是3次或更多；對於篩選方法，線性回歸方程的相關系數不低於0.98；對於准確定量方法，線性回歸方程的相關系數不低於0.99；首先,線性范圍不是越寬越好,線性范圍的確定和被檢測樣品的濃度有關,待檢樣品的濃度落在線性范圍內就可以了,其次是截距越小,用一點法計算越准確。
JL直線位移感測器有些用戶在選型方面，不知道選啥樣的，哪種型號才是適合自己的，在這里，精量電子科技小編要對這個問題給大家分享一下：首先要明白自己的測量工作，才可以考慮哪種原理的位移感測器適合，因為即使測量同一物理量，也可以通過不同的原理實現。其次就得考慮量程、空間是否足夠、安裝方式、模擬信號還是數字信號、直接測量還是間接測量等等多種因素。因為精度等級關乎到整個系統精度，是一個非常重要的參數。所以，精度越高，直線位移感測器的價格越貴。靈敏度指輸出量的增量與相應的輸入量增量之比。我們得正確認識該參數，它分為兩方面：在線性范圍內，靈敏度高，輸出信號值比較大，這是優點。靈敏度高，與測量無關的外界雜訊也容易混入，在處理過程中，影響精度。線形范圍是指輸出與輸入成正比的范圍，拉繩直線位移感測器都希望線性范圍越寬越好，線性范圍越寬，量程就大，精度就高。但是任何位移感測器的線性范圍都是相對的。我們只需要把測量量估算好，以便在線性范圍內。在測量過程中，位移感測器的輸出總有一定的延遲，跟實際值也有一定的差別。所以我們希望頻率響應快一點，這樣延遲時間就短一點。但由於受到結構等特性的影響，頻率也難以提高。綜上所述就是JL直線位移感測器在選型是要注意的幾個方面，也不是說價格越高，越適合自己，這要根據自己的實際情況而定，量程、空間、信號多個因素會為自己找到一款合適的感測器，有什麼特殊要求，請及時聯系小編或者技術人員，會為用戶選擇一款合適的感測器，期待大家的關注。
㈥ 評價一個儀器分析方法的分析特性一般從哪些方面考慮
方法檢出限，評價檢測方法的靈敏度。
重復性和再現性，評價方法的穩定性。
回收率和測量不確定度，評價方法的准確度。
線性范圍，評價方法在什麼濃度范圍內可以對被測物准確定量。