豬瘟病毒E2蛋白分析液相方法

1. 豬瘟的治療

簡介
在歐洲稱為古典豬瘟{classical swine fever．CSF），是由豬瘟病毒（HCV或CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，豬是該病毒唯一的自然宿主。於1833年首次發現於美國俄亥俄州，百餘年來其流行遍及全球。國際獸疫局將其定為A類傳染病，中國《動物防疫法》將其列為一類傳染病．是目前危害中國養豬業發展的主要疫病之一。中國豬瘟兔化弱毒疫苗在防治豬瘟中曾起到決定性作用，但近幾年來出現免疫效果不理想．應用組織培養弱毒苗也發生免疫失敗，究其原因比較多。由於豬瘟造成的經濟損失巨大．歷來是各國研究的熱點。
csFV基因結構與功能的研究
CSFV為有囊膜病毒，40--60 nm，單股正鏈RNA。CSFV基因組長約1 2 3 kb，僅含有一個大的開放性閱讀框架（ORF）．此ORF翻譯成含3898個氨基酸殘基．分子量約438 kDa的多聚蛋白，並進一步在病毒和宿主細胞蛋白酶的作用下加工為成熟蛋白．cSFV的所有結構蛋白和非結構蛋白均由該ORF所編碼。ORF兩側是5』一端非翻譯區（5』-UTR）和3』一端非翻譯區（3』-UTR）．且5』一端無帽子結構．3』一端無poly(A）尾巴。這一大前體蛋白以共翻譯和後翻譯的形式在細胞蛋白酶和病毒特異蛋白酶作用下．加工成結構蛋白和非結構蛋白，其結構蛋白和非結構蛋白在病毒RNA上的編碼順序為Npro、c、Erns(E0）、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、 NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80），除c、E0、E1和E2為結構蛋白外．其餘均為非結構蛋白。
目前已經定位的CSFV蛋白有5種，即 Npro、c、Erns(E0）、E1和E2．它們均由CSFV的 RNA-ORF5』一端所編碼。在結構蛋白中，最具有免疫防制研究價值的是EO和E2。
1.1 c，是病毒的衣殼蛋白，也稱p14，由病毒ORF中的Setl 69～Al a267組成．是 CSFV核衣殼蛋白其N端由CSFV非結構蛋白p23的水解作用產生，c端可能是由宿主細胞的信號肽酶作用所致。
1．2 gp44/48，是病毒的一種囊膜糖蛋白．也稱Erns．舊稱E0。有9個可能的糖基化位點，去糖基的蛋白骨架分子量約26KDa，由病毒ORF中Glu168-Ala494組成。在感染細胞中gp44/48在內質網內積累，並可存在於細胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中gp44/48以97KDa的同源二聚體形式存在於囊膜表面。由於其分子內缺乏疏水的膜錨定區，與病毒囊膜結合力弱．易從囊膜上游離下來。gp44/48可誘導產生豬瘟的中和抗體．免疫豬可誘導產生對致死量CSFV的保護性免疫。由於編碼 gp44/48的核酸序列在屬內比編碼gp55的序列保守程度高，因此E rns可作為防治豬瘟的一種靶蛋白。
Erns具有RNase活性，作用於單鏈的 RNA．且對富含u的序列活性最高。4ng的 Ems在體外即可將CSFV基因組RNA完全降解。推測Ems沒有將其自身RNA降解掉的原因可能是由於空間上的隔離。在宿主細胞中，新合成的E rns在內質網腔內．而其基因組RNA則在胞漿中：在病毒粒子中，定位於囊膜的Ems與其基因組RNA間隔著衣殼蛋白．因此E rns是不會降解其自身RNA的。編碼Ems的基因是瘟病毒屬病毒所特有的．黃病毒科中其他病毒基因組內無此基因．推測該基因是病毒與宿主細胞的RNase基因重組得到的。
1.3 gp33，是CSFV囊膜糖蛋白．也稱E1，去糖基的蛋白骨架分子量21．8KDa．由1 95個氨基酸殘基（ORF編碼的Leu495至GlY68。組成，內有3個可能的糖基化位點。其蛋白骨架中有兩段疏水序列（Leu548～ Pro579～Gly689）。在多聚蛋白轉位過程中，前一段是E1向內質網腔轉位的終止信號，後一段則充當E2轉位的信號肽，除此之外，這二段疏水區還充當E1的膜錨定位點。E1在病毒囊膜內．不能誘導豬產生抗體。
1.4 gp55．為CSFV的另一囊膜糖蛋白，又稱為E2，是病毒主要的抗原蛋白，也是三個病毒糖蛋白中保守性最低．最易變異的分子。gp55常以100kDa的同源二聚體及與gp33形成75kDa的異源二聚體形式存在於病毒粒子及CSFV感染的細胞表面。在體外gp55可誘導產生病毒的中和抗體，體內可誘導產生抗CSFV的攻擊的抗體。Hulst用20μg昆曳細胞表達的E2雙相油包水乳劑免疫豬，能抵抗1 00LD50 CSFV Brescia毒株強毒的攻擊。gp55的蛋白骨架由370個氨基酸（ORF編碼的690-1060氨基酸殘基）組成．並以其c端的40個疏水氨基酸錨定在膜上。由於糖基化程度不同。E2的分子量可為51-58kDa。E2分子內的1 5個Cys殘基在屬內均保守，其中N端6個Cys殘基參與抗原結構域的形成，c端9個Cys殘基則參與同源、異源二聚體的形成。
gp55的抗原決定區在其N端部分（ORF編碼的第690-866氨基酸），可分為2個獨立的抗原結構單元，四個抗原結構域A．B．C，D。其中結構域A又可分為A．， A2，A3三個亞域。結構域B．c屬於一個結構單元．均為中和抗體的結合位點．由 ORF編碼的690～800氨基酸殘基參與構成。Cys693與CYS7377形成的二硫鍵對結構域 B、c的空間結構至關重要。另一個結構單元含A．D抗原結構域。A1、A2亞區定位於第795-851氨基酸殘基，在種內保守A1是一個抗體的中和位點。亞區A3定位於766-813氨基酸殘基．而氨基酸殘基766-800則參與了結構域D的構成。cys792～ Cys856及Cys818～Cys828間的二硫鍵對這個結構單元空問結構的形成是必需的。連接這兩個結構單元的是一段屬內保守的疏水序列．推測這段序列參與了病毒侵入細胞過程中的膜融合過程。
1.5 Npro，也稱p23，CSFV的非結構蛋白，是ORF編碼的多聚蛋白N端的第一個蛋白質。Npro由168個氨基酸組成．具有蛋白質水解酶活性，能以自催化的方式從正在翻譯的多聚蛋白上斷裂下來，成為成熟的病毒蛋白。序列比較發現，編碼p2 3的基因在瘟病毒屬中是較為保守的。它的斷裂位點在Cysl 68與其下游的病毒核衣殼p1 4 N端第一個氨基酸ser。間。Npro的 cys69和His130可能位於其酶活性中心．能水解斷裂Cys與Ala及Gly與Ser間的肽鍵，斷列位點位於活性His殘基下游38個氨基酸殘基處。Npro不參與CSFV的結構及非結構蛋白的加工過程．其蛋白酶活性在 c S F V增殖過程中的作用還不清楚。Rumenapf等人使用定點突變技術對參與 Npro催化活性的氨基酸殘基進行測定．確定了其中的GIu22、His49和Cys69是保持Npro蛋白酶活性所必需的氨基酸殘基，而 His130並非必須。
實驗窒診斷
目前豬瘟流行常常表現無規律的地區性散發．發病特徵不典型，以發熱、精神沉鬱、食慾減退、咳嗽、共濟失調、結膜炎以及腹瀉、圍產期死亡、死胎、流產。中等毒力及強毒感染有以上這些症狀，並且在豬群中不分年齡快速傳播。結合這些臨床症狀進行實驗室診斷是必要的。
2.1 病毒抗原的檢測豬瘟病毒抗原的快速檢測對於豬瘟的診斷具有特別重要的意義。目前快速、敏感的檢測方法是利用免疫組化技術檢測扁桃體組織。扁桃體中豬瘟病毒抗原可早在感染後2d檢測到．淋巴結、脾臟以及胰腺均可作為病毒早期檢測的組織樣品。Delas Mulas等及Narita等報道了一種檢測豬瘟病毒抗原的免疫組化方法．即利用針對E2糖蛋白的單克隆抗體檢測福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣品的免疫組化方法。該方法的優點是能檢測長期保存的樣品，缺點是較費時．而且福爾馬林固定後的組織不能再進行病毒分離。利用鏈酶一生物素一過氧化物酶（ABc）的免疫組化方法也能用於豬瘟病毒組織切片上抗原的檢測。據報道流式細胞儀也可進行血樣中豬瘟病毒的檢測，但其敏感性較低。以豬瘟強毒感染仔豬，利用抗原捕獲ELISA方法檢測其病毒血症，結果表明該方法可用於豬群中流行病學的調查。但其敏感性以及特異性均低於傳統的實驗室方法。
2.2 感染性病毒的檢測病毒分離是目前體外檢測感染性豬瘟病毒最特異的方法。已報道有幾種方法可以從組織、全血中分離病毒，白細胞是分離病毒的最佳樣品。然而一些研究人員發現，白細胞以及單核細胞在動物感染後較長時間才能感染病毒。因此，對於豬瘟的早期診斷．全血或血漿可能比白細胞更為敏感。最常用於豬瘟病毒分離的細胞為豬腎細胞（PKl 5或SK6）或豬睾丸細胞（sT）。日本建立了一種豬腎由來的傳代細胞系（FS-L3）．FS-L3細胞在不感染病毒的情況下呈大園球狀．數倍至數十倍於普通細胞．但一旦感染了豬瘟病毒，FS-L3細胞的大園球狀即消失．這一特性已被用作豬瘟病毒的中和試驗等各種生物學特性的測定。經研究發現，產生細胞病變的毒株是因為它的遺傳基因發生了變化。從5』末端的第一個核苷酸到4764個核苷酸均已缺失．其中包括5』末端的非編碼區、自身蛋白分解酶、衣殼蛋白、糖蛋白（E0、 E1、E2）、非結構蛋白NS-1、和NS-2的基因均已缺失。
2.3 豬瘟病毒基因組檢測 已報道利用RT-PCR方法檢測豬瘟病毒RNA有數種程序。瘟病毒屬特異的引物多選自基因組的5』端保守區．其最突出的優點是其產物能用來直接測序，直接進行病毒株的分型。一般來說套式RT-PCR方法是檢測豬瘟病毒更敏感的方法，但其缺點是比較費時．不適用於大量樣品的檢測。McGoldrick等報道了一種檢測豬瘟病毒的單管熒光RT-PCR方法。此方法可檢測出仔豬血樣中感染了中等毒力或高等毒力的豬瘟病毒，其敏感性高於病毒分離方法．並且簡化了試驗程序．減少了污染的風險．還可進行大量樣品的檢測。
2.4 抗體檢測最常用的檢測豬瘟病毒抗體的方法多以病毒中和試驗為基礎。目前已建立數個特異的檢測血清抗體的E LlSA方法．包括檢測針對粗蛋白、特異結構蛋白如E2、E rns以及非結構蛋白NS3抗體的方法。目前使用最廣泛的是CSFV E2 ELISA，其敏感性與VNT相比為90%～99%．特異性為99%。Leforban等建立了一種ELISA方法，能夠區分BVDV、BDV以及 CSFV抗體。這個方法對於BVDV/BDV高流行地區（如荷蘭)csF的檢測非常有意義。ELISA特異性與敏感性的提高是目前面臨的最大的挑戰。
當前，豬瘟仍是世界養豬業的一大威脅．1 997-1 999年期間在德國、荷蘭、西班牙和義大利等國都曾多次暴發了豬瘟，在中國CSFV的持續性感染和疫苗保護效力下降的現象也比較普遍，這不僅給養豬業造成了嚴重的經濟損失，而且也給豬瘟防治政策的制定帶來了一定的困難。不過，相信隨著CSFV分子生物學和檢測方法研究的進一步深入，這些問題都會得到最終解決。

2. 豬得了豬瘟咋辦呢

豬瘟是由豬瘟病毒引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病。急性病例呈敗血症變化；慢性病例主要在大腸，特別是在回盲口附近發生紐扣狀潰瘍。因此，該病又叫「爛腸瘟」。不分年齡、性別、體重大小，也不分季節，一旦豬群中一頭發病，會很快在全群中流行，死亡率較高。病的潛伏期平均為7天。
病豬主要表現體溫升高到41℃以上，持續不退，精神沉鬱，食慾減退或不食，眼發紅，有眼眵，弓背，打冷戰，走路打晃，常喜鑽草堆。病初糞便乾燥，後期拉稀。公豬包皮積尿，皮膚出現大小不一的紫色或紅色出血點，指壓不褪色。嚴重時出血點遍及全身，常有咳嗽。有的出現神經症狀，打轉轉，或突然倒地、痙攣，甚至死亡。
剖檢皮膚有點狀出血，喉頭、腎臟、膀胱均有針尖狀與小米粒般大出血點（指壓不褪色），脾臟有出血性梗死，回盲瓣有紐扣狀潰瘍。
【防治措施】
目前，對於該病還沒有有效的治療方法，主要靠平時的預防。
（1） 定期預防注射，每年春秋兩季，除對成年豬普遍進行一次豬瘟兔化弱毒疫苗注射外，對斷奶仔豬及新購進的豬都要及時防疫注射。將豬瘟兔化弱毒疫苗按瓶簽說明加生理鹽水稀釋，大小豬一律肌內注射1毫升，注射後4天即可產生免疫力。
（2） 豬瘟常發疫區，仔豬出生後21～30日齡注射一次，55～60日齡仔豬斷奶後再注射一次，保護率可達100%。
（3） 緊急免疫接種，在已發生疫情的豬群中，做緊急預防注射，能起到控制疫情和防止疫情擴大蔓延的作用，注射時可先從周圍無病區和無病豬舍的豬開始，後注射同群豬，病豬一般不注射。為加強免疫力，注射時可適當增加劑量。
（4） 加強飼養管理，定期進行豬圈消毒，提高豬群整體抗病力，杜絕從疫區購豬。新購入的豬應隔離觀察30天，證實無病，並注射豬瘟疫苗後方可混群。
（5） 在豬瘟流行期間，飼養用具每隔3～5天消毒一次。病豬消毒後，徹底消除糞便、污物，鏟除表土，墊上新土，豬糞應堆積發酵。在病豬初期，可試用抗豬瘟血清給豬注射，其劑量為每千克體重2～3毫升，每天注射一次，直至體溫恢復正常。

3. 請問如何檢測豬瘟病毒

豬瘟又稱「爛腸瘟」，是由黃病毒科瘟毒病屬的豬瘟病毒引起豬的一種急性、發熱、接觸性傳染病。急性病例呈敗血症的臨診症狀，剖檢可見內臟器官出血、壞死和梗死。慢性經過的病例，主要是纖維素性壞死性腸炎。常有副傷寒及巴氏桿菌病繼發感染。由於貫徹了預防為主的方針，豬瘟基本上得到了控制。但豬瘟仍是目前危害較大的疫病，在不斷總結防治經驗的基礎上，應該繼續做好防疫工作，減少豬瘟造成的損失。
診斷要點
發病特點
在自然情況下，只是豬和野豬感染發病，任何年齡、品種、性別的豬都可以發病；本病在任何季節都可以發生。
不按期進行預防注射的地區，一旦發病，在短期內可造成廣泛的流行。發病和死亡都很高。在常發地區或注射密度不很高的地區，可呈零星散發。
病豬是主要的傳染源。傳染途徑主要是消化道，也可通過呼吸道、眼結膜及皮膚傷口感染。豬只的買賣、運輸、屍體處理不當，肉品衛生檢驗不嚴，獸醫衛生措施執行不力，人、動物和昆蟲等都可成為間接的傳染媒介，促進本病的發生和流行。通過胎盤傳染使子豬患病，成為防治中十分棘手的問題。
臨診症狀
豬瘟與發生敗血症的豬丹毒、豬肺疫和子豬副傷寒在症狀方面很相似，較難分辨，應注意區別診斷。豬瘟的臨診特點是：體溫升高到40.5℃～41℃，呈稽留熱，有膿性結膜炎，病初便秘，後腹瀉；在病豬耳後、腹部、四肢內側等毛稀皮薄等處，出現大小不等的紅點或紅斑，指壓不退色；公豬有包皮發炎，用手擠壓時，有惡臭混濁液體射出，急性病例，多在1周左右死亡，死亡率可達60%～80%；小豬有神經症狀，慢性病例，體溫時高時低，食慾時好時壞，便秘與腹瀉交替發生，病豬明顯消瘦，毛焦臁糜，行走不穩。一般病程可達20天或以上，死亡居多。
病理剖檢變化
急性豬瘟主要呈敗血症變化，有診斷價值的變化是：皮膚或皮下有出血點；顎凹、頸部、鼠蹊、內臟淋巴結腫大，呈暗紅色，切面周邊出血；腎臟色淡，不腫大，有數量不等的小點出血；脾臟邊緣梗死；喉頭黏膜、會厭軟骨、膀胱黏膜、心外膜、肺及腸漿膜黏膜有出血。慢性病豬特徵的變化是盲腸、結腸及回盲口處黏膜上形成扣狀潰瘍。
實驗室檢查
常採用的方法有：血清學檢查、豬瘟兔化弱毒免體交互免疫試驗，生物學試驗（非免疫豬種）、熒光抗體試驗等。
近些年來，急性豬瘟少發，常有非典型性豬瘟（溫和型）病豬出現，其特點是病型溫和，病熱緩慢，病變局限，呈散發等不典型表現，這就須經實驗室檢驗方可做出可靠的診斷和鑒別。
防治方法
做好平時的預防工作
做好豬瘟的預防注射工作，是防止豬瘟發生的關鍵措施。每年採取定期注射和適時補針相結合的辦法，用豬瘟兔化弱毒凍干苗，稀釋後大小豬一律肌肉注射1毫升。注射後第4天即可產生免疫力，免疫期可達1年以上。選擇適合本場的免疫程序。
實行自繁自養的辦法
若需要從外地購買豬種，運回後還須隔離飼養半個月左右，並進行疫苗注射，進行實驗室豬瘟抗原檢測陰性，方可混群飼養。
加強集市管理和運輸檢疫
杜絕病豬在集市出售和收購、運輸，以防傳播疫病。生豬交易市場、豬庫、屠宰場等豬只集中場所，特別應加強獸醫衛生管理及檢疫措施。
改善飼管
改善飼養管理，搞好圈舍、環境及管理用具的獸醫衛生、消毒工作。
發生豬瘟時的緊急措施
目前尚無有效葯物治療豬瘟。早期診斷，及時採取措施，對控制和消滅豬瘟，減少經濟損失有重要意義。
（1）病豬及可疑病豬，立即隔離飼養。特別是貴重的種豬，在備有抗豬瘟血清的單位，可用於治療。
（2）對發病豬場及附近尚沒有發病的豬只，立即全部用豬瘟兔化弱毒疫苗進行緊急注射，可有效地制止新的病豬出現，縮短流行過程，減少部分損失。
（3）發病豬舍、運動場、飼養管理用具，用2％熱鹼水或30％草木灰水等進行消毒。糞尿及墊草等污物，堆積發酵後作肥料利用。
（4）死豬深埋或銷毀、化制；急宰病豬的肉，可根據當地條件，同有關人員商定處理辦法。

4. 哪裡能檢測非洲豬瘟病毒，檢測要多長時間

農業農村部：在動物檢疫中對生豬及其產品開展非洲豬瘟病毒檢測，應當使用我部批准或經中國動物疫病預防控制中心比對符合要求的檢測方法及檢測試劑盒（試紙條），確保檢測結果准確。符合要求的檢測方法及檢測試劑盒（試紙條）可從中國動物疫病預防控制中心網站查詢。

中國動物疫病預防控制中心與中國動物衛生與流行病學中心、中國獸醫葯品監察所、中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所等單位共同組成了評價專家組，開展了非洲豬瘟現場快速檢測試劑評價工作

中國動物疫病預防控制中心：

非洲豬瘟病豬主要臨床表現差異較大，不易識別，但通常有以下幾種或全部典型症狀，包括高熱、嘔吐、腹瀉或便秘，有的便血，虛弱、難以站立，體表不同部位（尤其是耳、鼻、腹部、臀部）皮膚呈紅色、紫色或藍色，有的咳嗽、呼吸困難，母豬流產、產死胎或弱胎。出現上述臨床症狀後，一般2-10天內死亡。剖檢可見內臟多個器官組織出血，脾臟顯著腫大，顏色變暗，質地變脆。部分首次發生非洲豬瘟的養殖場，豬群發病非常急，最急性型不表現任何症狀而突然死亡，無特徵性剖檢病變。

資料來源：中國動物疫病預防控制中心《非洲豬瘟現場排查手冊》

5. 豬病常用的血清學診斷方法有哪些

抗原和相應的抗體在動物體內或體外都能發生特異性結合反應，這種反應稱為抗原抗體反應，習慣上把體內的抗原抗體反應稱為免疫反應，體外的抗原抗體反應稱為血清學反應，因為抗體主要存在於血清中。

血清學反應可以用已知的抗體檢查未知的抗原，也可用已知抗原測定未知的抗體。人們根據抗體能與相應抗原發生反應並出現可見的抗原—抗體復合物的原理，設計了許多血清學診斷方法，不僅可以檢測動物體內乃至體外的病原微生物，或其抗原性成分，而且還可以測定動物機體對病原微生物的侵襲或對其抗原成分的免疫反應。在抗原—抗體復合物成不可見狀態時，可以通過瓊脂擴散、凝集實驗以及酶標記等指示系統，使其變為可見或可測狀態。

目前已知的血清學診斷方法很多，現僅介紹幾種在目前條件下規模化豬場通過學習都能做到的診斷方法：

（1）凝集試驗豬病診斷過程中常用的操作方法有以下幾種：

①全血平板凝集試驗實踐中主要用於細菌性疾病的抗體檢測和抗原（經分離培養後）的鑒定。現舉例用已知豬丹毒抗原（丹毒桿菌的純培養液）測定被檢豬血清中的抗體。其操作步驟如下：

a.材料豬丹毒凝集抗原，玻片，9號針頭，酒精棉球，酒精燈，鉑耳（取血環）等。b.操作用鉑耳取已知抗原1滴，置於玻片上。用酒精棉球擦拭針頭，鉑耳在酒精燈上灼燒消毒。用針頭刺破被檢豬的耳靜脈，以鉑耳取血與玻片上的抗原等量混合，在2～3分鍾內觀察結果。c.結果判定出現顆粒狀的凝集，為陽性反應。否則為陰性。

②試管凝集試驗是一種定量法，用於測定被檢血清或其他體液中有否某種抗體及其效價，可做臨床的輔助診斷，或用於流行病學監測。在豬場中，本法常用於豬布氏桿菌病的診斷。

A.材料布氏桿菌病試管凝集抗原（1∶20倍稀釋），布氏桿菌病陽性血清、陰性血清（1∶25倍稀釋），稀釋液（0.5 %石炭酸生理鹽水），滅菌小試管，1毫升吸管，試管架，待檢血清等。B.操作取試管7支置於試管架上，設陽性和陰性血清及抗原對照各1支，測定管4支，以後每增加1個樣品，只需增加4支測定管。

按表10示意稀釋血清，加抗原，完成後每支試管內應含1毫升液體。