hplc分析方法開發

1. 如何建立HPLC法測定有關物質的方法

一、開始之前必須明白：
1、有關物質來源的兩種途徑：
1）合成過程中的中間體和副產物；
2）儲存過程中產生的降解產物；
2、分析你的樣品結構，熟悉樣品的基本性質；
3、樣品中可能含有的中間體；
4、樣品的基本穩定性和可能產生的降解產物；

二、准備工作
1、查閱文獻，看看是否同行已經做過類似的工作，有的話就簡單了，直接奔主題了。
2、沒有文獻（苦！），那就很是麻煩了。
1）分析結構，看看有無紫外吸收，有就比較簡單，選用紫外檢測器就行了，沒有的話那就麻煩，可以選用蒸發光散射檢測器等；
2）分析結構，看看選用何種色譜方式進行分離（正相或者反相色譜）；
3）分析結構，看看流動相該如何選擇，要不要選用一些離子對試劑。
4）分析結構。。。。。。
5）與同類產品進行比較；

三、開工（以紫外檢測為例）
1、流動相的選擇（採用粗品進行選擇）
1）、有文獻，按文獻進行優化。不過我得提醒一下，文獻的方法參考是可以的，要想完全按照他的條件做出來是很難的。
2）、沒有文獻。。。。。。
a、紫外掃描一下，看看哪裡有最大吸收。將能得到的中間體、副產物、分解產物、樣品配成相同濃度，在紫外掃描分光光度計上掃描一下，選擇所有物質具有相同的最大吸收處的波長作為測定波長。要是有pda檢測器就不需要這一步了。
b、還是得找一些資料，看看類似的樣品的流動相，以它為起始流動相進行選擇，如果沒有，那就找專業書吧，看看它是怎麼教你選擇流動相的。
2、最低檢測限
3、系統適應性試驗
重復進樣5次，記錄色譜圖，給出系統評價報告
4、考察中間體及副產物和樣品的分離度。同時定出中間體在色譜圖中的出峰位置，為定質量標准提供依據。
5、考察降解產物和樣品的分離情況。
這個一般是通過破壞性試驗來考察。常用的一般是高溫、強光、氧化、強酸、強鹼五個因素進行考察，通過考察，應該可以知道色譜圖中那些峰是由於什麼因素產生，這個也可為定質量標准提供依據。
6、根據上面的試驗，應該可以知道樣品的一些大概情況了，樣品中有哪些雜質應該比較明確了。現在對三批樣品進行測定，通過歸一化來觀察，應該可以知道雜質的大概情況，根據這個可以定出相應採用自身對照法測定的雜質限量。一般情況下還應定出最大的單一雜質限量。如果樣品中的雜質可以很好得到純品，那麼你就可以採用外標法來准確定量。
7、雜質的限量必須根據你的樣品本身性質來定。

2. 如何建立HPLC法測定有關物質的方法.ppt

摘要 本文就如何建立TLC法測定有關物質的方法進行論述，系統地闡述了薄層色譜法各條件確定的原理，並列舉了質量標准制訂中存在的某些問題。
關鍵詞 薄層色譜法（TLC法） 有關物質 方法建立
有關物質是研究品中除主成分以外的雜質，它可能是原料合成過程中帶入的原料、中間體、試劑、降解物、副產物、聚合體、異構體以及不同晶型、旋光異構的物質，也可能是制劑過程中產生的降解物，或是在貯藏、運輸、使用過程中產生的降解物等[1]。這些雜質的存在直接反映品的有效性和安全性，故要對其進行研究，特別是在品申報的質量研究資料中需建立其檢測方法，並根據生產、穩定性考核等實際情況考慮是否在質量標准中制訂該檢查項，規定其限度。目前，有關物質的常用測定方法有高效液相色譜法(HPLC法)和薄層色譜法(TLC法)。
TLC的特點是快速、簡便，尤其是對無紫外吸收的雜質測定，更具有其應用價值。如能將TLC法與HPLC法有機地結合、或彼此間進行比對研究，便可得到更多、更為准確的有關雜質信息，做到兩方法間的相輔相成，相益得彰！本文將著重討論如何建立薄層色譜法測定有關物質的方法。
1．測定方法類型
常用的方法有雜質對照品法（適用於已知雜質）和自身（稀釋）對照法（適用於一般雜質檢查，雜質成分少且尚不能取得雜質對照品）。目前國內由於難以獲得雜質對照品、故一般均採用自身對照法。
2．展開劑的確定（即專屬性試驗）
專屬性的研究是提供被分析物在雜質和輔料存在時能被區分的證明，該點是色譜條件建立的關鍵。通常採用在被分析物的對照品或精製品中加入一定量的雜質或輔料，證明色譜條件可將各雜質與被分析物分離[1]。這里的關鍵是：將多少量的雜質加入到多少量的主成分中。正確的作法是將1%(w/w)濃度量的各雜質加入到100%濃度的主成分中，配製這樣的溶液來
驗證系統適用性。之所以如此配製，目的是模仿樣品中有可能存在的狀態，即有少量（1%左右）雜質存在時是否能與主成分達到完全分離，只有這樣才能比較客觀、科學地反映樣品中實際存在情況的（見圖1）；而不應把該溶液配製成：主成分與中間體相同濃度的。因為一者實際檢測時樣品中不可能存在此種情況；二者該濃度不易確定，目前國內申報資料中一般的作法均是配製成較低的一致濃度，這樣各斑點當然易於完全分離了（見圖2），但在實際測定時，由於主斑點急劇增大，很易將相鄰雜質包含於主成分斑點中。同樣，質量標准中的系統適用性試驗用溶液的配製方法亦如此。

（1，3，4為雜質，2為主成分）
圖1 圖2 （雜質濃度均為供試品溶液濃度的1%）
3．檢出條件的確定
其基本出發點是：主成分與相關雜質均應在該條件下顯色，且在相同濃度下，斑點大小應基本一致。薄層板的類型根據被測物質的性質來選用，測定有紫外吸收的物質通常選用GF254或GF365板；測定無紫外吸收、需噴顯色劑的，常選用硅膠G板或H板，選用該類薄層板時，顯色方法根據被測物質的結構式選取，但當有多個顯色方法時，應分別進行試驗，選取靈敏度最高的顯色方法。如醋酸氫化可的松有關物質的測定，中國典2000年版採用鹼性四氮唑藍試液顯色，美國典26版採用硫酸-乙醇(10:90)溶液顯色，兩者均為激素類物的顯色方法。醋酸氫化可的松屬於激素類中的腎上腺皮質激素，四氮唑法是腎上腺皮質激素的重要顯色方法；而硫酸-乙醇顯色法則主要是針對激素類中的的顯色反應，對於屬於腎上腺皮質激素類的醋酸氫化可的松則反應活性不強，結果兩法的靈敏度相差10倍以上。因此，檢出條件的確定，一定要在查閱文獻的基礎上，並根據試驗結果進行綜合考慮。
4．供試品溶液濃度的確定（靈敏度試驗——最低檢出限的測定）
供試品溶液濃度的設定在有關物質檢測中是至關重要的，濃度越高、越能反映樣品中雜質存在的情況，但若設定得過高，則會產生主斑點嚴重拖尾、「斷腰」等超載現象的發生，產生錯誤結論；若設定太低，又將達不到檢測雜質的目的，觀測不到雜質量的變化。其設定是根據最低點樣量和最大點樣量來綜合考慮的。
最低檢出限雖然是個絕對值，但真正的意義卻是其相對值，即相對於供試品溶液的濃度多少而言，所以測定結果不僅要羅列出其絕對值又應列出其相對值，這樣最低檢出限才有意義！最大點樣量則是通過不斷加大供試品溶液濃度，直至主斑點嚴重拖尾、「斷腰」等情況出現時來得到的。然後根據最低檢出限，採用「上推法」來確定：如一般設定雜質斑點小於1.0%對照斑點，對照溶液的濃度至少應為最低檢出濃度（即最低檢出限）的20~50倍，則供試品溶液濃度是最低檢出濃度的2000~5000倍；反過來，最低檢出濃度應至少達到供試品溶液濃度的0.02%~0.05%。應注意的是：由於最低檢出量和最大點樣量因試驗環境、薄層板質量以及即時試驗時其他各因素的不同而改變（即耐受性因數），故供試品溶液的濃度在保證小於最大進樣量的情況下，可在此基礎上設定得再高一些，以保證該濃度可適用於各種條件下。舉例說明見表1（規定雜質限度為1.0%）。

表1 最低檢出量、最大點樣量、供試品溶液和對照溶液濃度之間的比例關系

最大點樣量
供試品溶液
對照溶液
最低檢出量 濃 度 8mg/ml 3mg/ml 30μg/ml 1μg/ml 點樣量 10μl 10μl 10μl 10μl 絕對量 30μg 0.3μg 10ng 相對於樣品測定濃度的 100% 1.0% 0.02% 倍 數 關 系 5000倍 30倍 「基準點」
供試品溶液濃度也可設定得再高些，但不可超過最大點樣量。
5．加樣回收試驗（即准確性試驗）
准確性試驗可採用在預經有關物質測定後的樣品中，加入已知量雜質的方法來評價。准確稱取各雜質，將含有1%(w/w)濃度的各雜質加入到樣品溶液中，以驗證所採用的薄層測定條件是否可分離檢測出相應的各雜質以及樣品中已存在的雜質是否累加，斑點是否加深。該原理同前面所述的專屬性研究是一致的。
6．強力破壞試驗
該項研究是為了揭示原料內在穩定性的特性，它是開發研究的一部分。這些試驗是在比加速試驗更劇烈的條件下進行的，其能夠包含品在銷售過程中所遇到的劇烈條件。可取一批樣品通過強光、高溫、高濕、氧化破壞、以及酸鹼破壞來證明該展開條件能分離檢測出雜質。
7．展開距離
測定時一定要採用25cm、長薄層板，展開距離應盡可能長一些，以使雜質與主成分盡量分離。如用短板，易造成臨近主斑點的雜質斑點「躲進」主斑點中。但同時又應注意，距離拉大，斑點分散，會損失最低檢出限，降低靈敏度，故應綜合考慮。
8．其它的因素
展開溫度應盡量控制在20~25℃之間，尤其在冬季，應注意環境的溫度，如太低，將嚴重影響展開效果。另層析缸的蓋兒，應塗抹凡士林油，以保證整個試驗過程中，層析缸的密封，避免展開劑揮發；並應在展開前，預先傾入展開劑，以使層析缸內的空氣飽和，達到最佳的展開效果。薄層板由於有自製、市售，質量不一也應注意。
二．討論
1． 質量標准中的系統適用性試驗，最好能將最難分離的雜質訂入系統適用性試驗用溶液的配製，將此雜質的濃度配製為主成分濃度的1%，或0.5%，或0.2%（依據雜質限度而定）進行試驗，驗證分離度後，再進行樣品的測定，以確保試驗的准確進行。
2． 質量標准中，應配製系列濃度的對照溶液（即梯度對照），以對雜質有「半定量」的概念，這可更好地評價雜質存在的情況；並應規定雜質的個數及最大雜質斑點的限度，使質量標准更完善、科學。經查閱，中國典薄層色譜法測定有關物質的有70個品種，僅有2個品種採用了梯度對照，絕大部分品種僅是制定了對照溶液，均未規定雜質個數，和最大雜質斑點限度，如有若干個雜質斑點也無法判定；而英國典和美國典則幾乎每個品種均採用梯度對照，並規定雜質個數和最大雜質斑點限度，這一點值得學習和推廣。
3． 錯誤的一種誤區，認為HPLC法完全替代了TLC法，這是不正確的，一定要做到相互補充、相互論證、相互參考才是最客觀、最科學的！
本文是在參閱了日本《分析方法驗證》一書和大量日本國內新申報資料中質量研究部
分的內容所寫而成。

3. HPLC原理及基本操作是什麼

原理

高效液相色譜法儀根據各種各樣的相互作用力來分離混合物。這種相互作用力通常是分析物及分析管柱之間的一種非共價性質。

使用高效液相色譜時，液體待檢測物在不同的時間被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由於被測物中不同物質與固定相的相互作用不同，不同的物質順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，每個峰頂都代表一個另外化合物的種類，最後通過分析比對這些信號來判斷待測物所含有的物質。

以液體為流動相而設計的色譜分析儀器稱為液相色譜儀。採用高壓輸液泵，高效固定相和高壓靈敏檢測器等裝置的液相色譜儀成為高效液相色譜儀。高效液相色譜儀種類繁多，但不論何種類型的高效液相色譜儀，基本上都分為4個部分：高壓輸液裝置，進樣系統，分離系統和檢測系統。

操作

將要分離和分析的樣品混合物以不連續的小體積（通常為微升）引入滲透通過色譜柱的流動相流中。樣品的組分以不同的速度通過色譜柱，這是與吸附劑（也稱為固定相）的特定物理相互作用的函數。每個組分的速度取決於其化學性質，固定相（柱）的性質以及流動相的組成。

特定分析物洗脫（從色譜柱中出現）的時間稱為其保留時間。在特定條件下測得的保留時間是給定分析物的識別特徵。

可以使用許多不同類型的色譜柱，其中填充了粒徑，孔隙率和表面化學性質各異的吸附劑。使用較小的顆粒尺寸的包裝材料需要使用較高的操作壓力（「背壓」）的和通常改善的色譜解析度（連續的分析物從柱中出現的峰之間的分離度）。吸收劑顆粒本質上可以是疏水的或極性的。

常用的流動相包括水與各種有機溶劑的任何混溶性組合（最常見的是乙腈和甲醇）。一些HPLC技術使用無水流動相（請參見下面的正相色譜法）。

流動相的水性成分可能包含酸（例如甲酸，磷酸或三氟乙酸）或鹽以幫助分離樣品成分。在色譜分析過程中，流動相的組成可以保持恆定（「等度洗脫模式」）或變化（「梯度洗脫模式」）。等度洗脫通常在分離與固定相親和力非常不同的樣品成分時非常有效。

在梯度洗脫中，流動相的組成通常從低到高洗脫強度變化。流動相的洗脫強度由分析物的保留時間反映，高洗脫強度可產生快速洗脫（=較短的保留時間）。

反相色譜中的典型梯度曲線可能始於5％的乙腈（在水或水性緩沖液中），然後在5–25分鍾內線性增長至95％的乙腈。恆定流動相組成的周期可以是任何梯度曲線的一部分。例如，流動相的組成可以在5％的乙腈中保持1-3分鍾，然後線性變化直至95％的乙腈。

流動相的選定組成取決於各種樣品組分（「分析物」）和固定相之間的相互作用強度（例如，反相HPLC中的疏水相互作用）。根據它們對固定相和流動相的親和力，在色譜柱中進行分離過程中，分析物會在兩者之間分配。

此分配過程類似於液-液萃取過程中發生的分配過程，但該過程是連續的，而不是逐步進行的。在此示例中，使用水/乙腈梯度洗脫，一旦流動相在乙腈中的濃度更高（即，在洗脫強度更高的流動相中），則更多的疏水性組分將較晚洗脫（從色譜柱中洗脫）。

流動相組分，添加劑（例如鹽或酸）和梯度條件的選擇取決於色譜柱和樣品組分的性質。通常對樣品進行一系列的試驗，以便找到可以充分分離的HPLC方法。

用途

高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的應用於化學和生化分析中，常用於醫葯品、化學、環保、生命科學、與食品工業的研究上。

高效液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別，它的特點是採用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，可將液體混合物中的成分分離、成分定性及定量分析。適於分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。例如：可檢測分析食品中的三聚氰胺的含量。

4. HPLC法中定量分析方法大致有哪幾種

氣相色譜定量檢測一般就兩種，一個是外標法，一個是標法，對於沒有標准物質的，就只能靠容面積歸一法粗略定量。

通過對人類和環境有影響的各種物質的含量、排放量的檢測，跟蹤環境質量的變化，確定環境質量水平，為環境管理、污染治理等工作提供基礎和保證。簡單地說，了解環境水平，進行環境監測，是開展一切環境工作的前提。

(4)hplc分析方法開發擴展閱讀：

HPLC根據固定相和流動相的成分分為正相色譜和反向色譜。

正相色譜法

採用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。

5. 如何建立有關HPLC分析標準的步驟和方法

能問得詳細點不？你指的是標准曲線的繪制還是什麼？
用HPLC檢測物質，先要摸清楚HPLC條件：檢測波長，流動相，流速，HPLC柱子。這個條件是指，能檢測出你的物質，而且可以和雜質分開，出峰時間合適，不能過早出峰，否則雜質跟你的目標峰疊加在一起，太晚出峰浪費時間。
摸清楚以後，就做標准曲線啦，然後你檢測的物質的濃度就可以根據標准曲線讀出來了