㈠ 乳酸、丙酮酸和乙酸如何鑒定
丙酮酸檢測試劑盒可測各種動物血清（漿）、組織以及培養細胞、細胞培養上清液等樣本中丙酮酸含量。丙酮酸與顯色劑反應，反應產物在鹼性溶液中顯紅棕色，顏色深淺與丙酮酸含量成正比，通過比色可以測定出丙酮酸的含量。
原理：丙酮酸鹽檢測試劑盒提供了一種簡單、直接和可自動化操作的程序來測量不同生物學標本中丙酮酸的含量。適用標本類型包括：食物、細胞、培養基和發酵培養基。丙酮酸鹽檢測試劑盒基本原理如下：丙酮酸鹽被丙酮酸酶氧化，在酶反應過程中產生顏色（λ=570 nm）或者熒光（Ex/Em=535/587 nm），可使用酶標儀或熒光計檢測到。光的強度與丙酮酸含量是成正比的，因此通過檢測光的強度即可精確的得到丙酮酸的含量。試劑盒檢測范圍為1-10 uM丙酮酸。
丙酮酸檢測試劑盒
丙酮酸分子式CH3COCOOH，原稱焦性葡萄酸(德Brenztr-aubensure)，是參與整個生物體基本代謝的中間產物之一。丙酮酸可通過乙醯CoA和三羧酸循環實現體內糖、脂肪和氨基酸間的互相轉化，因此，丙酮酸在三大營養物質的代謝聯系中起著重要的樞紐作用。
丙酮酸是糖無氧代謝的產物，研究工作者將丙酮酸和乳酸一同測定，並用二者的比值推測循環衰竭的嚴重程度；此外，它還對維生素B1缺乏有一定的研究意義，同時作為一種重要的精細化工中間體,廣泛應用於醫葯、農葯、食品等領域,尤其是作為醫葯中間體,具有良好的發展前景。
應用[4][5]
用於大腸桿菌丙酮酸代謝途徑改造及丙酮酸高產菌株培育
丙酮酸作為最重要有機酸之一,在醫葯、食品、化工等領域以及科學研究中都具有廣泛的用途。目前高質量的丙酮酸在國內市場缺口較大,丙酮酸工業化生產的前景十分廣闊。
從野生型大腸桿菌K-12 MG1655菌株出發,利用CRISPR/Cas9技術敲除了乳酸脫氫酶基因（ldh A）,截斷了乳酸合成途徑;敲除了丙酮酸氧化酶基因（pox B）、磷酸轉乙醯基酶基因（pta）和乙酸激酶基因（ack A）,截斷了乙酸合成途徑;敲除了丙酮酸-甲酸裂解酶基因（pfl B）,截斷了甲酸合成途徑;敲除了磷酸烯醇丙酮酸合成酶基因（pps A）,減少了丙酮酸生成磷酸烯醇式丙酮酸;敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（ppc）,減少了磷酸烯醇式丙酮酸的消耗;通過敲除延胡索酸還原酶復合體基因（frd BC）,削弱了三羧酸循環途徑。最後得到了一株可以初步積累丙酮酸的基因工程改造菌株MG1655-GP7（E.coli K-12 MG1655Δldh AΔpfl BΔack AΔptaΔpox BΔppcΔfrd BCΔpps A）,這株菌在使用5 L發酵罐發酵68小時後丙酮酸產量達到32.07 g/L。
這表明只利用基因工程的手段是可以使大腸桿菌積累丙酮酸的。大腸桿菌利用葡萄糖作為碳源時,葡萄糖經糖酵解途徑會產生過量的ATP與NADH從而抑制丙酮酸的積累,使用氧化程度較高的葡萄糖酸作為碳源可解決此問題;當葡萄糖進入細胞後不經EMP途徑而是進入Entner-Doudoroff（ED）途徑,產生的ATP與NADH的量只有前者的一半,會相應的促進丙酮酸的積累。為了進一步提高產量,作者又敲除磷酸葡萄糖異構酶基因（pgi）以抑製糖酵解途徑;同時敲除6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因（gnd）以抑制磷酸戊糖途徑,並減少6-磷酸-葡萄糖酸的消耗;還在敲除磷酸葡萄糖轉移酶基因（pts G）和磷酸烯醇丙酮酸葡萄糖轉移酶基因（pts I）的基礎上敲入運動發酵單胞菌中葡萄糖轉運蛋白基因（glf）來改良葡萄糖轉運系統,減少大腸桿菌細胞轉運葡萄糖時磷酸烯醇式丙酮酸的消耗。
並計劃上調葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因（zwf）、葡萄糖酸-6-磷酸脫水酶基因（edd）和2-酮-3-脫氧葡萄糖酸-6-磷酸醛縮酶基因（eda）的表達以強化ED途徑,平衡ATP和NADH的水平,引導碳流更多的流向丙酮酸合成方向。
目前通過基因編輯的方法得到了一株生產丙酮酸能力理論上較MG1655-GP7菌株有所提高的MG1655-GP12（E.coli K-12 MG1655Δldh AΔpfl BΔack AΔptaΔpox BΔppcΔfrd BCΔpps AΔgndΔpgiΔpts GΔpts I::glf）菌株,該菌株的生產能力正在評估中。但經多次基因改造後,基因工程菌株MG1655-GP12出現了較野生型菌株生長緩慢的現象,本實驗對該菌株進行了實驗室適應性進化,經多次傳代後篩選到一株生長速度恢復到野生型菌株75%的MG1655-GP12-1菌株。
㈡ 阿司匹林含量的測定方法及適用對象
一，分光光度法測定阿司匹林腸溶片的含量
目的: 建立分光光度法阿司匹林含量的測定方法。方法: 在鹼性條件下, 乙醯水楊酸與羥胺反應生成羥肟酸; 在酸性溶液中, 後者與三氯化鐵形成紅色的羥肟酸鐵, 一定濃度范圍內, 吸光度呈線性關系。結果: 在520nm 波長下, 採用標准曲線法, 測得阿司匹林腸溶片中乙醯水楊酸的含量為25mg/ 片。結論: 方法操作簡便、快速、准確; 可用於阿司匹林含量的測定和產品質量控制。
阿司匹林( C9H8O4, 180.16) 又名: 2-(乙醯氧基) 苯甲酸,或乙醯水楊酸, 是常用的解熱鎮痛葯, 臨床上多用於治療心腦血管方面的疾病, 也可用於消化道腫瘤和老年性痴呆症的預防。
阿司匹林葯片中乙醯水楊酸的含量測定, 大多採用酸鹼滴定法測定和高效液相色譜法分析測定。本方法採用可見分光光度法測定阿司匹葯片中乙醯水楊酸的含量, 操作簡便、快速、准確, 實驗成本低, 可用於阿司匹林葯品的分析和產品質量控制。
1.儀器和材料
儀器: 722 型分光光度計( 上海) , 容量瓶( 25mL) , 吸量管( 5mL , 1mL) 。材料: 2mo l/L NaOH , 4mol/L H Cl, 10%FeCl3 , 7%鹽酸羥胺乙醇液; 0. 5 g / L乙醯水楊酸標准溶液; 阿司匹林樣品溶液( 阿司匹林腸溶片, 配製成20 片/L 乙醇液) 。
2方法和結果
阿司匹林腸溶片的主要成分為乙醯水楊酸,分子中酯基在鹼性溶液中可與羥胺反應生成羥肟酸;後者在酸性條件下與三氯化鐵形成酒紅色的羥肟酸鐵,最大吸收波長為520nm,在一定濃度范圍內,吸光度呈線性關系,可測出阿司匹林葯片中乙醯水楊酸的含量。
2•1標准溶液系列和樣品溶液的配製
分別取0.5g•L-1乙醯水楊酸標准溶液0.00mL(空白溶液),0.50mL,1.00mL,1.50mL,2.00mL和阿司匹林樣品溶液1.00mL置於25mL容量瓶中,分別加入7%鹽酸羥胺乙醇液1.00mL,2 mol•L-1NaOH 1.00mL,放置3分鍾,再分別加入4 mol•L-1HCl和10%FeCl3各1.00mL,加水至刻度,搖勻。
2•2標准曲線的繪制
標准溶液系列和樣品溶液放置10分鍾後,用空白溶液做對照,在520nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標,標准溶液濃度為橫坐標作圖,繪制出標准曲線表1。
二，阿司匹林制劑的電極法測定
摘要以三苄基錫辛酸酯為活性物質, 制備具有良好的電位響應性能和選擇性能的PVC 膜水楊酸根離子敏感電極。該電極應用於阿司匹林制劑的含量測定, 方法快速、方便、准確。標准曲線與樣品加入兩種電極測定法回收率分別為101. 1%和101. 3%。
1儀器與試劑
電極電位和溶液酸度測試均使用pHs-10C 型數字式酸度離子計( 浙江蕭山市科學儀器廠) ; 參比電極為232 型飽和甘汞電極( 上海光電器件廠) ; 鄰硝基苯基辛醚系本實驗室自製, 其餘試劑均為分析純, 實驗用水為去離子水經高錳酸鉀處理後蒸餾而得。
2電極制備與性能測試
將載體物質三苄基錫辛酸酯( 按文獻方法合成) 20 mg 、聚氯乙烯( PVC) 0. 33 g 和增塑劑鄰硝基苯基辛醚0. 65 g 溶解於四氫呋喃( THF) 3 g 中, 攪拌澄清後將其傾倒於40 mm×40 mm 的水平玻璃板上。待THF揮發完後( 約需12 h) 即得到具有彈性的PVC 膜。用打孔器切下直徑10 mm 的圓片並用含5%PVC 的THF 溶液粘於PVC 電極桿端, 放置數小時, 晾乾後電極桿內充以0. 1mo l/ L 的水楊酸鈉( NaSal) 溶液作為內參比溶液並以Ag/ AgCl 絲作為內參比電極導出至離子計。電極使用前需於10- 3 mol/ LNaSal 溶液中浸泡2 h 進行活化處理。電極及備用膜長期不使用時可洗凈後, 置於氮氣氛圍下保存。在此條件保存, 電極的各項性能指標至少可於5 個月內維持穩定。在pH5. 5 的磷酸鹽緩沖溶液中測試了電極的電位響應性能。結果表明, 該電極對於10-1～5×10-6 mo l/ L 濃度范圍內的水楊酸根離子具有線性響應, 斜率值為- 57.6 mV,表現出良好的穩定性與重視性。電極具有較快的電位響應: 對於各種濃度的待測樣品, 其穩態響應時間( t95%) 均小於30 s, 可以實現水楊酸根離子的快速測定。採用等活度分別溶液法測試了了電極的選擇性能, 得到其相對於NO3- 、Cl-、AcO-和SO2-4 的選擇性系數值分別為7.5×10-5、2.1×10-5、9. 0×10-4和< 10-5。該電極表現出對水楊酸根離子的高選擇性。
3阿司匹林制劑的分析
3. 1待測樣品的處理
阿司匹林易水解得到水楊酸根離子, 且反應定量。因此, 通過對水楊酸根離子的測定即可得出樣品中的阿司匹林含量。阿司匹林片( A) 和復方阿司匹林片( B) 均處理如下: 將適量葯品( 10 片) 研製成粉狀, 精密稱取1～1. 5 g , 在0. 5 mol/ L NaOH 溶液25 ml 中加熱迴流1 h 後過濾, 定容至250 ml。吸取10ml 濾液, 用稀硫酸調至pH 5. 5, 再用pH 5. 5的磷酸鹽緩沖液定容至100 ml 作為待測液。
3. 2測定結果
使用該電極通過標准溶液法和樣品加入法, 分別測定葯品A 和B 經前述處理後所得試樣中的水楊酸根離子濃度, 通過換算得出葯劑中阿司匹林的含量, 所得結果見表1。表1 中的參照值系對樣品採用葯典推薦方法進行測定得到的結果( 3 次測定平均值) 。
三 酸鹼滴定法
（1）直接滴定法
原理；阿司匹林與氫氧化鈉反應生成乙醯水楊酸鈉和水
pKa3～6都有游離羧基，顯酸性。
• 方法：取本品0。4g，精密稱定，加中性乙醇20ml，溶解，加酚酞指示液3d，用氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l）滴定。每1ml滴定液相當於18.02mg 的C9H8O4。
• 優點：簡便、快速。
• 缺點：酯鍵水解干擾（不斷攪拌、快速滴定）。
• 酸性雜質干擾（如水楊酸 ）。
• 適用范圍：不能用於含水楊酸過高或制劑分析，只能用於合格原料葯的含量測定。
中性乙醇：取乙醇加入2滴酚酞指示液，用稀氫氧化鈉溶液滴至溶液剛好呈粉紅色，即可。PH值為8左右
（2）水解後剩餘滴定
• 原理；利用阿司匹林酯結構在鹼性溶液中易於水解的特性，加入過量的氫氧化鈉滴定液。加熱使酯鍵水解，剩餘的氫氧化鈉滴定液用硫酸滴定液回定
• 方法：取本品1.5g，精密稱定加氫氧化鈉滴（0.5mol/l） 50.0ml，混合，緩緩煮沸10min，放冷，加酚酞指示液，用硫酸滴定液（0.25mol/l）滴定剩餘的氫氧化鈉。
• 由反應式得知，硫酸標准液與阿司匹林的摩爾比為1∶1
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• 優點：消除了酯鍵水解的干擾
• 缺點：酸性雜質干擾
四，高效液相色譜法
• 【儀器與試葯】儀器：高效液相色譜儀；CLASS—LC工作站。色譜柱：ODS C18色譜柱(150mm x 4．6mm，填料：Kromasil，粒度：5um)。
• 試葯: 阿司匹林對照品，甲醇(色譜純試劑)，冰醋酸、鹽酸(分析純試劑)。
【方法】取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當於阿司匹林10mg)，置100m1量瓶中，加0．1mol/l鹽酸溶液適量，超聲使阿司匹林溶解，放冷至室溫，加0．1mol/l鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5m1，置25m1量瓶中，加0．1mol/l鹽酸溶液稀釋至刻度，格勻，取20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取阿司匹林對照品適量，加0．1mol/l鹽酸溶液溶解並稀釋製成每l m1中約含阿司林20ul的溶液，取20ul同法測定。按外標法以峰面積計算，即得。