① 還原型谷胱甘肽簡介
hái yuán xíng gǔ guāng gān tài
Agifutol,Beamthion [湘雅醫學專業詞典]
reced glutathione [湘雅醫學專業詞典]
還原型谷胱甘肽
Glutathione
去白障；益視安；古拉定；谷胱甘肽；乃奇安；Glutathione；Atomolan
消化系統葯物 > 肝臟疾病輔助治療葯物
2%（5ml）。
2.注射劑（粉）：50mg，300mg，600mg。
3.片劑：50mg，100mg。
谷胱甘谷胱甘肽是由谷氨酸、胱氨酸及甘氨酸組成的一種三肽，它是甘油醛酸脫氫酶的輔基，又是乙二醛酶及磷酸丙糖脫氫酶的輔酶，參與體內三羧酸循環及糖代謝，使人體獲得高能量。谷胱甘肽能激活多種酶，如體內的巰基（SH）酶、輔酶等，從而促進糖類、脂肪及蛋白質代謝，也能影響細胞的代謝過程，是一種細胞內重要的調節代謝物質。此外，谷胱甘肽在體內以還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）兩種形式存在，其活性成分為還原型谷胱甘肽，能參與體內氧化還原過程。在谷賀首手胱甘肽轉移酶的作用下，還原型谷胱甘肽能和過氧化物及自由基相結合，以對抗氧化劑對巰基的破壞，保護細胞膜中含巰基的蛋白質和含巰基的酶不被破壞，亦對抗自由基對重要臟器的損害。谷胱甘肽廣泛存在於動植物細胞內，在肝臟和晶狀體中含量較多。現在可由化學合成或發酵法生產。谷胱甘肽是甘油醛磷酸脫氫酶的輔基，又是乙二醛酶及磷酸丙糖脫氫酶的輔酶，參與體內三羧酸循環及糖代謝，使人體獲得高能量。它能激活和保護各種酶，如體內的膽堿酯酶等巰基（－SH）酶，使機體免受碘乙酸、芥子氣、自由基（如超氧陰離子）、重金屬（如汞、鉛）、環氧化物等有害物質的毒害，從而促進糖類、脂肪及蛋白質代謝，也能影響細胞的代謝過程。促進眼組織的新陳代謝，可抑制晶體蛋白質巰基的不穩定，防止白內障及視網膜疾病的發展，因而可用於角膜炎、角膜外傷等。對這類疾病應在進入老年期前，即開始經常使用此類抗氧化劑，能夠起到預防作用。同時，也有良好的增加視力的作用。
谷胱甘谷胱甘肽是一種生理作用廣泛的生理因子，它在細胞質內合成，尤其以肝臟合成為主，其代謝亦以肝臟為主，並廣泛分布於機體各器官內，在維持細胞生物功能方面起重要作用。動物葯理試驗提示還原型谷胱甘肽靜脈注射5h後血葯濃度達最高峰，注射1h後可在肝、腎、肌肉等組織中測出，並有小劑量在腦中發現，半衰期為24h。主要從腎臟排泄，通過腎小球直接濾過和利用γ谷氨醯胺轉肽反應的非濾過機制兩種方式由腎臟清除。
1.用於各種肝病，尤其對酒精中毒性肝病、葯物中毒性肝病（包括抗癌葯、抗結核葯、精神神經葯物、抗抑鬱葯、對乙醯氨基酚和中葯等）有肯定的療效，對感染性肝病——乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎中的慢性活動型亦有改善症狀、體征和恢復肝功能的作用。
2.用於重金屬、有機溶劑等中毒的解救。
3.預防和治療放射性損傷、白細胞減少症及放射線引起的骨髓組織炎症。
4.用於面部色素沉著、汗斑和各種原因引起的色素沉著。
5.滴眼液用於早期老年性白內障，還可用於角膜潰瘍、角膜上皮剝離、角膜炎等。
對還原型谷胱甘肽過敏者禁用。
1.注射時不得與維生素B12、維生素K3、泛酸鈣、乳清酸、抗組胺制劑、磺胺制劑及四環素制劑混合使用。
2.局部點眼勿與磺胺類和四環素類葯物合用。
3.滴眼液顆粒溶解後要在1個月內使用。
1.用葯後可有皮疹、胃痛、惡心、嘔吐等，注射局部可有輕度疼痛。
2.少數患者使用還原型谷胱甘肽滴眼後可能出現瘙癢感、 *** 感、眼部充血、一過性視力模糊等症狀，停葯後即消失。
1.將還原型谷胱甘肽注射劑用所附帶的2ml維生素C注射劑溶解後使用。每天300～600mg，重症每天600～1 200mg，每天1～2次。
2.靜脈注射：用法用量同肌內注射。
3.口服給葯：每次50～100mg，每天1～3次。可根據年齡及症狀適當增減。經眼給葯：將100mg谷胱甘肽溶解於5ml溶解液中或用2%的滴眼液滴眼，每次1～2滴，每天滴眼3～5次。
1.注射時不得與維生素B12、維生素K3、泛酸鈣、乳清酸、抗組胺葯、磺胺類葯及四環素類葯混合使用。
2.谷胱甘肽可減輕絲裂黴素的毒副作用。
谷胱甘谷胱甘肽是一種作用廣泛的生理因子，它是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的一種三肽，廣泛分布於機體各器官內，在維持細胞生理功能方面起著重要的作用。還原型谷胱甘肽活性成分為還原型谷胱甘肽，可參與體內三羧酸循環，激活各種酶，對不穩定的眼晶狀體蛋白質巰基有抑製作用，從而抑制白內障的發展，抑制角膜及視網膜病變，在角膜損害時能促進上皮組織的修復。還原型谷胱甘肽臨床用於保護肝臟。還原型谷胱甘肽能抑制脂肪肝形成，也能改善中毒性肝炎和感染性肝炎的症狀。還原型谷胱甘肽還具備解毒功能，能與親電子基與自由基等有害物質結合，從而產生解毒和保護細胞的療效。動物實驗表明，谷胱甘肽能降低順鉑所致的腎功能異常和神經毒性。已進行的四組小規模的二或三期隨機臨床研究，使用不同的給葯方案，所得結論也不同。研究表明，谷胱甘肽降低化療葯物毒性的作用具有臨床意義。但仍需進行適當規模的、針對各種類型腫瘤的研究驗證，其最佳給葯方案尚未確定，但採用順鉑輸注30min，並在順鉑給葯前15min輸注谷胱甘肽，其後72h再肌內注射還原型谷胱甘肽值得進一步研究。
【葯品名稱】通用名：還原型谷胱甘肽曾用名：商品名：英文名：RecedGlutathionefo...
機制與提高胃黏膜細胞內CAMP、前列腺素、還原型谷胱甘肽及黏液糖蛋白含量有關。實驗表明本品可抑制鹽...
較強氧化性能的喹啉醌衍生物，能將紅細胞內的還原型谷胱甘肽（GSH）轉變為氧化型谷胱甘肽（GSSH）...
② GST pull down 實驗細節問題求教
GST pull-down實驗是一個行之有效的驗證酵母雙雜交系統的體外試驗技術,近年來越來越受到廣大學者的青睞。其基本原理是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當一種「誘餌蛋白」,目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的「捕獲蛋白」(目的蛋白),洗脫結合物後通過SDS-PAGE電泳分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白,「誘餌蛋白」和「捕獲蛋白」均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統以及體外轉錄翻譯系統等方法獲得。此方法簡單易行,操作方便。 GST：谷胱甘肽巰基轉移酶(glutathione S-transferase) 分子克隆第三版有詳細介紹，結合其中的示意圖很容易理解 GST融合蛋白沉降技術利用了GST對谷朧甘膚偶聯球珠的親和性，從非相互作用蛋白的溶液中純化相互作用蛋白。 GST融合的探針蛋白從細菌中表達和純化，並平行制備細胞裂解液(可被35S標記或非標記)，再將GST融合蛋白探針和細胞裂解液在谷朧甘膚瓊脂糖球珠存在下混合並孵育，以使蛋白結合。GST融合探針蛋白和任何結合分子被離心收集，獲得的混合物經洗滌後，用過量游離的谷朧甘膚洗脫或直接在SDS-PAGE上樣緩沖液中煮沸。蛋白質經SDS-PAGE分離後進行下一步的western印跡、放射自顯影及蛋白質染色分析。GST沉降技術對探測蛋白在溶液中的相互作用特別有用，而這種相互作用在膜的分析中可能是檢測不到的。 GST沉降實驗通常有兩種應用:確定融合(或探針)蛋白與未知(或靶)蛋白間新的相互作用(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),以及證實探針蛋白與已知蛋白質間可疑的相互作用(例子請見Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)。這兩種實驗的設計和實施都有所不同。 實驗目的：體外檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用。用於驗證兩個已知蛋白的相互作用，或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。 實驗原理：利用重組技術將探針蛋白與GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH（Glutathione）親和結合。因此，當與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相復合物混合時就可被吸附而分離. 試劑：NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分裝)，PMSF（Amersco），Cocktaier（Merck 539134），Immobilized Glutathione（PIERCE 15160） 實驗操作程序： 材料及試劑 探針蛋白與GST融合的原核蛋白，裂解的細胞蛋白，或者組織蛋白提取物
細胞蛋白裂解液，洗脫液： PBS及PBS+1%Triton-100 PBS (1L) NaCl： 8g KCl： 0.2g Na2HPO4： 1.44g KH2PO4： 0.24g 加入800ml蒸餾水，用HCl調節溶液的pH值至7.4，最後加蒸餾水定容至1L即可，高溫高壓滅菌！4℃保存備用！ PMSF(苯甲基磺醯氟) MW:174.19 工作濃度0.1-1mM，這里使用1mM，儲存濃度100mM，將0.174g PMSF溶於10ml無水乙醇混勻即可！保持於-20℃或者4℃ （以下流程僅供研究已知原核蛋白A和真核過表達蛋白B相互作用） 1：原核融合蛋白A的獲得 1.1：將編碼蛋白A與GST的重組質粒化轉BL21(DE3)菌株 1.2：挑取單個克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml試管里，37℃培養過夜 1.3：將培養菌液轉移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L錐形瓶中，37℃，225rpm培養至OD600≈1.0-1.5左右，加入適當濃度的IPTG，在適當溫度下培養適當時間（誘導條件需要根據不同的蛋白做調整）.6000g，10分鍾，4℃離心收集細菌，去盡上清，將菌體至於-20℃放置O/N 1.4：室溫凍融菌體，馬上置於冰上，每500ml培養液加入10-20ml細菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混勻 1.5：冰上超聲破碎，開2秒，停9秒，總40-60分鍾。至裂解液充分清涼 1.6：11000rpm，15分鍾，4℃離心分離上清， -80℃保存備用 2：真核融合蛋白B的獲得
2.1：將編碼B蛋白的鹼基序列克隆到編碼標簽蛋白（如HA,或者myc）的真核表達載體上，進行細胞轉染 xq 3：48小時後，取適量融合蛋白GST-A冰上凍融 4：取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100潤洗一次，將凍融融合蛋白GST-A與之混勻，4℃層析櫃旋轉結合1小時。 5：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul（ PBS+Beads）作Offer。 6：同時，裂解真核融合蛋白B，去盡培養基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well為例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分鍾。 7：吹打收集至1.5mlEP管，超聲破碎。13000rpm，15分鍾，4℃離心取上清。 8：BCA蛋白定量（optional）留取20ul做Offer，其餘樣品加入到已純化蛋白的EP管中，用PBS補足液體到600ul左右，以便蛋白之間能充分結合！4℃旋轉結合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。 10：40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分鍾，高速離心，Run –SDS PAGE做Western Blot檢測。用HA或者myc Blot。 注意GST-pull down的對照問題。（以A-GST和B-6*His為例） 1. 跑SDS-PAGE時點一個 input的蛋白（即B-6*His） 用於做陽性對照 看一下western操作過程中，試劑，操作步驟有沒有問題。 2. 谷胱甘肽瓊脂珠上只固定GST蛋白，input B-6*His，用於做陰性對照 看一下是否GST會與input的蛋白相互作用 Protocol for Immunoprecipitation or GST-pull down 1. Wash the cell monolayer once with cold PBS. 2. Treat the cells with 2mM 3,3』-/PBS at 4ºC for 25 min to crosslink the associated proteins. (optional) 3. Scratch off the cells, and spin down at 4ºC at 1000rpm for 5 min. 4. Decant the supernatant. 5. Resuspend the cell pellet in appropriate amount of IP-Buffer A, sonicate at 40%
output for 10 sec, and incubate the lysate at 4ºC for 45min. 6. Spin at highest speed at 4ºC for 5 min. 7. Recover the supernatant and detect protein concentration with Bradford Reagent (Bio-Rad). 8. Take 500ug proteins, mixed with 4 volume of IP-Buffer B. 9. Preclear the lysate by adding 1ug normal IgG and 5ul protein-G beads (Sigma), incubate on a rotator at 4ºC for 1hr. For GST-pull down assay, add 1ug GST protein and 5ul glutathione-sepharose 4B beads instead. 10. Spin down the beads at 4ºC at 10000rpm for 3min. 11. Recover the supernatant, add 1ug specific antibody or normal IgG, and incubate on a rotator at 4ºC for 2hr. For GST-pull down assay, add 1ug GST-fused specific protein or equal molar of GST protein instead. 12. Add 5ul of 5ul protein-G or glutathione-sepharose 4B beads, and incubate for another 2hr or overnight. 13. Spin down the beads at 4ºC at 2000rpm for 3min. Caution: There will be some white pellets just above the beads on the tube wall, which are protein precipitates e to denature. Remove away these precipitates, otherwise they will give false binding band in both control and test groups, affecting the explanation of the results. Check this phenomena at every washing step. 14. Wash the beads with 1ml of IP Washing buffer on a rotator at 4ºC for 5min. 15. Spin down the beads at 4ºC at 2000rpm for 3min. 16. Repeat step 14 and 15 for three more times. 17. Resuspend the pellet in 25ul 1xSDS loading buffer and incubate at RT for 30min. 18. Spin at 3000rpm at RT for 5min. 19. Recover the supernatant and put at –20ºC or subjected to SDS-PAGE running. 20. For the input control, 25ug protein will be included in gel running. Caution: to avoid the interference of IgG heavy chain with specific proteins with MW around 50KD, 1x SDS loading buffer without beta-mercaptoethanol or DTT can be used instead. At this condition, the interchain cysteine-cysteine bond will be maintained, giving IgG band at 100KD or so. IP-Buffer A: 50mM Tris-Cl PH 7.5 150mM NaCl 1mM EDTA PH8.0 0.5% Triton X-100 plus Protease Inhibitors (Roche) IP-Buffer B: IP-Buffer A minus Triton X-100. IP Washing Buffer: 50mM Tris-Cl PH 7.5 150mM NaCl
③ 基因甲基化檢測、甲基化PCR 的原理是什麼
一種全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技術
DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學性修飾鹼基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位點，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區域，在哺乳動物中mC約佔C總量的2－7％。一般說來，DNA的甲基化會抑制基因的表達。DNA的甲基化對維持染色體的結構、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發生發展都起重要的作用。
CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區段，CpG保持或高於正常概率，這些區段被稱作CpG島。CpG島主要位於基因的啟動子和第一外顯子區域，約有60％以上基因的啟動子含有CpG島。 CpG甲基化的研究在腫瘤的研究中有著非常主要的地位。通過基因啟動子區及附近區域CpG島胞嘧啶的甲基化可以在轉錄水平調節基因的表達，從而引起相應基因沉默，去甲基化又可恢復其表達。DNA甲基化在生理情況下就參與了控制基因的時空表達，在腫瘤發生時，腫瘤細胞全基因組低甲基化是一個重要特徵。腫瘤細胞基因組甲基化的程度與正常細胞相比僅為20-60% , 同時伴有局部區域基因的高甲基化,包括腫瘤抑制基因、抑制腫瘤轉移和浸潤的基因、細胞周期調節基因、DNA修復基因、血管形成抑制基因等。但是目前研究手段的局限，限制了DNA甲基化的廣泛研究。
近年來，研究者不斷探索定性及定量檢測單個或多個甲基化位點的方法，但由於甲基化多態性區域存在的密度很高，所以對於延伸反應其引物的位置很難設計。Pyrosequencing技術作為一種新的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。
從原理上來看，Pyrosequencing是一種通過合成方法進行序列分析的方法，它通過核苷酸和模板結合後釋放的焦磷酸引發酶級聯反應，促使熒光素發光並進行檢測。這項技術曾經被用作單核苷酸多態性（SNP）的基因型和單倍型的檢測，以及細菌和病毒的鑒定和分型研究。這項技術的一個主要特點是在Pyrogarm™軟體上顯示的峰值高度來自於序列分析的原始數據，通過峰值的高度可以精確的檢測混合DNA模板中等位基因的頻率。
目前甲基化研究方面，很多甲基化定量分析的報道採用亞硫酸氫鹽處理甲基化樣本，並用混合的PCR產物
作為校正。其主要原理是：亞硫酸氫鹽可以將沒有甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而在適當的實驗條件下甲基化的胞嘧啶保持不變。因而，用它處理樣本後，再進行PCR擴增，甲基化的位點可以被當作一個C/T的SNP來處理，它的基因頻率為0－100％。在此，我們給大家介紹一個研究人員使用Pyrosequencing技術分析並精確定量DNA甲基化水平的例子。
研究者在一個Pyrosequencing反應中同時檢測了6個甲基化位點。這種方法同樣可以用於石蠟包埋的組織，並且具有較高的重復性和精確性。實驗選擇谷胱甘肽-S-轉移酶π（GSTP1）轉錄啟動位點的CpG島進行檢測。這些位點在正常前列腺組織中是非甲基化的，而在腫瘤樣本中高甲基化。通過PCR擴增一個包含17個甲基化多態位點140bp的片段，並用4個測序引物研究其中15個位點（Table 1）。使用在線的SNP測序引物設計軟體（Pyrosequencing AB）設計測序引物，其中一些甲基化多態性位點用最可能的鹼基所代替，以減少計算的數量。再通過人工檢測測序引物可能存在的錯配。此外，同時在PSQ 96MA DNA分析儀上運行空白對照，扣除由測序引物、生物素標記的引物或是模板引起的背景。
PCR引物設計完全與模板相匹配，不覆蓋任何甲基化多態性區域。使用10ng亞硫酸氫鹽轉化的DNA樣本或是10 fmol純化的PCR產物，10 pmol 正向（5』-GTGATTTAGTATTGG-3』）和反向（5』-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3』）引物擴增GSTP1轉錄啟動位點的基因片段，擴增片段長度為144bp。反應體系為60 mM Tris-SO4, pH 8.9, 18 mM (NH4)2SO4, 1 mM MgSO4, 200 μM dNTPs，以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶，終體積為50μL。PCR循環設置：首先在95℃下變性4分鍾，然後在95℃ 30S，50℃ 45S以及72℃ 20S條件下重復50個循環，最後一步延伸步驟在72℃下4分鍾，中止反應。PCR反應在Eppendorf的Mastercycler 96
哺乳動物基因組中，DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化. DNA甲基化是一種基因外修飾，不改變DNA的一級結構; 他在細胞正常發育、基因表達模式以及基因組穩定性中起著至關重要的作用. 全基因組低甲基化，維持甲基化模式酶的調節失控和正常非甲基化CpG島的高甲基化是人類腫瘤中普遍存在的現象. DNA高甲基化是導致抑癌基因失活的又一個機制.