分析多糖分子結構的主要技術方法

① 多糖的定性與定量

鑒定多糖（參考資料）：
1.苯酚-硫酸法 需要多糖的純品和特定的酶
2.蒽酮-硫酸法 多糖在濃硫酸水合產生的高溫下迅速水解，產生單糖，單糖在強酸條件下與苯酚反應生成橙色衍生物。在波長490nm左右處和一定濃度范圍內，該衍生物的吸收值與單糖濃度呈線性關系，從而可用比色法測定其含量，所用的單糖對照品盡量採用與其多糖組成一致或為含量較高的單糖，這樣測得的值較准確。
3.3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法） 在鹼性條件下顯色，較准確測定還原糖與總糖的含量從而求出多糖的含量，可消除還原性雜質的干擾。

多糖的分離純化
在多糖提取物中，常會有無機鹽、蛋白質、色素及小分子物質等雜質，必須分別除去．一般是先脫除非多糖組分，再對多糖組分進行分級．
2．1 除蛋白：除蛋白質時一般選擇能使蛋白質沉澱而不使多糖沉澱的試劑來處理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但必須處理時間短，溫度低，避免多糖降解。Sevage法（氯仿：戊醇/丁醇=4：1）和三氟三氯乙烷法在避免降解上有較好效果但要達到除盡游離蛋白質的目的仍需反復處理。如能加入蛋白質水解酶，使蛋白質大分子進行一定程度的降解，再用Sevage法處理，一般效果更好。
為了避免使用有機溶劑也可採用反復凍融的方法除蛋白，將多糖液濃縮後，一20℃室溫反復凍融7～8次，離心除去蛋白質。另外，蛋白質在等電點時溶解度最小，用氫氧化鈣飽和液調pH10～pH11可除去偏鹼性的蛋白質，然後再用硫酸調pH5～pH6，可除去偏酸性的蛋白質。凍融和等電點沉澱除蛋白質操作簡單，但多糖液里往往有低濃度的蛋白質殘留，應與其它方法結合使用。
2．2 脫色：植物多糖提取物中含有酚類化合物而使其顏色較深，可用吸附劑(纖維素、硅藻土、活性炭等)、離子交換柱(DEAE一纖維素)、氧化劑(H2O2)等脫除。活性炭比表面積大，吸附能力強，在進行當歸多糖的提取時只向多糖液中加入了0．1％左右的活性炭，煮沸後濾過即完成了脫色操作。此法成本低廉，適合工業化生產。
2．3 除小分子雜質
小分子雜質如低聚寡糖的殘留往往影響多糖的生物活性，需要進一步脫除，提高純度。傳統的方法是透析法，該法操作簡單、技術成熟，但周期長，往往需要2一3天，常溫下操作有可能造成多糖的霉變，必要時需加入少量防腐劑或需在低溫條件下進行。隨著膜分離技術的發展，纖維濾器透析法已經發展起來了，它利用不同孔徑的膜使大小不同的分子分級，這種方式可縮短生產周期，而且條件溫和，無疑是多糖脫除雜質的一條新途徑。
2．4 多糖的分級純化
採用一般方法提取的多糖通常是多糖的混合物，分級的方法可達到純化的目的．可按溶解性不同進行分級、按分子大小和形狀分級(如分級沉澱、超濾、分子篩、層析等)，也可按分子所帶基團的性質分級．
2．4．1按溶解性不同分離
2.4.1.1分步沉澱法
分步沉澱法是根據不同多糖在不同濃度低級醇、酮中具有不同溶解度的性質，從小到大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮進行分步沉澱．
2.4.1.2 鹽析法
鹽析法是根據不同多糖在不同鹽濃度中溶解度不同而將其分離的一種方法。常用的鹽析劑有氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等，其中以硫酸銨最佳。
2.4.2 按電離性質不同分離
2.4.2.1季胺鹽沉澱法
季胺氫氧化物是一類乳化劑，能與酸性多糖形成不溶性化合物季銨絡合物，此絡合物在低離子強度的水溶液中不溶解而產生沉澱。若提高多糖液pH值或加入硼砂緩沖液，也可使中性多糖沉澱分離。常用季銨鹽有十六烷基三甲基季銨鹽的溴化物及其氫氧化物和十六烷基吡啶。
2．4．3 柱層析法
2.4.3.1凝膠柱層析法
凝膠柱層析法常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑，從而使不同大小的多糖分子得到分離純化，但不適宜粘多糖的分離。
2.4.3.2纖維素陰離子交換劑柱層析法
纖維素陰離子交換劑柱層析法常用的交換劑為DEAE一纖維素和ECTEOLA一纖維素，分類硼砂型和鹼型兩種，洗脫劑可用不同濃度鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液，其優點可吸附雜質、純化多糖，並適用於分離各種酸性、中性多糖和粘多糖。如百合多糖、北沙參多糖、太子參多糖等。
2.4.3.3 活性炭柱層析法
活性炭吸附量大、效率高，是分離水溶性物質的常用吸附劑。柱層析時活性炭中常拌入等量的硅藻土作稀釋劑，以增加溶液的流速。糖溶液上柱後先用水洗脫無機鹽、單糖等再依次增加乙醇濃度進行洗脫。
2.4.3.4 離子交換柱層析和普通凝膠柱層析聯用法
有些植物的多糖成分復雜， 除中性多糖外，還含有糖醛酸等，因此往往兩種不同性質的色譜柱聯用才能得到單一多糖組分。
2.4.3.5 三種層析柱聯用
採用離子交換葡聚糖凝膠柱、丙烯葡聚糖凝膠柱和葡聚糖凝膠柱三者聯用，即先進行DEAE—SephadexA柱層析，用蒸餾水洗脫。水洗組分進一步用SephacrylS柱層析，得到主要組分再用SephadexG一100柱層析，有時會有較高的得率。
三、多糖的純度鑒定
經過分級純化的多糖在測定結構前須進行純度鑒定．而且多糖的純度不能用通常化合物的純度標准來衡量，因為即便是多糖純品，其微觀也並不均一，僅代表相似鏈長的多糖分子的平均分布，通常所謂的多糖純品也只是一定相對分子質量范圍的多糖的均一組分．目前常用於多糖純度的鑒定方法有：高效液相、 凝膠層析法、電泳法、色譜法、旋光度法等．

多糖的單糖組分的鑒定稱取多糖粗品8 mg，用2 mL濃度為1 mol／L硫酸100*C水解6 h。飽和Ba(OH)2中和至中性，抽濾，取濾液，濃縮，毛細管點樣，薄層層析法分析。採用硅膠G板105"(2活化2 h後使用。標准糖分別為D一半乳糖，D一葡萄糖，D一甘露糖，L一山梨糖、L一阿拉伯糖。展開劑為正丁醇一冰醋酸一水(4：1：5)(體積比)。用AgNO3一NaOH 溶液顯色。
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② 鑒定多糖的方法

Molisch反應（α- 萘酚反應） 此方法是鑒定糖類最常用的顏色反應。它的原理是：糖類在濃酸作用下所形成的糠醛及其衍生物可以與α- 萘酚作用，形成紅紫色復合物。由於在糖溶液與濃硫酸兩液面間出現紅紫色的環，因此又稱紫環反應。α- 萘酚也可用麝香草酚或其他的苯酚化合物代替，麝香草酚溶液比較穩定，其靈敏度與α- 萘酚一樣。除了糖類之外，各種糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等都可以呈現近似的陽性反應。因此，陰性反應證明沒有糖類物質的存在；而陽性反應只能說明有糖類存在的可能。
此反應不能鑒別多聚糖如澱粉，纖維素等。 贊同0| 評論

③ 植物多糖的結構是怎樣的

植物多糖結構組成非常復雜，不同種的植物多糖的分子構成及分子量各不相同。多糖也具有一、二、三、四級結構，一級結構是指糖基的組成，糖基排列順序，相鄰糖基的連接方式；多糖的二級結構是指多糖主鏈間以氫鍵為主要次級鍵而形成的有規則的構象；多糖的三級結構和四級結構是指以二級結構為基礎，由於糖單位之間的非共價相互作用，導致二級結構在有序的空間里產生的有規則的構象。
多糖的結構單位是單糖，相同或不同的單糖以α－或β－糖苷鍵相連接，結構單位可以連成直鏈，也可以形成支鏈，自然界許多動植物和微生物多糖的基本結構單元是葡聚糖。

④ 大家是如何測定多糖的

季宇彬.《中葯多糖的化學與葯理》.
北京:人民衛生出版社.2005.5多糖含量測定(1)顯色試劑硫酸法:根據單糖、多糖及其衍生物在硫酸作用下水解、脫水生成糖醛類化合物，與酚類、芳胺類等縮合成有色化合物。苯酚硫酸法生成橙黃色溶液，在490nm處有特徵吸收;蒽酮硫酸法生成亮綠色溶液，在630nm處有特徵吸收;咔哇硫酸法用於測定糠醛酸(伯醇基氧化:形成糠醛酸，譽塵拆斐林(Fehling)試劑可定量。苯酚-硫酸試劑可與游離的寡糖、多糖中的己糖、糠醛酸起顯色反應，己糖在490nm處(戊糖及糠醛酸在480nm處)有最大吸收，吸收值與糖含量呈線性關系)。顯色試劑硫兄答酸法方便簡單，但需嚴格控制水解條件。(2)DNS法:一個能消除還原性雜質干擾的方法(在氫氧化鈉和丙三醇的存在下，還原糖能使DNS還原生成3-氨基-5-硝基水楊酸，在沸水浴中顯色2~5min，此化合物在過量的氫氧化鈉鹼性溶液中呈橘紅色，波長在540nm下有最大吸收峰，並且吸光度與還原糖含量有線性關系。試驗過程中諸多因素如吸收慶棗光譜、顯色劑用量、顯色時間等均對測定結果有直接影響)。利用3,5-二硝基水楊酸與多糖水解產物還原糖共熱後還原成棕紅色氨基化合物，於540nm處有特徵吸收。(主要參考文獻:董文慧,等.雲芝肝泰中雲芝多糖的工業分析方法.中成葯,1990,12(2):33.齊香君,等.3,5-二硝基水楊酸比色法測定溶液中還原糖的研究.
纖維素科學與技術.2004,12(3):17~19)(3)滴定法:有斐林氏滴定法，間接碘量滴定法。(4)氣相色譜法:可定性、定量分析多糖的組分及含量，常採用衍生物法以增加其揮發性。一般是將多糖酸水解物或甲醇解(用鹽酸-甲醇)物，用三甲基硅烷基化(TMS)或三氟乙醯化(TFA)轉化為硅烷化產物或二醯化產物進行氣相色譜分析。但乙醯化之前，糖先用KBO4或NaBH4作還原成開鏈的糖醇化合物較好。多糖用甲醇解方式把半縮醛甲基化，形成甲基糖苷後再TMS化，異構物減少，有利於分辨。常以甘露醇或肌醇為內標，用已知的各種單糖作標准。(5)高效液相色譜法:選用TSK、SW凝膠排斥色譜柱為分離柱，樣品經簡單預處理，在示差折光檢測器中進行檢測，以不同分子量的標准右旋糖酐作標准，同時測定樣品中多糖的分子量分布情況及其含量。換算因子F的測定參見附件還陽參多糖的定性分析及含量測定.pdf|||常見的方法有:GPC測定多糖分子量及其分布瓊脂糖電泳法HPLC方法測定多糖。不同的方法會有些差異。

⑤ 多糖的結構

多糖（polysaccharide）是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結構復雜且龐大的糖類物質。凡符合高分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均稱為多糖。多糖在自然界分布極廣，亦很重要。有的是構成動植物細胞壁的組成成分，如肽聚糖和纖維素；有的是作為動植物儲藏的養分，如糖原和澱粉；有的具有特殊的生物活性，像人體中的肝素有抗凝血作用，肺炎球菌細胞壁中的多糖有抗原作用。多糖的結構單位是單糖，多糖相對分子質量從幾萬到幾千萬。結構單位之間以苷鍵相連接，常見的苷鍵有α-1，4-、β-1，4-和α-1，6-苷鍵。結構單位可以連成直鏈，也可以形成支鏈，直鏈一般以α-1，4-苷鍵（如澱粉）和β-1，4-苷鍵9如纖維素）連成；支鏈中鏈與鏈的連接點常是α-1，6-苷鍵。
由一種類型的單糖組成的有葡萄糖、甘露聚糖、半乳聚糖等，由二種以上的單糖組成的雜多糖（hetero polysaccharide）有氨基糖的葡糖胺葡聚糖等，在化學結構上實屬多種多樣。就分子量而論，有從0.5萬個分子組成的到超過106個的多糖。比10個少的短鏈的稱為寡糖。不過，就糖鏈而論即使是寡糖，在寡糖上結合了蛋白質和脂類的，就整個分子而論，如果是屬於高分子，則從廣義上來看也屬於多糖，因此特稱為復合多糖 （conjugated polysaccharide，complex poly－saccharide）或復合糖質（glycoconjugate）（糖蛋白、糖脂類、蛋白多糖）。

⑥ 多糖的純化方法與哪些

多糖純化：
a、分部沉澱法：根據各種多糖在不同濃度的低級醇或丙酮中具有不同溶解度的性質，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同濃度下析出的沉澱，經反復溶解與沉澱後，直到測得的物理常數恆定（最常用的是比旋光度測定或電泳檢查）。這種方法適合於分離各種溶解度相差較大的多糖。為了多糖的穩定，常在pH7進行，唯酸性多糖在pH7時－COOH是以－COO` 離子形式存在的，需在pH2－4進行分離，為了防止苷鍵水解，操作宜迅速。此外也可將多糖製成各種衍生物如甲醚化物、乙醯化物等，然後將多糖衍生物溶於醇中，最後加入乙醚等極性更小的溶劑進行分級沉澱分離。
b、鹽析法：在天然產物的水提液中，加入無機鹽，使其達到一定濃度或飽和，促使有效成分在水中溶解度降低沉澱析出，與其它水溶性較大的雜質分離。常做鹽析的無機鹽的有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。
c、季銨鹽沉澱法：季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉澱，常用於酸性多糖的分離。通常季胺鹽及其氫氧化物並不與中性多糖產生沉澱，但當溶液的PH增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時，也會與中性多糖形成沉澱。常用的季銨鹽有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氫氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的濃度一般為1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可從中性多糖中沉澱出來，所以控制季銨鹽的濃度也能分離各種不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小於9，而且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會被沉澱出來
d、柱層析：
纖維素柱層析：纖維素柱層析對多糖的分離既有吸附色譜的性質，又具有分配色譜的性質，所用的洗脫劑是水和不同濃度乙醇的水溶液，流出柱的先後順序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最後出柱，與分級沉澱法正好相反。
纖維素陰離子交換柱層析：最常見的交換劑為DEAE－纖維素（硼酸型或鹼型），洗脫劑可用不同濃度的鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前最為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適於分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝膠柱層析：凝膠柱層析可將多糖按分子大小和形狀不同分離開來，常用的凝膠有葡聚糖凝膠（sephadex G）、瓊脂糖凝膠（sepharose bio－gel A）、聚丙烯醯胺凝膠（bio－gel P）等，常用的洗脫劑是各種濃度的鹽溶液及緩沖液，但它們的離子強度最好不低於0.02。出柱的順序是大分子的先出柱，小分子的後出柱。由於糖分子與凝膠間的相互作用，洗脫液的體積與蛋白質的分離有很大的差別。在多糖分離時，通常是用孔隙小的凝膠如sephadex G－25、G－50等先脫去多糖中的無機鹽及小分子化合物，然後再用孔隙大的凝膠sephadex G－200等進行分離。凝膠柱層析法不適合於粘多糖的分離。