⑴ 分子生物學 蛋白質磷酸化分析技術
在所 有 的 翻譯後修飾中，可逆的磷酸化，幾乎調節著生命活動的整個過程，包括細胞的增殖、發育和分化，神
經活動，肌肉收縮，新陳代謝，腫瘤發生等。據統計，哺乳動物細胞內有三分之一以上的蛋白質可以被磷酸化川，蛋白質的可逆磷酸化使得蛋白質組學研究更為復雜。 真核 生 物 細胞蛋白質中主要的磷酸化氨基酸為
絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸，其比例大概為1800:200:11 21。大多數磷酸化蛋白質都有多個磷酸化位點，並且其磷酸化位點是可變的。因此，一種蛋白可能有多種磷酸化形式。雖然對磷酸化蛋白質組學分析已有很大進步，但依然存在多個難點19待解決包括磷酸化蛋白和膚段的富集，可逆性磷酸化位點的鑒定以及磷酸化位點的定量等。1 磷酸化蛋白的識別
磷 酸 化 蛋白在細胞中含量甚微。在質譜分析中，磷酸化肚段的信號往往被非磷酸化膚段的信號所抑制。因而磷酸化蛋白和膚段的富集在提高磷酸化 位點的檢測中佔有非常重要的地位。
1. 1 磷酸化蛋白的富集
過 去 關 於 磷 酸化蛋白富集的方法主要應用針對特 定蛋白的抗體進行免疫沉澱。但該法需要首先對
蛋 白有所了解，且不適合大規模研究。雖然，近來關 於針對磷酸化基團的抗體已經出現，但只有抗磷
酸化酪氨酸的抗體效果較好[41。而抗磷酸化絲氨酸 、蘇氨酸的抗體特異性均不強。近來，商品化的
磷 酸化蛋白提純和富集試劑盒，在酵母中已成功應用，但在其它組織的應用還未見報道川。
1.2 磷酸化蛋白膠染色
檢測 蛋 白 混合物中磷酸化蛋白的經典方法是先
行電泳分離蛋白質，然後用放射自顯影術或針對磷
酸化蛋白的免疫印記方法來檢測。近來，Pro-Q Diaround
磷酸化蛋白膠染色是一項重大的技術突
。破b]。這種特殊的熒光染料可以直接在膠內檢測
針對磷酸化絲氨酸、蘇氮酸和酪氨酸的蛋白，而不
需特殊的抗體或同位素標記。這種染色適用於
SDS-聚丙烯酸胺凝膠和二維聚丙烯酞胺凝膠，並旦
這種染色和後續的質譜鑒定是完全兼容的。SYPRO
Ruby染色是針對總蛋白的染色。通過每條泳帶或
每個點的Pro-Q Diamond染色和SYPRO Ruby染色
的比值，可以了解磷酸化蛋白在總蛋白中的比值。
兩種蛋白染色結合使用，可以將高豐度蛋白的低磷
酸化狀態與低豐度蛋白的高磷酸化狀態區分開
2 磷酸化膚段的富集
磷酸 化 位 點的檢測往往不是直接從蛋白水平檢
測，而是從膚段水平檢測。但由於L述提到的抑制
現象的存在，在分析之前應首先對磷酸化膚段進行
富集。
2.1 固定金屬親和色譜
目前 使 用 最廣泛的分離和富集磷酸化肚段的方
法是固定金屬親合色譜(immobilized metal affinity
chromatography, IMAC)。此方法中，鍵合在鰲合
底物上的金屬離子(如Fe3. , Gas. , Cue'等)選
擇性地與磷酸化臉中的磷酸基團結合，在高pH值
或磷酸鹽緩沖液中磷酸化膚可以釋放出來。洗脫下
來的溶液經脫鹽處理後可直接用於質譜分析。
IMAC通常可富集到磷酸化的酪氨酸、絲氮酸和蘇
氨酸殘基。但這種方法的局限性在於:可熊會丟失
掉一些低豐度的沒有結合到IMAC柱上的磷酸化膚
段;具有多磷酸化位點的膚由於其較強的親和力很
難被洗脫下來;某些酸性基團(如天冬氨酸和谷氨
酸)、電子供體文如組氨酸)也會結合到柱上·，造
成非磷酸化膚的污染。所以用IMAC方法富集磷酸
化膚的效果如何，絕大部分依賴於所選擇的金屬離
子、填充柱的材料、及洗脫的程序。最近，Ficarro
等[C1在IMAC富集以前，將膚的酸性殘基進行酷化
處理，使其特異性大大提高，預期對大范圍磷酸化
分析具有廣闊的前景。
2.2 磷酸化肚段的化學修飾
近來 ， O da等[1-1將膚或蛋白混合物置於鹼性硫
代二乙醇溶液中，通過P2消除從磷酸化絲氨酸或
蘇氨酸中去掉磷酸基團H3P0 ,，形成的雙鍵受到硫
代二乙醇的作用，琉基取代磷酸根。生物素與琉基
相連，被標記的膚或蛋白質上樣於固定有親和素的
層析柱，通過生物素與親和素的高親和力作用而達
到磷酸化膚或蛋白質富集的目的。這一方法的主要
缺點在於它不能富集酪氨酸磷酸化的蛋白質和膚。
Zhou等I〕用另外一種方法修飾磷酸化骯，用碳二
亞胺濃縮反應將半朧氨酸加在磷酸鹽部分，修飾過
的膚段以共價鍵與碘乙酞胺樹脂結合，酸洗滌釋
放。此方法既可用於富集磷酸化酪氨酸也可用於富
集磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸，但需要許多步化
學反應和柱純化過程。
⑵ 簡述檢測蛋白質磷酸化的檢測方法及其原理
1、我看過一篇外文文獻，上面有提到直接用SDS-PAGE觀察是否磷酸化，對照組將待測蛋白的磷酸化酶（不是磷酸酯酶）失活，試驗組保證磷酸化酶處於活性狀態，之後比較兩待測蛋白的電泳結果，通常試驗組會出現緊挨著的兩條帶。
2、pull
down(見本人的網路空間，一下自己搜一下，不再贅述）
immunoprecipitation
yeast
two-hybrid
phage
display
...
⑶ 如何檢測蛋白是否發生磷酸化
有磷酸化的抗體，
磷酸化抗體可以識別蛋白質的磷酸化或者非磷酸化形式，而且可以在避免放射污染的情況下，對磷酸化蛋白進行定性和定量分析，因此特異性磷酸化抗體是研究蛋白質磷酸化的重要工具。