① 蛋白質質譜分析具體流程
質譜技術在蛋白質組學中的應用
王海龍楊靜祁振國岳秀蘭
(包頭醫學院生物化學與分子生物學教研室，內蒙古包頭014010；赤峰市第一醫院』)
中圖分類號(}so3 文獻標識碼A 文章編號1006—740X(2006)02—0231一o3
蛋白質組學是後基因組時代的一個新領域，它通
過在蛋白質水平上對細胞或機體基因表達的整體蛋白
質的定量研究，來揭示生命的過程和解釋基因表達控
制的機理⋯ 。蛋白質組學分為表達蛋白質組學(Ex·
pression Proteomies)和細胞圖譜蛋白質組學(Cell Map
Pmteomies)，前者指細胞和組織表達的蛋白質的定量
圖譜，它依賴二維凝膠電泳圖譜和圖像分析，它能在整
體蛋白質水平上研究細胞的通路，以及疾病、葯物和其
它生物刺激所引起的紊亂，因此它可能發現疾病標志
和闡明生物通路；後者是指通過純化細胞器或蛋白質
復合物，用質譜鑒定蛋白質組分，確定蛋白質和蛋白質
相互作用的亞細胞位置 】。9O年代以來隨著人類基
因組計劃的實施，引發了生物信息學(Bioinformaties)
的發展，使蛋白質分析發生了革命性的變化。現在將
高分辨2一維電泳、高靈敏度的生物質譜和快速增長
的蛋白質和DNA資料庫三者結合起來，為高通量的蛋
白質組學(High throughout Proteomies)鋪平了道路 。
這里主要介紹質譜技術在蛋白質組學中的應用。
收稿日期：2006-03-02
作者簡介：王海龍(1951一)，男。大學，副教授。
l 質譜技術的發展歷史
1．1 質譜的開發歷史要追溯到2O世紀初，Thomson
創制的拋物線質譜裝置，1919年Aston製成了第一台
速度聚焦型質譜儀，成為了質譜發展史上的里程碑。
最初的質譜儀主要用來測定元素或同位素的原子量，
隨著離子光學理論的發展，質譜儀不斷改進，其應用范
圍也在不斷擴大，到2O世紀5O年代後期已廣泛地應
用於無機化合物和有機化合物的測定。現今質譜分析
的足跡已遍布各個學科的技術領域，在固體物理、冶
金、電子、航天、原子能、地球和宇宙化學、生物化學及
生命科學等領域均有著廣闊的應用。質譜技術在生命
科學領域的應用更為質譜的發展注入了新的活力，形
成了獨特的生物質譜技術。
1．2 基本原理質譜(Mass Spectrometry)是帶電原
子、分子或分子碎片按質量的大小順序排列的圖像。
質譜儀是一類能使物質離化成離子並通過適當的電
場、磁場將它們按空間位置、時間先後或者軌道穩定與
否實現質量比分離，並檢測強度後進行物質分析的儀
器。質譜儀主要由分析系統、電學系統和真空系統組
成 。
用於分析的樣品分子在離子源中離化成具有不同
質量的單電荷分子和碎片離子，這些單電荷離子在加
1 J 1 J 1"J 1掩J
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232 包頭醫學院學報 第22卷
速電場中獲得相同動能並形成一束離子，進入由電場
和磁場組成的分析器，離子束中速度較慢的離子通過
電場後偏轉大，速度快的偏轉小；在磁場中離子發生角
速度矢量相反的偏轉，即速度慢的離子依然偏轉大，速
度快的偏轉小；當兩個場的偏轉作用彼此補償時，它們
的軌道便相交於一點。與此同時，在磁場中還能發生
質量的分離，這樣就使具有同一質量比而速度不同的
離子聚焦在同一點上，不同質量比的離子聚焦在不同
的點上，其焦面接近於平面，在此處用檢測系統進行檢
測即可得到不同質量比的譜線，即質譜。通過質譜分
析，我們可以獲得分析樣品的分子量、分子式、分子中
同位素構成和分子結構等多方面的信息 J。
2 質譜技術種類
2．1 電噴霧質譜技術(Electrospray ionization Mass
Spectrometry，ESI—MS) 是在毛細管的出口處施加一
高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化
成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發，液滴表面的電荷強
度逐漸增大，最後液滴崩解為大量帶一個或多個電荷
的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進
入氣相⋯ 。電噴霧離子化的特點是產生高電荷離子
而不是碎片離子，使質量電荷比降低到多數質量分析
儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴展了分子量的分
析范圍，離子的真實分子質量也可以根據質荷比及電
荷數算出。電噴霧質譜的優勢就是它可以方便地與多
種分離技術聯合使用 j。
2．2 基質輔助激光解吸附質譜技術(Matrix Assisted
Laser Desorption／Ionization，MALDI) 基本原理是將
分析物分散在基質分子中並形成晶體，當用激光照射
晶體時由於基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量
蓄積並迅速產熱，從而使基質晶體升華，致使基質和分
析物膨脹並進入氣相。MALDI所產生的質譜圖多為
單電荷離子，因而質譜圖中的離子與多肽和蛋白質的
質量有一一對應關系。MALDI產生的離子常用飛行
時間檢測器來檢測，理論上講，只要飛行管的長度足
夠，檢測器可檢測分子的質量數是沒有上限的，因此質
譜很合適對蛋白質、多肽、核酸和多糖等大分子的研
究。
2．3 快原子轟擊質譜技術(Fast Atom Bomebardment
Mass Spectrometry，FABMS) 一種軟電離技術，是用快
速隋性原子射擊存在於底物中的樣品，使樣品離子濺
出進入分析器，這種軟電離技術適於極性強、熱不穩定
的化合物的分析，特別適於多肽和蛋白質的分析研究。
FABMS只能提供有關離子的精確質量，從而可以確定
樣品的元素組成和分子式。而FABMS—MS串聯技術
的應用可以提供樣品較為詳細的分子結構信息，從而
使其在生物醫學分析中迅速發展起來 ]。
2．4 同位素質譜技術是一種開發和應用比較早的
技術，被廣泛地應用於各個領域，但它在醫學領域的應
用只是近近幾年的事。由於某些病原菌具有分解特定
化合物的能力，該化合物又易於用同位素標示，人們就
想到用同位素質譜的方法檢測其代謝物中同位素的含
量以達到檢測該病原菌的目的，同時也為同位素質譜
在醫學領域的應用開辟了一條思路。
3 電泳分離後凝膠上蛋白質的質譜鑒定
電泳分離後凝膠上的蛋白質，先用適當的蛋白內
切酶酶切成肽段，再用質譜鑒定。現有四種制樣方法：
3．1 凝膠內酶切凝膠內酶切的靈敏度高，是當前廣
泛採用的樣品制備方法。最常用的蛋白內切酶是胰蛋
白酶。它在蛋白質主鏈精氨酸和賴氨酸的C一端進行
切割。文獻中有多種凝膠內酶切的方法，這里介紹改
進後的Wilm的方法。
將電泳後凝膠上的蛋白質斑點以最小的體積切
下，並將凝膠塊切成約lmm 小顆粒，轉入小離心管
內，加入約5O 的lOOmmol／L碳酸氫銨溶液洗膠粒
5min，棄去碳酸氫銨液，加入50pJ乙腈使凝膠脫水1O
一15min。若膠粒未完全脫水再用乙腈脫水～次，棄去
乙腈液。將離心管置入真空離心蒸發濃縮器內，微加
熱15rain使膠粒完全乾燥。將50pJ新鮮配製的
10mmoVL DTY韻100mmol／L碳酸氫銨溶液加入離心
管內，使膠粒水化。在56℃加熱30rain還原樣品，棄
去DTr溶液，加入乙腈放置15min，再在Speed Vac微
加熱乾燥15rain，加入5O l 55mmol／L碘乙醯胺的
100mmol／L碳酸氫銨溶液，烷基化半胱氨酸殘基上的
巰基。室溫暗室中放置20 min，棄去上清夜，加入
50pJ乙腈放置15min，在Speed Vac內乾燥。加入2O l
胰蛋白酶溶液在4℃放置45—60min使膠粒再水化，
加入1O一2o 碳酸氫銨溶液覆蓋膠粒，37cI=保溫1小
時後，放置過夜，所得溶液供質譜分析用。
3．2 電洗脫後在溶液中酶解 電洗脫是電泳後從凝
膠上回收蛋白質的經典方法。通常蛋白質量多於0．
O01 mmol。將含SDS的凝膠與MALDI TOF MS分析結
合，可分析亞mmol的蛋白質。Schuh macher等用無
SDS pH2．5的乙酸銨作洗脫緩沖液，電洗脫系統的極
性相反，蛋白質SDS復合物在原位解離，游離的蛋白
質遷移至陰極，用標准蛋白樣品實驗，回收率達25％
～ 56％ [引
。
3．3 膜上酶切膜上酶切的方法已不常用於質譜分
析，因為它的靈敏度低於凝膠內酶切。電轉移時不是
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第2期 王海龍，等．質譜技術在蛋白質組學中的應用 233
所有的蛋白質都能有效轉移，而且在印跡過程中蛋白
質可能丟失。另外從PVDF膜上提取酶切後多肽時效
率不高，提取時加Triton 100可以增加多肽的提取效
率，但去污劑干擾質譜鑒定 J。
3．4 印跡過程中酶切 1999年Bins等報道將固定有
胰蛋白酶的膜，置於凝膠和PVDF膜之間在印跡過程
中使蛋白質樣品發生酶切，為了蛋白質完全酶切，印跡
過程需要特殊設計。印跡後的膜用基體溶液浸透後可
用MALDI TOF MS直接分析。該法的主要特點是印跡
過程中平行進行酶切，其靈敏度不如標准方法 J。
4 用肽質量指紋譜鑒定蛋白質
蛋白質組學中最有意義的突破是用生物質譜鑒定
電泳後凝膠上的蛋白質。質譜技術已取代了生物化學
中經典的Edman降解技術¨。。，這是由於質譜技術能
進行高通量的分析，能分析蛋白質混合物，而且靈敏。
肽質量指紋譜方法最初由Henzel及其同事提
出¨ ，很快成為高通量蛋白質鑒定的選用方法。分析
時用MALDI TOF MS測定凝膠內酶切後多肽混合物的
質量，獲得肽質量指紋圖譜。蛋白質酶切後生成多肽
混合物，可以在蛋白質序列資料庫內進行理論預測，並
對質譜實測多肽混合物與理論預測的數據進行比較，
質譜實測到足夠肽段的質量與資料庫中一個蛋白質理
論預測肽段質量匹配，蛋白質可明確鑒定_1 。
隨著科學技術的進步，質譜也得到了快速發展，特
別是與生物技術的結合，開創了質譜應用的新領域。
質譜已成為生命科學研究中非常重要的工具。其研究
成果也將大大推動人類基因組的研究，並將使人類對
生命的本質，其發生發展過程的認識達到一個前所未
有新高度。
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② 蛋白質的定性測定方法
蛋白質定性方法茚三酮反應
1.范圍
本方法採用茚三酮試劑與蛋白質中a-氨基酸反應生成藍紫色化合物最大吸收值的波長為570nm
本方法適用於各類蛋白質測定范圍0.5 g 50 g 蛋白質
2.原理
茚三酮是使氨基酸和多肽顯色的重要試劑當茚三酮在弱酸性條件下和-氨基酸反應時氨基酸被氧化分解生成醛放出NH3 和C02 水合茚三酮則變成還原型茚三酮然後還原型茚三酮與NH3 及另一分子茚三酮進一步縮合生成藍紫色化合物最大吸收值的波長為570nm此反應為一切a-氨基酸所共有反應靈敏因而本法是氨基酸定量測定應用最廣泛的方法之一脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應生成黃色化合物最大吸收值的波長在44Onm 多肽和蛋白質雖然具有茚三酮反應但肽鏈越大靈敏度也越來越差故不宜作定量測定之用在多肽合成中常用來檢驗有無自由氨基的肽類存在
3 .試劑
茚三酮無水乙醇95%乙醇甘氨酸
4.試樣制備
4.1 蛋白質溶液箱保存備用
4.2 1mg mL-1的茚三酮乙醇溶液,0.1g 茚三酮溶於100mL 95%乙醇新鮮配置
4.3 5mg mL-1的甘氨酸溶液
5.參考文獻
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③ 鑒別蛋白質的方法有哪些
常見的蛋白質鑒定方法有：
一、最簡單的方法就是對所要鑒定的物體進行灼燒
二、使用化學葯劑進行化學反應來鑒定蛋白質
三、較為精準的方法是使用儀器進行蛋白質鑒定，如質譜儀等
在生物學研究中經常會遇到一些關於蛋白質鑒定的問題，如單一蛋白質或者簡單混合物的鑒定；對單一蛋白質的序列分析等。這一類蛋白質鑒定，在精密度上要求較高，所以幾乎都是採用質譜儀器，來對蛋白質進行精密鑒定。
質譜技術是鑒定蛋白質的其中一種平台技術。可用到的質譜儀有Thermo Fisher的Q Exactive質譜儀，LTQ Orbitrap Velos質譜儀，以及AB SCIEX的6500 Q TRAP質譜儀。所在鑒定機構的不同，在硬體品牌的使用上也會有不同。
蛋白質鑒定的流程一般分三大步：蛋白質提取、純化、鑒定。這個流程是一個將蛋白質層層「解剖」的過程，從中我們可以對蛋白分子量進行測定，蛋白膠點、膠條、IP樣品蛋白質進行鑒定，非變性質譜分析以及Pull-down靶蛋白質譜鑒定等，較為細致的去分析蛋白質中的各種物質、性質等。
④ 蛋白質組的分析鑒定方法主要有哪些
為探究生物進程的分子機制,需要確定介導這個過程的蛋白質-蛋白質間的相互作用.研究蛋白質間相互作用的主要技術總結如下：一、酵母雙雜交系統酵母雙雜交系統是當前廣泛用於蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法.其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合後,誘餌蛋白結合於報道基因的啟動子,啟動報道 基因在酵母細胞內的表達,如果檢測到報道基因的表達產物,則說明兩者之間有相互作用,反之則兩者之間沒有相互作用.將這種技術微量化、陣列化後則可用於大 規模蛋白質之間相互作用的研究.在實際工作中,人們根據需要發展了單雜交系統、三雜交系統和反向雜交系統等.Angermayr等設計了一個SOS蛋白介 導的雙雜交系統.可以研究膜蛋白的功能,豐富了酵母雙雜交系統的功能.此外,酵母雙雜交系統的作用也已擴展至對蛋白質的鑒定.二、噬茵體展示技術在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列,當噬菌體生長時,表面就表達出相應的單抗,再將噬菌體過柱,柱上若含目的蛋白,就會與相應抗體 特異性結合,這被稱為噬菌體展示技術.此技術也主要用於研究蛋白質之間的相互作用,不僅有高通量及簡便的特點,還具有直接得到基因、高選擇性的篩選復雜混 合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結合的特異性等優點.目前,用優化的噬菌體展示技術,已經展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的cDNA文 庫,並分離出了人上皮生長因子信號傳導途徑中的信號分子.三、等離子共振技術表 面等離子共振技術(Surface Plasmon Resonance,SPR)已成為蛋白質相互作用研究中的新手段.它的原理是利用一種納米級的薄膜吸附上「誘餌蛋白」,當待測蛋白與誘餌蛋白結合後,薄 膜的共振性質會發生改變,通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況.SPR技術的優點是不需標記物或染料,反應過程可實時監控.測定快速且安全,還可用於檢測 蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用.………………
⑤ 蛋白質結構分析
該蛋白由四個亞基組成，這四條肽鏈的表觀分子量相同。
⑥ 蛋白質的結構的測定方法都有什麼啊，
蛋白質三級結構測定主要有X射線衍射法、核磁共振技術、三維電鏡重構技術三種方法。
X線晶體衍射是最經典的測定生物大分子結構的方法。蛋白質晶體衍射中最大的難點就在於蛋白質的結晶，也在一定程度上限制了它的發展。NMR技術後起之秀，相對於X-RAY較為簡單，近年來技術越發成熟，可測定蛋白質的分子量也在攀升，而且其解析度也很高，
三維電鏡重構技術也是結構生物學研究中的一種較新的技術。技術難點在於演算法。
⑦ 蛋白質晶體結構分析方法有哪些
蛋白質結構分析方法：X射線晶體衍射分析和核磁共振
x 射線衍射法的解析度可達到原子的水平，使它可以測定亞基的空間結構、各亞基間的相對拓撲布局，還可清楚的描述配體存在與否對蛋白質的影響。多維核磁共振波譜技術已成為確定蛋白質和核酸等生物分子溶液三維結構的唯一有效手段。NM R技術最大的優點不在於它的解析度，而在於它能對溶液中和非晶態的蛋白質進行測量。
蛋白質的序列結構測定:
1.到目前為止，最經典的蛋白質的氨基酸序列分析方法是，sarI等人基於Edman降解原理研製的液相蛋白質序列儀，及後來發展的固相和氣相的蛋白質序列分析儀。
2.質譜：早期的質譜電離的方式主要是電子轟擊電離(EI)，它要求樣品的揮發性好，一般與
氣相色譜聯用。但使用G C／M S分析，肽的長度受到限制，只能分析小的肽段。近年來，
在離子化的技術及儀器方面取得了突破性進展，使得質譜所能測定的分子量的范圍大大超
出了10k u。因此，軟離子化技術、基質輔助的激光解吸／離子化(MALDI)和電噴霧離子化(E SI)顯得尤為有前途。通過串聯質譜技術(MS／MS)和源後衰減基質輔助的激光解吸／離子化(PSD—MAIDI—MS)，人們就可以從質譜分析中獲得肽及蛋白質的結構信息。
⑧ 蛋白質的檢驗方法
蛋白質測定方法:
測定蛋白質的方法可分為兩大類：
一類是利用蛋白質的共性，即含氮量 、肽鍵和折射率測定蛋白質含量 ；
另一類是利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸性和鹼性基團 以及芳香基團等測定蛋白質含量。
(1) 凱氏定氮法: 是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應的蛋白質系數而求出蛋白質的含量，由於樣品中含有少量非蛋白質含氮化合物，故此法的結果稱為粗蛋白質含量。(是食品上蛋白質含量測定最常用的方法)
(2) 雙縮脲法
(3) 染料結合法
(4) 酚試劑法：方法簡便快速，故多用於生產單位質量控制分析。
(5) 紫外分光光度法-近紅外光譜法
⑨ 幾種蛋白質含量測定方法的比較研究
摘要:目的:為培養的肝細胞及神經元蛋白質含量測定選擇最佳方案。方法:採用三種較為常用的蛋白質含量測定方法:Bradford、Lowry和Bio-rad
DC法分別對培養的小鼠肝細胞、神經元細胞的全細胞蛋白質提取樣品進行測定。並對結果進行比較。結果:蛋白質含量測定及重復性實驗對比分析可見，用Bradford、Lowry和Bio-rad
DC法測定肝細胞蛋白質樣品.結果均較穩定;測定神經元蛋白質樣品，Bradford和Bic-rad
DC法較穩定，Lowry法不穩定。