上海水體微生物測序分析方法

Ⅰ 如何採用宏基因組進行水產動物腸道微生物的研究

1，宏基因組提取；提取的樣品DNA必須可以代表特定環境中微生物的種類，除需嚴格遵循取樣規則外，取樣中應盡量避免對樣本的干擾，縮短保存和運輸的時間，使樣品盡可能代表自然狀態下的微生物原貌，獲得高質量環境樣品中的總DNA是宏基因組文庫構建的關鍵之一。要採用合適的方法，既要盡可能地完全抽提出環境樣品中的DNA，又要保持較大的片段以獲得完整的目的基因或基因簇。所以總的提取總是在最大提取量和最小剪切力之間折中。應嚴格操作，謹防污染，並且保持DNA 片段的完整和純度。為了更好地反映環境中的微生物種群並且提高陽性克隆的佔有率，需要在克隆之前通過不同的方法對感興趣的目的基因或基因組進行富集，常用的富集方法有穩定同位素探針、抑制性消減雜交、差異顯示、噬菌體展示、 親和捕獲及DNA微陣列等技術。
2，測序分析：
採用Solexa進行宏基因組 DNA測序，首先對特定環境微生物種群全基因組DNA進行提取。在提取微生物種群的DNA後制備DNA文庫，具體步驟如下：

（1）將DNA隨機打斷成200-500bp的片段；

（2）對DNA末端進行修復；

（3）將「A」鹼基加入到DNA片段的3』末端；

（4）在DNA片段的末端加上接頭；

（5）純化連接產物；

（6）PCR擴增連上接頭的DNA片段；

（7）檢測測序文庫。

Ⅱ 病原微生物中細菌常見檢測方法有哪些

1、快速測試片技術法

快速測試片是指以紙片、紙膜、膠片等作為培養基載體，將特定的培養基和顯色物質附著在上面，通過微生物在上面的生長、顯色來測定食品中微生物的方法。

細菌總數檢測紙片的研製始於 20 世紀 80 年代，其主要優點是簡便、實用、經濟、操作性強。近年來以濾紙和美國某公司的 Petrifilm 為載體的測試片已開始被廣泛應用。

2、生物電化學方法

生物電化學方法是指通過電極測定微生物產生或消耗的電荷，從而提供分析信號的方法。微生物在滋生代謝過程中，培養基的電化學性質如電流、電位、電阻和電導等會發生變化，所以可以通過檢測分析這些電化學參量的變化來實現對微生物的快速測定。

常見的有：阻抗分析法、電位分析法、電流分析法等。生物電化學方法具有測量快速、直觀、操作簡單、測量設備成本低和信號的可控性等特點。

3、微菌落技術

微菌落是指細菌生長繁殖早期在固相載體上所形成的只能藉助於顯微鏡觀察的微小菌落。微菌落技術具有快速、經濟、實用的特點，其研究始於 20 世紀50年代，定量測定技術從 20 世紀 70 年代開始，國外已有報道將該法應用於水、食品中細菌總數的快速檢測。

4、氣相色譜法

氣相色譜應用到微生物的檢測中，主要是依據不同微生物的化學組成或其產生的代謝產物各異，利用上述色譜檢測可直接分析各種體液中的細菌代謝產物、細胞中的脂肪酸、蛋白質、氨基酸、多肽、多糖等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

5、高效液相色譜法

利用高效液相色譜檢測可分析各種體液中的細菌代謝產物、病原微生物等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

Ⅲ 微生物研究有哪些高通量測序手段

如芹悉高何讀懂微生物測序數據質量宏基因組是指特定環境中全部生物（微生物）遺傳物質的總和。宏基因組測序是利用高通量測序技術對環境陸遲樣品中全部微生物的基因組進行測定，以獲得單個樣品的飽和數據量，可進行微生物群體的基因組成及功能注釋，微生物群體的物種分類，多樣性分析，群落結構分析，樣品間的物種或基因差異以及物種間的代謝網路研究，探索微生物與環境及宿主之間的關系，發掘和研究新的具有特定功能的基因等。與傳統方法相比，基於高通量測序的宏基因組研究無需構建克隆文庫，這避免了文庫構建過程中利用宿主菌對樣品進嫌尺行克隆而引起的系統偏差，簡化了實驗操作，提高了測序效率。此外，宏基因組測序研究擺脫了微生物分離純培養的限制，擴展了微生物資源的利用空間，為環境微生物群落的研究提供了有效工具。通過宏基因組深度測序可以揭示或估計環境中真實的物種多樣性和遺傳多樣性，挖掘具有應用價值的基因資源，應用於開發新的微生物活性物質，為研究和開發新的微生物活性物質提供有力支持。

Ⅳ 微生物多樣性（擴增子/16S rDNA測序）—α多樣性分析方法描述

​一、α多樣性指數分析內容及意義

a) 群落生態學中研究微生物多樣性，通過單樣品的多樣性分析（α[Alpha]多樣性）可以反映微生物群落的豐度和多樣性，包括一系列統計學分析指數估計環境群落的物虧空種豐度和多樣性。 

b) α多樣性指分析主要包括：

①菌群豐度（Community richness）指數計算：Chao、Ace指租空攔數；

②菌群多樣性（Community diversity）指數計算：Shannon、Simpson指數。

    ——獲弊胡得指數計算匯總表格。

稀釋性曲線（Rarefraction Curve）；Shannon-Wiener曲線；Rank-Abundance曲線；Specaccum曲線

二、α多樣性分析在科技論文中的描述

a) 稀釋性曲線和Shannon-Wiener曲線結合使用：

例如1：Shannon and Rarefaction analysis showed that, although new phylotypes can be obtained by additional sequencing, most of the gut microbial diversity in each sample was captured with the current sequencing depth. After rarefying the sequencing depth among all the samples using bootstrap (XX,XXX reads per sample), Shannon diversity index and rarefaction OTU estimates were calculated. There was no significant difference in the richness (as indicated by rarefaction OTU estimates) and diversity between Group A and Group B in this study.

如有顯著差異：while Group B significantly reced both the richness and diversity of the microbiota(P<0.05 OR Show in fig.)。

  例 如2：The richness of oral bacterial communities in three oral habitats of periodontitis patients and the control cohort were estimated by rarefaction and Chao 1, and diversity was estimated by Shannon diversity index and Simpson diversity. The shape of the rarefaction curves indicated new phylotypes would be expected with additional sequencing. However, the Shannon diversity index curves of all samples reached plateaus with the current sequencing, suggesting that most diversity had already been captured.

b) Rank-abundance曲線：

例如1：Rank-abundance curves reflect the fact that a few dominant phylotypes comprise the major proportion of the A communities whereas a more even community is seen in XXX.

例如2：Bacterial communities were also similar in their structure, exhibiting comparable trends for both rank frequency and abundance across the soils sampled.

c) 物種累積曲線：

例如：According to the sample number and species OTUs, we calculated the species accumulation curve of all participants. In this study, the curve had reached a plateau, and the species had no more obvious increase as the sample number increased, which indicated that the sample volume in our study was relatively large enough to reflect the species richness.

d) α多樣性指數比較：

  例 如：We compared the α-diversity of microbiota between XX and XX samples using the chao1, ACE, observed species, Shannon and Simpson index, and found that all five indexes showed significant difference (P = XXX, XXX, XXX, XXX, and XXX, respectively). The XXX samples had a significantly higher α-diversity.

溫馨提示：

文章寫作時，使用α多樣性指數種類和方式，需根據文章表述需求進行選擇，因此， α多樣性指數的差異分析需根據提供的α多樣指數匯總表自行完成。

Ⅳ 微生物16S測序數據分析思路解讀

文章摘錄： https://metagenome.blog.csdn.net/article/details/106435898?utm_medium=distribute.pc_relevant.none-task-blog--1.control&dist_request_id=1328680.10001.16161359172342727&depth_1-utm_source=distribute.pc_relevant.none-task-blog--1.control

16S rRNA基因測序（也稱16S rDNA測序）是最常用的菌群多樣性分析的手段。對於新手，如果收到一份不講「人話」的16S測序分析報告，很快就會被各種生態學術語、各種指數、各種分析方法弄暈。

7個問題串起16S測序的核心結果

怎麼辦？用你的研究邏輯來梳理16S測序數據（圖1）。

簡單地說，做16S測序是為了鑒定樣本中的微生物（細菌）群組成，找微生物群與疾病或表謹睜賀型的相關性。

詳細地說，

1）首先想了解在不同組樣本中各有哪些微生物存在和豐富度（對應於菌群鑒定和α多樣性分析）；

2）接著想看不同樣本組間微生物群組成是否存在差異（對應於β多樣性分析）；

3）如果是，那麼就有必要找出引起不同組樣本微生物群差異的關鍵菌。如果不是，那說明微生物群比如腸道菌群與疾病或表型可能並不相關（基於已有的研究，這種可能性比較小）；

4）找到了關鍵菌，在臨床上，很自然會想到，這些（個）關鍵菌是否可以作為Biomarker（對祥派早態應於疾病診斷模型構建），比如用於區分糖尿病前期患者與健康組的標志物；

5）以及這些（個）菌是否與臨床指標具有相關性（對應於菌群與臨床指標的相關性分析）；也會進一步想到，既然不同組的微生物群落存在差異，又與疾病具有相關性，

6）那麼這些菌群是如何影響宿主的，可能參與了哪些代謝途徑（對應於菌群基因功能預測）；

7）這些預測到的菌群功能是否與疾病有關，通常是肯定的。最後把這些結果整合起來分析，可以初步得出菌群組成的變化是如何與疾病或表型相關的。

順著上述7個生物學問題來看16S測序結果，你會輕松撥開迷霧，直達核心結果。

Ⅵ 做生產用水微生物的細菌總數和大腸菌群德檢測依據是什麼

一、水質微生物及指示菌

在各種水體，特別是污染水體中存在有大量的有機物質，適於各種微生物的生長，因此水體是僅次於土壤的第二種微生物天然培養基。水體中的微生物主要來源於土壤，以及人類的動物的排泄物及污染。水體中微生物的數量和種類受各種環境條件的制約。

一般認為，水中微生物以革蘭氏陰性桿菌佔有較大優勢。與其他水體相比，河水及溪水中革蘭氏陽性菌相對較多，這是因為陸地微生物沖洗污染的緣故。

水體中的致病性微生物一般並不是水中原有微生物，大部分是從外界環境污染而來，特別是人和其它溫血動物的糞便污染。水中常見的致病性細菌主要包括：志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌、小腸結炎耶爾森氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌等。

在實際控制中，對水質衛生質量的評價和控制，是無法對各種可能存在的致病微生物一一進行檢測，而一般利用對指示菌的檢測和控制，來了解水體是否受到過人畜糞便的污染，是否有腸道病原微生物存在的可能，從而評價水的質量，以保證水質的衛生安全。

目前，世界各國一般認為大腸菌群是指示水質受糞便污染較好的指示菌。

我國水質控制也採用大腸菌群作為指示菌，GB5749-85《中華人民共和國國家標准
生活飲用水衛生標准》規定，生活飲用水中大腸菌群每升不得超過3個。

在某些情況下，水體中的細菌總數也可指示水體受糞便等污染物污染的情況。這里的細菌總數其實是指營養瓊脂培養後形成的菌落總數。目前世界各國對於控制飲用水的衛生質量，除採用大腸菌群等指標外，一般還採用細菌總數這個指標。我國GB5749-85《中華人民共和國國家標准
生活飲用水衛生標准》中規定生活飲用水細菌總數每毫升不得超過100個。

二、水質微生物檢驗方法

GB5750-85《中華人民共和國國家標准 生活飲用水標准檢驗法》提供了水質中細菌總數和總大腸菌群的檢測方法。

（一）細菌總數的檢測：

國家標准中，細菌總數是指1ml水樣在營養瓊脂培養基中，於37℃經24h培養後，所生長的細菌菌落的總數。

對生活飲用水，直接吸取1ml水樣於平皿中，加入營養瓊脂後混勻，37℃培養24h，進行計數。

對水源水，根據情況對樣品進行10倍梯度稀釋，選擇適宜稀釋液1ml，加註平皿，營養瓊脂混勻，37℃培養24h，進行計數。

按照規定格式報告每毫升水中細菌總數。

（二）總大腸菌群的檢測：

國家標准中，利用總大腸菌群作為糞便污染的指標。總大腸菌群是指一群需氧及兼性厭氧的，37℃生長時能使乳糖發酵，在24h內產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。水樣中總大腸菌群數的含量，表明水被糞便污染的程度，而且間接地表明有腸道致病菌存在的可能。

國家標准提供了多管發酵法及濾膜法檢測總大腸菌群的方法。

多管發酵法檢測總大腸菌群，分為三步：初發酵試驗，平板分離，復發酵證實試驗。初發酵試驗，採用乳糖蛋白腖培養液37℃培養24h，觀察產酸產氣情況。對陽性管培養物，接種於品紅亞硫酸鈉培養基或伊紅美藍培養基，觀察菌落特徵，並進行革蘭氏染色和鏡檢。對典型和可疑菌落，接種於乳糖蛋白腖培養液，進行復發酵證實試驗，並根據標准所附檢數表報告結果。

其中，對生活飲用水，初發酵試驗接種水樣總量300ml，即100ml接種2管，10ml接種10管，採用兩個稀釋度，12支發酵管。對水源水，初發酵試驗接種水樣總量55.5ml，即10ml接種5管，1ml接種5管，0.1ml接種10管，共採用三個稀釋度，15支發酵管。兩種接種方法，所用的檢數表是不同的。

濾膜法檢測總大腸菌群，就是利用微孔濾膜，過濾一定量水樣，將水樣中含有的細菌截留在濾膜上，然後將濾膜帖放在選擇性培養基上（如品紅亞硫酸鈉培養基），經培養和證實試驗後，直接計數濾膜上生長的典型大腸菌群菌落，並計算出每升水樣中含有的總大腸菌群數。

三、說明：

1．菌落總數測定中，應選擇合適的稀釋度進行。生活飲用水，國家標准規定每毫升不得超過100個，因此可以直接吸取1毫升到平板進行培養。

2．培養時間。與食品中菌落計數不同，測定水中細菌總數，培養時間採用24h。

3．總大腸菌群的測定方法，由於飲用水和水源水可能的污染程度不同，因此採用不同的接種量，檢數表也不相同。

4．當接種量超過1毫升時，一般採用多倍濃度培養液。如配製3倍濃縮乳糖蛋白腖培養液50mL，加入100mL水樣後，總體積為150mL，培養液恢復到正常濃度。

5．濾膜法檢測總大腸菌群，一般在檢測較大量低濁度水樣時採用，大量水樣濾過濾膜後，水中所含有的所有細菌均截留在濾膜上。

Ⅶ 環境微生物測序采樣指南

隨著高通量測序技術飛速發展，人們對微生物的認知也在逐漸深入。凌恩生物每天都會接到全國各類型微生物測序樣本，上到山巔土壤，下至深海底泥；有老師研究植物根際和葉內微生物，也有老師關注動物昆蟲腸道生理代謝的奧秘。為了得到能夠研究的測序結果，規范標準的取樣及送樣是成功的前提。

在樣本送測前，我們要注意以下幾點：

1、取樣使用的工具及容器必須經過滅菌處理；

2、取樣後及時做好標記，記錄取樣相關信息；

3、樣本送測前做好備份，防止意外發生丟失珍貴樣本；

4、送測樣本使用標准容器承裝，在容器上標記清晰，送樣不宜過多；

5、寄送時保持低溫環境，建議使用乾冰配送；

6、可使用凌恩微生態樣本保真液，高品質樣本是決定高品質研究成果的第一步。

常規土壤類樣本取樣方法-農田/森林/草原土壤等

(1) 取樣方法

按實驗設計確定采樣范圍，取樣器具需事先消毒滅菌處理。采樣時應去除地表雜質，根據需要挖取相應深度（如5~20 cm）的土壤，置於冰磨拍掘上運至實驗室。去除可見雜質，建議過2 mm無菌篩網。同一樣方多點樣本等量混合均勻後取5~10 g，保存無菌EP管中，進行核酸提取，或-80℃保存備用。若不能自行提取，可置於乾冰寄送至公司。

註：建議戴一次瞎核性手套、口罩，進行嚴格賀敬取樣和操作，盡可能減少人為的污染。

根際土壤樣本取樣方法-作物/蔬菜/草木根系等

（1）作物類（含草地等矮小植物）根際土壤取樣方法

a. 採集植物植株，去除根部大塊土壤，置於冰上運輸至實驗室；

b. 晃動根部，去除根部鬆散的土壤後，使用無菌刷子從根部收集殘留土壤；

c. 同一樣方多點取樣土壤樣本等量混合均勻後，液氮速凍，置於-80℃冰箱保存。

（2）林木類根際土壤取樣方法

a. 採集地面下 10-20 cm 根際土壤，置於冰上運輸至實驗室；

b. 過 2-5 mm 孔徑無菌篩網；

c. 同一樣方多點取樣土壤樣本等量混合均勻後，液氮速凍，置於-80℃冰箱保存。

若不能自行提取，可置於乾冰寄送至公司提取。

註：取樣器具請事先消毒滅菌處理。若為真菌根際土壤，請務必盡可能去除菌絲體殘留，減少對 DNA/RNA 提取的干擾。

植物表面微生物取樣方法

（1）取樣方法

依據實驗設計，進行樣方設置，每一樣方進行多點取樣，同一樣方點等量混勻成一個樣本。植物根部組織可以通過搖晃振盪或無菌刷子去除根表粘附土壤。

（2）樣本前處理

將植物組織浸沒於無菌PBS溶液，180rpm孵育20min；取出植物組織，再次加入無菌PBS溶液，180rpm孵育20min，取出植物組織，再次加入無菌PBS溶液，超聲波洗滌10min（參數：160 W，30s/30s），最後取出植物組織至於-80度冰箱保存備用。

將三次洗滌液匯總，過0.2um濾膜（或12000g離心10min，收集沉澱），收集濾膜至於-80度冰箱保存。

植物內部微生物取樣方法

（1）依據實驗設計，進行樣方設置，每一樣方進行多點取樣，同一樣方點等量混勻成一個樣本。

（2）對植物組織進行表面消毒操作或者使用上一步「 植物表面微生物取樣」中處理過的植物組織，液氮速凍後，研磨成粉，即可用來進行核酸的提取。

植物組織表面消毒具體操作如下：

無菌水洗滌30s，70%無菌乙醇洗滌2min，2,5% NaClO（含0.1% Tween 80）浸泡5min後轉移至70%無菌乙醇浸泡30s，最後使用無菌水洗滌植物組織3次，即視為對植物組織表面進行無菌化。

表面無菌化的植物組織至於-80度冰箱保存備用或進行核酸提取。

植物根表面微生物取樣方法

（1）將所研究的物體放在事先滅好的無菌容器當中；

（2）加入PBS緩沖液後進行振盪，使得微生物從物體表面充分的脫落並聚集在PBS緩沖液當中,震盪至少2h以上；

（3）直接提取PBS緩沖液中的微生物或者將緩沖液用濾膜過濾之後再進行DNA的提取。

PBS濃度和PH有要求：濃度是用1x的，PH值是7.4，一般買回來的PBS是10x的，建議稀釋到1x。

注意： 建議優先使用超聲波洗滌 。

空氣樣本微生物取樣方法

使用空氣抽濾機，使空氣通過 0.22 μm 濾膜，濾膜上有可見覆蓋物（過濾時間越長，收集的空氣中的灰塵越多，菌數量越多），收集完成後取下濾膜。濾膜置於凍存管中，液氮速凍，乾冰寄送到實驗室。

注意：由於樣本特殊，微生物含量較少，建議多保管備份保存。

水體樣本微生物取樣方法

送樣量：擴增子直徑3-4cm濾膜1-2張；宏基因組直徑3-4cm濾膜>=2張；

（1）研究目的進行確定水體的取樣深度和范圍；

（2）采樣後進行濾膜過濾，選擇合適孔徑的濾膜，對於澄清水體或者略渾濁水體，選用0.22μm或者0.45μm的濾膜，取樣體積大於5L；對於渾濁水體，建議先用大孔徑的濾膜過濾一遍，再用小孔徑的濾膜過濾；

（3）水體泥樣的採集提供大於5g樣本；

（4）用大體積乾冰運輸，且要保證我方在收到樣品開箱檢驗時有足夠的乾冰剩餘。

注意：擴增子項目將2-3L水體過濾到1-2張濾膜（0.22或0.45um）後裝入到離心管中；宏基因組項目將10L水體過濾到>=2張濾膜（0.22或0.45um）後裝入到離心管中。

活性污泥與水體/地表沉積物類樣本取樣方法

（1）活性污泥

從活性污泥裝置中取大於10 ml的懸浮污泥樣本（約5-10 g沉降物），保存無菌EP管中，放入液氮或置於冰上，立即運至實驗室進行核酸提取，或-80℃保存備用。

註：若液態污泥樣本沉降物較少，可適當增加取樣量。

（2）水體/地表沉積物

取距離水底/地表0-10 cm（具體按實驗需要而定）的沉積物5~10 g，保存無菌取樣袋或EP管中，置於冰上運送至實驗室進行核酸提取，或-80℃保存備用。若不能自行提取，可置於乾冰寄送至公司提取。