受體信號轉導研究方法

㈠ 簡述激素細胞膜受體介導的信號轉導途徑

細胞外信號（第一信使）作用到並結合細胞膜受體，導致受體變構並活化，通過偶聯的G蛋白或酶、或受體本身激酶活性、或組枝轎成的離子通道開放，將胞外信息傳遞到胞內，產生第改汪二信使，繼而激活相應的酶，行使快速的生理代謝反應調節功能。或者活化轉錄因核搭仔子，轉位到細胞核中調節基因表達。

㈡ 信號傳導的受體分類及與受體相關的信息轉導途徑

受體是細胞膜上或細胞內能識別生物活性分子並與之結合的成分，他能把識別和接受的信號正確無誤地放大並傳遞到細胞內部，進而引起生物學效應。 存在於細胞質膜上的受體稱為膜受體，化學本質絕大部分是糖鑲嵌蛋白；位於胞液和細胞核中的受體稱為胞內受體，它們全部為DNA結合蛋白。
受體在識別相應配體（第一信使）並與之結合後，雹氏清細胞內環磷酸腺苷（cAMP）、環磷酸鳥苷（cGMP）、鈣離子（Ca）、肌醇磷脂（第二信使）等物質增加，參與細胞的各種生物調控過程，將獲得的信息增強、分化、整合並傳遞給效應器，才能發揮特定的生理功能或葯理效應。這種將細胞外信息傳遞到細胞內的過程稱為信號傳導。 5.1.1 環狀受體 指配體依賴性離子通道。神經遞質與這類受體結合後，可使離子通道打開或關閉，從核做而改變膜的通透性。受體在神經沖動的快速傳遞中發揮重要作用，參與快速而精確的神經反射調節。
5.1.2 G蛋白耦聯受體 G蛋白耦聯受體及其所介導的信息轉導途徑在人體中發揮著至關重要的作用。
5.1.2.1 G蛋白耦聯受體的結構及分類
G蛋白耦聯受體（GPCRs），又稱七個α螺旋跨膜蛋白受體，是體內最大的蛋白質超家族，迄今已報道了近2000種不同的GPCRs。該類受體對多種激素和神經遞質作出應答，配體主要包括生物胺、感覺刺激（如光和氣味等）、脂類衍生物、肽類、糖蛋白、核苷酸、離子和蛋白酶等。GPCRs因能結合和調節G蛋白活性而得名。大多數的GPCRs的確是通過G蛋白來調節細胞內的信號傳遞，但也有研究發現有些GPCRs通過酪氨酸激酶、Src、Stat3等途徑來傳遞信息，與細胞增殖、細胞轉化有關。
GPCRs的肽鏈由N末端，7個跨膜α螺旋（TM1→TM7），C末端，3個胞外環（ECL1→ECL3）及3～4個胞內環（ICL1→ICL4）組成。N端在胞外，C端在胞內，7個跨膜的α螺旋反復穿過細胞膜的脂雙層，每個TM由20～27個疏水氨基酸組成，N端有7～595個氨基酸殘基，C端有12～359個氨基酸殘基，ECL、ICL各有5～230個氨基酸殘基。至於GPCRs高解析度的空間結構目前尚未闡明。
按G蛋白耦聯受體一級結構的同源性，將GPCRs主要分為A、B、C3族。三族的GPCRs都具有各自的結構特徵，而結構的特異性也就決定了功能上的獨特性，各族受體都具有各自特有的配體群。一般認為GPCRs功能是通過其單體而實現的，近年的研究表明GPCRs存在二聚體及多聚體形式，特別對二聚體的研究得到廣泛關注。兩個單體可能是共價連接（例如二硫鍵）也可能是非共價連接（例如跨膜螺旋的疏水作用力），或者兩者兼而有之。近來，人們對GPCRs的二聚化功能研究取得了一定的進展，主要有以下方面：①二聚化對受體轉運起著作用；②二聚化可以擴展葯理多樣性，不同受體產生的異二聚體可能有著比單體更多的葯理學功能；③二聚化可以影響受體的活性和調控等。
5.1.2.2 與受體耦聯的G蛋白的結構與分類
G蛋白是一類與GTP或GDP結合的、具有GTP酶活性、位於細胞膜胞漿面的外周蛋白。它由三個亞基組成，分別是α亞基（45kD）、β亞基（35kD）、γ亞基（7kD）。總分子質量為100kD左右。G蛋白有兩種構像，一種是以αβγ三聚體存在並與GDP結合，為非活化型；另一種構象是α亞基與GTP結合並導致βγ二聚體的脫落，此為活化型。不同種類的G蛋白有相應的基因編碼，在各種G蛋白亞基中，α亞基差別最大，常將其作為一個區別不同G蛋白的標志。
G蛋白有很多種，常見的有激動型G蛋白（Gs）、抑制型G蛋白（Gi）和磷脂酶C型G蛋白（Gp）。不同的G蛋白能特異地將受體和與之相適應的效應酶耦聯起來。源前G蛋白在結構上盡管沒有跨膜蛋白的特點，但它們可以通過其亞基氨基酸殘基的脂化修飾錨定在細胞膜上。目前已把G蛋白結構、氨基酸序列及進化的相似性與功能等結合起來作為分類的依據，主要包括四類，其中至少含有21種不同的α亞基、5種不同的β亞基和8種γ亞基。
5.1.2.3 G蛋白耦聯受體的信號轉導機制
G蛋白通過與受體的耦聯，在信息轉導過程中常發揮著分子開關的作用。其跨膜信號轉導一般分為以下幾步：（1）當外部沒有信號或沒有受外部刺激時，受體不與配體結合，G蛋白處於關閉（失活）狀態，以異源三聚體形式存在，即α亞基與GDP緊密結合，βγ亞基與α亞基、GDP的結合較為疏鬆；（2）當外部有信號時，G蛋白受體與其相應的配體結合，隨之誘導G蛋白的α亞基構象變化，並使αβγ三個亞基形成緊密結合的復合物，從而使GDP與GTP交換，但是與GTP的結合導致α亞基與βγ亞基分開，α亞基被激活，即處於所謂的開啟狀態，隨後作用於效應器，產生細胞內信號並進行一系列的轉導過程，從而引起細胞的各種反應。（3）G蛋白的α亞基具有GDPase的活性，在Mg2+存在的條件下可以水解GTP，α亞基與GDP復合物重新與βγ亞基結合，使G蛋白失活，處於關閉狀態。以上三個過程依次循環完成信號地傳遞。G蛋白在信號轉導的過程中主要發揮了分子開關作用與信號放大作用，通過G蛋白的激活與失活的循環，將信息精確無誤地傳到細胞並引起一系列的細胞內反應。
5.1.2.4 G蛋白主要的效應器及相關信息的轉導途徑介紹
（一）腺苷酸環化酶（AC）系統
腺苷酸環化酶系統主要介導cAMP－蛋白激酶A途徑，是激素調節物質代謝的主要途徑。胰高血糖素、腎上腺素和促腎上腺皮質激素等與靶細胞質膜上的特異性受體結合，形成激素受體復合物而激活受體。活化的受體催化G蛋白形成αs－GTP。釋放的αs－GTP能激活腺苷酸環化酶，催化ATP轉化成cAMP，使細胞內cAMP濃度升高，cAMP能進一步激活PKA（蛋白激酶A），PKA再通過一系列化學反應（如磷酸化其他蛋白質的絲/蘇氨酸）將信號進一步傳遞，達到信號轉導的目的。腺苷酸環化酶（AC）由GS激活而被Gi抑制。這種環化酶的同工酶中，AC2和AC4是被Gβγ和Gα亞基共同激活; AC1型被Gα亞基激活而被Gβγ抑制,因此不能被G蛋白活化; AC3,AC5,AC6和AC9不能與Gβγ直接作用。
（二） 磷脂酶C（PLC）系統
是由G蛋白耦聯受體介導的一個重要的信息轉導途徑。促甲狀腺素釋放激素、去甲腎上腺素和抗利尿激素等與靶細胞膜上特異性受體結合後，活化的G蛋白直接作用於PLCB，經PLCB調節蛋白轉導，可激活磷脂醯肌醇特異性磷脂酶C（PI-PLC），後者催化膜內側組分――磷脂醯肌醇4，5－二磷酸（PIP2）水解產生肌醇三磷酸( IP3 )與二酯醯甘油(DAG) 。後兩者都可作為第二信使發揮作用。DAG生成後仍留在質膜上，在磷脂醯絲氨酸和Ca離子的配合下激活蛋白激酶C（PKC），蛋白激酶C也能通過磷酸化一系列靶蛋白的絲/蘇氨酸殘基來達到進一步轉導信息的目的。
（三） 相關離子通道的調節
GαS亞基在重組系統中被證明可調節至少兩種離子通道：即骨骼肌細胞中的Ca離子通道和心肌中的Na離子通道；Gαi也能抑制Ca離子通道而激活K離子通道。在心肌K離子通道的激活能力上Gβγ比Gαi更有效。通過G蛋白，調節相關離子通道的開放來達到信息的轉導也是G蛋白耦聯受體介導的一種有效調控方式。
5.1.2.5 G蛋白耦聯受體傳導通路的研究展望
近年來，人們在G蛋白耦聯受體傳導通路的研究上取得了不少進展，但是，仍然存在很多機制上不清楚的地方，主要有以下方面：
（1）GPCRs顯然不僅僅是簡單的開關裝置，而是高度動態的結構，處於非活性和活性構象的平衡之中，那麼GPCRs活化的具體機制是什麼，還有對GPCRs的各種調節機制特別是受體的失敏和內吞機制仍不十分清楚，是今後的重要研究方向；
（2）在G 蛋白的研究上也還存在著一些問題，如G蛋白僅提供了不同的受體信號相互整合以及將不同的信號分送到不同的效應系統的最初機會，不同的效應系統通過完全不同的方式傳遞信號，誘發生理功能，而有關效應系統之間的聯系研究很少；關於活化G蛋白和效應應答之間的聯系，目前了解得很少；另外，通過一些實驗，如GTP 結合試驗、免疫反應、分離純化以及分子生物學和生理實驗發現在植物中存在G蛋白的類似物,但其結構是否與動物G蛋白相同還不清楚等；
（3）G蛋白在細胞內轉導信息的過程中，有很多的路徑與相關的效應器，對這些效應器作用機制仍然缺乏一個全面清晰的了解，因此對具體作用機制的研究也是一個極為重要的方向。
5.1.3 單個α螺旋受體
這類受體主要有酪氨酸激酶受體型和非酪氨酸激酶受體型，介導的傳遞途徑包括體內傳遞信息的重要路徑酪氨酸蛋白激酶體系等，此處從略。
5.1.4 具有鳥氨酸環化酶活性的受體 胞內受體多為反式作用因子，當與相應配體結合後，能與DNA的順式作用元件結合，調節基因轉錄。能與該型受體結合的信息物質有類固醇激素、甲狀腺激素和維甲酸等。

㈢ 細胞信號轉導的傳遞途徑主要有哪些

專業名詞叫細胞信號轉導
從大類上看共分為
1．G蛋白介導的信號轉導途徑G蛋白可與鳥嘌呤核苷酸可逆性結合.由x和γ亞基組成的異三聚體在膜受體與效應器之間起中介作用.小G蛋白只具有G蛋白亞基的功能,參與細胞內信號轉導.信息分子與受體結合後,激活不同G蛋白,有以下幾種途徑：（1）腺苷酸環化酶途徑通過激活G蛋白不 細胞信號轉導同亞型,增加或抑制腺苷酸環化酶（AC）活性,調節細胞內cAMP濃度.cAMP可激活蛋白激酶A（PKA）,引起多種靶蛋白磷酸化,調節細胞功能.（2）磷脂酶途徑激活細胞膜上磷脂酶C(PLC),催化質膜磷脂醯肌醇二磷酸（PIP2）水解,生成三磷酸肌醇（IP3）和甘油二酯（DG）.IP3促進肌漿網或內質網儲存的Ca2+釋放.Ca2+可作為第二信使啟動多種細胞反應.Ca2+與鈣調蛋白結合,激活Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶或磷酸酯酶,產生多種生物學效應.DG與Ca2+能協調活化蛋白激酶C（PKC）.
2．受體酪氨酸蛋白激酶(RTPK)信號轉導途徑受體酪氨酸蛋白激酶超家族的共同特徵是受體本身具有酪氨酸蛋白激酶（TPK）的活性,配體主要為生長因子.RTPK途徑與細胞增殖肥大和腫瘤的發生關系密切.配體與受體胞外區結合後,受體發生二聚化後自身具備(TPK)活性並催化胞內區酪氨酸殘基自身磷酸化.RTPK的下游信號轉導通過多種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的級聯激活：（1）激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）,（2）激活蛋白激酶C（PKC）,（3）激活磷脂醯肌醇3激酶（PI3K）,從而引發相應的生物學效應.
3．非受體酪氨酸蛋白激酶途徑此途徑的共同特徵是受體本身不具有TPK活性,配體主要是激素和細胞因子.其調節機制差別很大.如配體與受體結合使受體二聚化後,可通過G蛋白介導激活PLC-β或與胞漿內磷酸化的TPK結合激活PLC-γ,進而引發細胞信號轉導級聯反應.
4．受體鳥苷酸環化酶信號轉導途徑一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）可激活鳥苷酸環化酶（GC）,增加cGMP生成,cGMP激活蛋白激酶G（PKG）,磷酸化靶蛋白發揮生物學作用.
5．核受體信號轉導途徑細胞內受體分布於胞漿或核內,本質上都是配體調控的轉錄因子,均在核內啟動信號轉導並影響基因轉錄,統稱核受體.核受體按其結構和功能分為類固醇激素受體家族和甲狀腺素受體家族.類固醇激素受體（雌激素受體除外）位於胞漿,與熱休克蛋白（HSP）結合存在,處於非活化狀態.配體與受體的結合使HSP與受體解離,暴露DNA結合區.激活的受體二聚化並移入核內,與DNA上的激素反應元件（HRE）相結合或其他轉錄因子相互作用,增強或抑制基因的轉錄.甲狀腺素類受體位於核內,不與HSP結合,配體與受體結合後,激活受體並以HRE調節基因轉錄.
總之,細胞信息傳遞途徑包括配體受體和轉導分子.配體主要包括激 細胞信號轉導素細胞因子和生長因子等.受體包括膜受體和胞內受體.轉導分子包括小分子轉導體和大分子轉導蛋白及蛋白激酶.膜受體包括七個跨膜α螺旋受體和單個跨膜α螺旋受體,前一種膜受體介導的信息途徑包括PKA途徑,PKC途徑,Ca離子和鈣調蛋白依賴性蛋白激酶途徑和PKG途徑,第二信使分子如cAMP、DG、IP3、Ca、cGMP等參與這些途徑的信息傳遞.後一種膜受體介導TPK—Ras—MAPK途徑和JAKSTAT途徑等.胞內受體的配體是類固醇激素、維生素D3、甲狀腺素和維甲酸等,胞內受體屬於可誘導性的轉錄因子,與配體結合後產生轉錄因子活性而促進轉錄.通過細胞信息途徑把細胞外信息分子的信號傳遞到細胞內或細胞核,產生許多生物學效應如離子通道的開放或關閉和離子濃度的改變酶活性的改變和物質代謝的變化基因表達的改變和對細胞生長、發育、分化和增值的影響等.

㈣ 口腔執業醫師考點：胞內受體介導的信號轉導機制

已知通過胞內受體調節的激素有糖皮質激素、鹽皮質激素、雄激素、孕激素、雌激素、甲狀腺素、維A酸、1，25-(OH)2維生素D3。位於細胞內的受體多為轉錄因子，當與相應配體結合後進入細胞核內，與DNA的順式作用元件結合，在轉錄水平調節基因表達。

例題：激素的第二信使不包括：

A.PIP2 B.cAMP C.DG D.Ca2+ E.IP3

答案：A

概述：

細胞內受體的本質是激素激活的基因調控蛋白。在細胞內，受體與抑制性蛋白(如Hsp90)結合形成復合物，處於非活化狀態。配體(如皮質醇)與受體結合，將導致抑制性蛋白從復合物上解離下來，從而使受體暴露出DNA結合位點而被激活。這類受體一般都有三個結構域：位於C端的激素結合位點，位於中部富含Cys、具有鋅指結構的DNA或Hsp90結合位點，以及位於N端的轉錄激活結構域。

甾 類激素類：

甾 類激素分子是化學結構相似的.親脂性小分子，分子相對質量為300Da左右，可以通過簡單擴散跨越質膜進入細胞內。每種類型的 甾 類激素與細胞質內各自的受體蛋白結合，形成激素-受體復合物，並能穿過核孔進入細胞核內，激素和受體的結合導致受體蛋白構象的改變，提高了受體與DNA的結合能力，激活的受體通過結合於特異的DNA序列調節基因表達。受體與DNA序列的結合已得到實驗證實，結合序列是受體依賴的轉錄增強子，這種結合可增加某些相鄰基因的轉錄水平。

甾 類激素誘導的基因活化分為兩個階段：①直接活化少數特殊基因轉錄的初級反應階段，發生迅速;②初級反應的基因產物再活化其他基因產生延遲的次級反應，對初級反應起放大作用。如果蠅注射蛻皮激素後僅5～10min便可誘導唾腺染色體上6個部位的RNA轉錄，再過一段時間至少有100個部位合成RNA，致使大量合成次級反應所特有的蛋白質產物。慧耐這類激素作用通常表現為如影響細胞分化等長期的生物學效應。

甲狀腺素和雌激素也是親脂性小分子，其受體位於細胞核內，作用機理與 甾 類激素相同。也有個別的親脂性小分子，如前列腺素，其受體在細胞膜上。

NO途徑：

NO是另一種可進入細胞內部的信號分子，能快速透過細胞膜，作用於鄰近細胞。R.Furchgott等三位美國科學家因發現NO作為信號分子而獲得1998年諾貝爾醫學與生理學獎。

血管內皮細胞和神經細胞是NO的生成細胞，NO的生成由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化，以L精氨酸為底物，以還原型輔酶Ⅱ(NADPH)作為電子供體，生成NO和L瓜氨酸。NO沒有專門的儲存及釋放調節機制，靶細胞上NO的多少直接與NO的合成有關。

血管內皮細胞接受乙醯膽鹼，引起胞內Ca2+濃度升高，激活一氧化氮合酶，細胞釋放NO，NO擴散進入平滑肌細胞，與胞質鳥苷酸環化酶(GTP-cyclase，GC)活性中心的Fe2+結合，改變酶的構象(圖8-32)，導致酶活性的增強和cGMP合成增多。cGMP可降低血管平滑肌中的Ca2+離子濃度。引起血管平滑肌的舒張，血管擴張、血流通暢前返春。

硝酸甘油治療心絞痛具有百年的歷史，其作用機理是在體內轉化為NO，可舒張世陸血管，減輕心臟負荷和心肌的需氧量 。

㈤ 信號通路研究思路

原文：信號通路研究思路_網路文庫 https://wenku..com/view/449d5a41ec3a87c24128c450

證明一個葯物能通過抑制P38表達而發揮保護細胞的作用，需要做的是：

要證明你的葯物是通過抑制P38表達而發揮保護作用，

首先 ，要證明P38表達增加會導致損傷。

其次，要證明你的葯物存在保護作用。

再次，證明你的葯物可以抑制P38表達。

最後，證明你的葯物是由於抑制了P38表達而發揮保護作用。

這里需要建立一個損傷模型。正如你提到的，鈣離子導致P38mapk的增高，如果某種損傷可以通過鈣離子導致P38mapk的增高，那麼你就建立起了一個損傷模型。這時，對P38做個RNA干擾，使其表達下降，再來損傷刺激，如果這時損傷刺激不會導致損傷，那麼可以說P38mapk的增高會導致損傷。

這里最好不要用P38的抑制劑SB來處理，因為這個抑制劑是針對P38活性的抑制劑，抑制的是P38的磷酸化，而不是表達量。

如果說明的問題是p38磷酸化水平增加而導致損傷，那麼我建議用抑制劑。這時還可以用Dominant-negative。抑制劑的實驗證實該葯物不影響P38表達，而影響其活化。（應該首先考慮選用抑制劑，因為目前一些葯物的作用機制不是抑制靶點的表達，而是抑制靶點的激活。如果在此應用RNAi的話，很可能會漏掉這個機制或增加實驗步驟。）

當然就是用你的葯物先處理一下，再來損傷刺激，如果這時損傷刺激不會導致損傷，那麼可以說你的葯物存在保護作用。

用你的葯物先處理一下，再來損傷刺激，再檢測P38表達，如果用葯組相對於沒有用葯組P38表達下降，那麼可以說你的葯物可以抑制P38表達。

這一步看似不必要，其實是最重要的步驟，而國內的文章往往忽略了這一關鍵環節。

這里建議還是用RNA干擾P38表達，再用你的葯物處理，再進行損傷刺激，如果用葯組與沒有用葯組的損傷程度一致，那麼才可以說你的葯物是由於抑制了P38表達而發揮保護作用。

抑制劑也有其局限性，有時是「致命」的，主要原因是抑制劑缺乏特異性。雖然我們在文章里看到用抑制劑的時候都說是什麼什麼的特異性抑制劑，但真的那麼特異嗎？其實往往是作者為了寫文章發文章的需要而誇大了抑制劑的特異性。細胞里無數的信號通路，誰也不能保證抑制劑在作用於靶分子時不會影響其他信號通路。其實無論什麼抑制劑，對劑量的要求都相對比較苛刻，為什麼？就是因為一旦濃度高了，就不知道會干擾到其他哪些信號通路，從而產生很多說不清道不明的現象。

PI3K的抑制劑---LY294002和wortmannin,它們都能抑制PI3K和相關的激酶，但LY294002的濃度達到200μM常用來抑制DNA依賴的蛋白激酶（DNA-PK）；wortmannin在濃度超過3μM常用來抑制運動失調性毛細血管擴張基因突變（ATM)以及DNA-PK。相對而言，MEK1/2的抑制劑U0126和PD98059以及P38MAPK的抑制劑SB203580就要好一些。所以研究人員一般應用LY294002時採用20μM，應用wortmannin時採用0.2μM，以此來最小化其他的效應。有些學者們同時應用兩種抑制劑進行對比，也許也有顧及於此的原因吧。

但是，從嚴謹的角度講起特異性的話，RNAi也不能說是絕對特異的，我們只能說它是高特異性，因為RNAi的機制中還有很多沒有完全闡明。 一些研究者會在RNAi處理後，還要在實驗中應用Western來同時檢測該蛋白所在家族的其他成員的表達量變化以檢測其特異性和選擇性，以表嚴謹 。舉個例子：

比如針對Survivin進行RNAi之後，你最好同時檢測XIAP , cIAP1/2等蛋白。當然，如果你所針對基因的siRNA構建已經很成熟，有前人的文章檢測特異性做基礎，那就另當別論了，所以給科研態度很嚴謹的lwjssry兄弟提個醒，如果你的siRNA序列尚無很好的文獻應用基礎，這個問題你也許應該考慮的。

臨時找到一個描訴相關內容的06年文獻，影響因子3分多，截取其中的內容供參考

信號通路有細胞特異性和條件特異性，即同一信號通路在不同的細胞之間或同一細胞在不同的條件下，作用機理可能是不同的。

細胞內的信號通路之間存在復雜的相互作用，想證明哪一個分子是另一分子的充要條件真的很難。本人最近研究了一個信號系統的兩個信號分子，A和B。A在細胞質，B在細胞核。以往的研究已經證明A是B的上游信號通路之一。我們的研究是想證明在某種病理過程中A和B作為一個系統發揮作用。我們首先應用能夠提升該系統的葯物干預，發現A升高的同時B也得到升高，但這也不能說明什麼問題。所幸的是A分子目前有特異性的阻斷劑，於是我們便對A分子的激活進行阻斷，結果發現B分子的激活也收到抑制。由此初步推測A和B可能在某種病理過程中作為一個系統發揮作用。但也只能證明了A是B的必要條件而已。

做信號傳導的在於你研究一種的機制有什麼作用，其機制是否於信號傳導有關，有哪些關系，是什麼原因導致此信號傳導的表達，表達後的下游基因怎麼變化，這中間最好有基因敲出或者抑制劑和激動劑干預後看看上游 下游之間的變化和你預期的結果有沒有關系。如果單純的做信號傳導而去做沒有什麼意義的，就像前面樓上說的一樣信號的啟動/最終發揮功能！

「想證明哪一個分子是另一分子的充要條件真的很難」。 我最近正在做一個實驗，證明A對B的作用。先用外源物處理細胞，跑wetern blot，發現A和B都有所增加，B的量增加在A之後。於是用抑制劑抑制A，以及用siRNA使A knockdown，然後看B的表達量也下來了。但是這也只能證明A和B有關聯，無法證明A對B是直接作用還是間接作用。甚至無法說明B的改變是A信號knockdown造成的，還是A信號knockdown以後，細胞為了彌補該信號的不足，補充促進了C信號，而C信號可以改變B信號。最近在考慮用Co-IP證明A和B有結合作用，也許能證明A和B的直接關系。

探討信號轉導中分子間的充要條件，與探討數學中的充要條件是不一樣的，因為細胞中信號轉導通路往往存在反饋機制。即使X是上游信號，Y是下游信號，改變Y信號也會通過反饋機制使得X信號發生改變。所以，在考慮生物體內的信號分子間充要條件時會復雜得多，要慎之又慎下結論。

信號分子的環路效應普遍存在

個人覺得研究A分子與某個信號通路應該更具體得分為兩種情況：

1，以前還不知道A分子是這個信號通路的成分，這時我們要證明A分子是這個信號通路的成分，這時的研究就是上文談到的研究內容了。

2，A分子是信號通路的成分，這是已知的，現在發現某個現象跟這個通路有關，現在我們要證明A分子是這個信號通路參與這個現象的關鍵分子，則又是另一種模式。1，「創造信號通路」，別人沒有研究過A和B 之間的相互作用，而你發現了，並證明了，這就是創造，其實准確點說應該是「發現」，因為信號通路是客觀存在的，只不過被找到了而已，不過用「創造」這個詞比較形象。這一類的研究是開創性的，比較困難的，研究的時候常常是用免疫共沉澱去把與某個蛋白結合的一堆蛋白都搞出來，再做質譜分析，進行鑒定，再進一步證明兩者間的相互作用，這就涉及到充分必要條件的證明。單純進行這一類的研究缺乏目的性和研究的意義，所以通常還是建立於某種現象基礎上的，用自己「創造」的信號通路來解釋某種現象，也就是下面說的第二種模式。

2，「利用信號通路」，利用別人或自己「創造」的信號通路來解釋某個具體的現象，比如，某個葯物、某種毒物、某種應激、某種射線、等等，在這些刺激下，具體到某種細胞的某條信號通路發揮調控作用。

在第一類中，是用充分必要條件來證實A分子與B分子的作用。

在第二類中，是用充分必要條件來證實A現象與B信號通路之間的關系。

看文獻是最基礎的訓練，看文獻，一是看思路，二是學技術和邏輯思維。思路告訴我們為什麼去做，技術和邏輯思維教我們怎麼去做。

過表達A基因，發現B基因的mRNA水平明顯增加，對應的B的蛋白水平也明顯增加；干擾A基因表達，發現B基因的mRNA水平明顯降低，對應的B的蛋白水平也明顯降低。投稿，被拒稿，主要原因是審稿人提出：應該弄清楚A是如何調控B的表達的。請問各位老師，A調控B可能是通過什麼途徑？需要做什麼實驗？A和B都是脂類代謝中的酶基因，它們在胞漿和核內都有表達。

回答：

1、下一步應該搞清楚B基因mRNA改變的原因是什麼，在轉錄水平還是影響了RNA的穩定性。

2、假設A和B是直接關聯的（假定A影響B的轉錄），是否一般得做兩個實驗：Luciferase reporter assay和CHIP assay？只做一個CHIP實驗行不行？其中Luciferase reporter assay是否就是為了檢驗A蛋白是否能結合到B基因的Promoter區？是不是A蛋白必須得是轉錄因子才有可能結合到B基因的Promoter區？另外，怎麼知道A蛋白是不是轉錄因子呢？

針對這個問題的回答：不過建議找幾篇JBC上的文章看看，JBC上這種調調的文章挺多的，精讀3-5篇，把它的outline搞清楚，你就胸有成竹了。——我打開JBC網站一看，呵呵，每期專門有Gene Regulation板塊。根據JBC上面的文章，A調控B基因，很多都是通過第三者如轉錄因子實現的。我再翻出以前自己的Real-time PCR實驗結果，發現過表達A基因後，轉錄因子C的mRNA水平顯著增加，而干擾A基因表達，轉錄因子C的mRNA水平顯著降低。目前這個現象還沒有文獻報道。後期，我准備通過Luciferase reporter assay和CHIP assay來驗證轉錄因子C是否能與B基因作用。我想請教的問題是：A基因調控轉錄因子C，除了前期的Real-time PCR實驗（當然再補一個Western Blot實驗），我還需要做其他實驗嗎？會不會審稿人再提出：你需要弄清楚A基因如何調控轉錄因子C才行。說簡單點：A基因通過轉錄因子C調控基因B，是否要將A影響C，C影響B兩步都弄清楚？——看你的目標雜志了，如果是JBC這樣偏機制的，估計會要你說清楚的

3、A可以影響B的mRNA水平，也能影響B的蛋白水平，這樣的話，可能是只通過影響B的RNA水平影響B的蛋白表達，也可能同時影響B的RNA水平和B的蛋白穩定性。B的蛋白穩定性你可以通過加入CHX檢測B的半衰期。另外就是你說的Luciferase reporter assay實驗。

4、A和B的變化總是一致的，應該很有可能是通過轉錄水平調控的，因為你的mRNA、蛋白都變了。既然是轉錄水平，那就要找到B的啟動子的序列，對應和這個序列結合的蛋白，這個蛋白可能是A也可能是其他的間接的。

http://..com/question/187327495.html
將兩種因子A和B分別做基因沉默，沉默A gene 看看A和B表達的情況，然後沉默B gene 再看看A和B表達的情況。上游的因子被沉默表達後，下游的因子肯定表達下調或不表達。而下游因子被沉默表達後，上游因子的表達不會受影響。還可以做個免疫共沉澱，看看上游因子是不是直接結合（作用）於下游因子的基因啟動子區，開啟下游表達。如若不是，可能另有其他的環節在中間過程。

http://www.helixnet.cn/bbs/thread-19295-1-1.html
《受體信號轉導研究方法（第2版） 》
作者： （英）維拉斯（Willars，G.B.），（英）查理斯（Challiss，R.A.J）原著，
張幼怡主譯
出 版 社： 北京大學醫學出版社
出版時間： 2008-3-1 <wbr>
這本書全面反映了G蛋白偶聯受體(GPCR)及其信號轉導領域中最新的研究現狀和成就，詳細介紹了受體及其信號轉導研究的技術、方法及原理。內容涉及受體與配體的結合、受體抗體的制備、受體與G蛋白的相互作用和激動、受體表達和定位、受體內化和翻譯後修飾、GPCR與蛋白質相互作用以及如何利用敲除和敲人策略研究受體生理與葯理功能等新技術、新策略。

可以通過對受體 加抗體處理 或者 RNAi/過表達 等方式，調節受體表達量，然後用 基因晶元技術 研究下游通路各基因的表達情況。

在上述方法做完後，可以用受體的好用的抗體，做個免疫共沉澱(CoIP)，將所有和它相互作用的蛋白抓下來，直接煮珠子(protein A-argrose-beads)，做SDS-PAGE，用IgG做對照，然後打質譜，鑒定出差異蛋白，當然這只是補充試驗，膠圖上分子量大的可能是下游蛋白，而分子量小的可能是上下游信號蛋白。

㈥ 雌激素受體的雌激素受體的信號轉導途徑

雌激素細胞內信號轉導包括：核啟動的類固醇信號傳送（nuclear-initiatedsteroidsignaling，NISS）即基因組作用模式和膜啟動的類固醇信號傳送（membraneinitiatedsteroid signaling，MISS）即為非基因組作用模式。 MAPK/ERK信號轉導途徑——ER活化MAPK/ERK的過程主要靠相關分子形成復合體來介導，主要有ERα-Shc-IGFR復合體和PELPl/MNAR-ER-Src復合體。前者主要是在Shc 的PTB/SH2 結構和ERa 的AF-1的參與下，通過磷酸化的Shc、IGFR與ERα結合，從而發揮生物效應。而後者中，PELP1/MNAR既定位於細胞核又定位於細胞膜，MNAR 和PELP1上有兩種不同的模體，可以分別ERa、c-Src結合形成復體，從而發揮作用。PI3K/Akt信號轉導途徑——PI3K與多種細胞因子轉導途徑相關，已有報道PI3K可以與EGFR和IGFIR相互作用，即可能有ERct-PI3K-生長因子受體復合體的存在，IGF-1R是乳腺癌細胞增殖的關鍵受體，主要通過PI3K/Akt途徑抑制細胞的凋亡。PI3K 可以介導多種細胞效應，而Akt則是PI3K的下游分子，Akt的活化能是因為ERα與PI3K相互作用。雌激素可以通過Ras/PI3K/Akt通路誘導凋亡相關蛋白BAD的磷晌游酸化，提PK3K/Akt 信號通路在雌激素抵抗腫瘤壞死因子、超氧化物等因素誘導凋亡的過程中具有潛在的重要意義。JNK信號轉導途徑—— 在表達ER的CHO細胞中，E2通過ERβ激活JNK，而通過ERα抑制這種激酶。JNK可以誘導細胞的凋亡作用，但有些激活JNK亡信號被存活信號通路所阻斷，包括NF-kB、Akt/PKB和ERK。GPER1介導的信號轉導途徑MAPK/ERK信號轉導途徑—— 雌激素結合GPER1通過下游分子Src、Ras、Raf、Mek級聯快速激活ERK，促進細胞增生並延長其生長周期。MAPK激活後在胞質中激活一系列其他蛋白激酶或進入核內引起轉錄因子AP-l、NF-kB磷酸化而調控基因的表達。用MCF-7乳腺癌細胞實驗首次證實雌激素可以通過激活ERK信號級聯反應刺激乳腺細胞的增生。GPER1介導的MAPK途徑和下文介紹的PI3K途徑都是通過反式激活EGFR來完成的。PI3K/Akt途徑——ER介導的PI3K-Akt-NO轉導途徑中，ER主要靠和其他配體結合成聚合體來起作用，如在血管內皮細胞中輪宏，膜ERα與Gai的偶聯才促進雌激素刺激eNOS的活化。在單層扁平上皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞以及脂肪細胞中大量存在的小窩結構中，也是形成了一個ERα/紋蛋白/小窩蛋白/eNOS復合體來發揮作用的。GPER1介導的轉導途徑主要靠PI3K-Akt-NO途徑來完成，雌激素與GPER1結合後，激活磷脂醯肌醇-3（PI3）激酶，進宴桐銷而激活蛋白激酶B(Akt)激酶，調節eNOS活性，產生NO。Vivacqua等發現活化的EGFR同時還能動員胞內鈣離子和激活磷脂醯肌醇-3激酶-Akt（PI3K/Akt）途徑，同樣達到促細胞增殖的效果cAMP/PKA途徑—— 雌激素可以通過GPER1活化腺苷酸環化酶（AC），並通過其作用使胞內環磷酸腺苷（cAMP）增加，激活cAMP依賴的蛋白激酶A（PKA），使Raf-1失活而減少ERK的量, 進而調控細胞生長。如雌激素可刺激cAMP-PKA途徑活化，激活cAMP反應元件介導的轉錄活性，而使細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表達增高加速器分裂增殖。Ca2+途徑——Revankar等用離體研究發現在調節Ca2+途徑來實現生物效應；Dennis等發現在轉染了GPER1的SKBr3細胞也存在這種現象。Romanò等在體研究發現GPER1參與了雌激素對下丘腦促性腺激素釋放激素細胞內Ca2+的調節並涉及到GABAA受體。
ER-X和Gaq-ER介導的信號轉導途徑
ER-X介導的雌激素受到腦發育以及缺血性腦損傷的調節並涉及到MAPK-ERK1/2信號途徑，ERK1和ERK2 的激活對神經元的存活和生長非常重要。Qiu等在敲除ER鼠下丘腦的弓狀核用一種作用與雌激素相仿的非甾體類混合物STX來靶向標記PLC-PKC-PKA，由此發現Gaq-ER參與了對PLC-PKC-PKA途徑的調節，具體程可能是：雌激素通過結合受體來激活Gaq，激活的Gaq再激活PLC，從而使PIP2水解出DAG激活PKC，PKC活化cAMP，升高的cAMP再激活PKA，從而使胞膜的鉀離子通道打開誘發相應的生物學效應。

㈦ 細胞生物學：受體與配體相互作用及研究方法

細胞通過化學信息進行通訊的能力取決於信號分子的合成與分泌以及受體與配體的相互識別和結合，配體與受體的結合又與配體與受體的結構和化學性質相關聯。

■ 表面受體超家族（surface receptor superfamilies）

根據表面受體進行信號轉導的方式將受體分為三大類，若是根據表面受體與質膜的結合方式則可分為單次跨膜、7次跨膜和多亞單位跨膜等三個家族（圖5-13）。

圖5-13 單次、7次與多亞基跨膜的表面受體

■ 受體與配體相互作用的特點

多細胞生物體中的細胞，其周圍環境中常常有多達幾百種的化學信號分子，細胞如何去識別？是否一種信號分子只能作用於一種類型的細胞？受體與配體如何結合？這些都是由受體自身的特性決定的。

● 特異性（specificity） 受體與配體的結合是高度特異性的反應，但不是絕對的， 有受體交叉（receptor crossover）現象 .

請設計一個實驗研究受體與配體結合的特異性

● 高親和力（high affinity binding）

受體與配體結合的能力稱為親和力。通過配體與受體結合反應的動力學分析可獲得親和力的信息。受體對其配體的親和力很強， 親和力越強， 受體越容易被占據。親和力的大小常用受體-配體復合物的解離常數（Kd）值來表示， 通常是10-9 M左右。

● 飽和性（saturation）

由於細胞含有有限數量受體分子，提高配體分子的濃度，可使細胞的受體全部被配體大槐所佔據，此時的受體處於飽和狀態，因為即使增加配體的濃度也不會增加配體與受體的結合。由於滾頃友一個細胞或一定組織內受體的數目是有限的， 因此受體與配體的結合是可以飽和的。

● 可逆性（reversibility）

配體與受體的結合是通過非共價鍵，所以是快速可逆的。 當引發出生物效應後， 受體-配體復合物解離， 受體可以恢復到原來的狀態， 並再次使用。受體與配體結合的可逆性有利於信號的快速解除，避免受體一直處於激活狀態。

● 生理反應 （physiological response）

信號乎飢分子與受體的結合會引起適當的生理反應，反應的強弱與結合配體的受體數量正相關。如在胰島素與受體的結合時，會激發葡萄糖向靶細胞的運輸，並且，葡萄糖運輸的數量隨受體結合胰島素的數量增加而增加。

㈧ 如何研究信號傳導通路請問研究某種受體或蛋白的下游信號傳導通路，實驗設計的一般方法，都有哪些謝謝

在KEGG或BioCarta這些pathway資料庫里找到你感興趣的通路，在pathway圖上找到你感興趣的蛋白後就能確認它的下游。實驗方法大體上就是上調（瞬時表達、mimics）或下調（Knockout、RNAi）你的Gene of Interest，再檢測下游的蛋白發生了上調還是下調，看看你的GOI和它們什麼聯系。

㈨ 信號傳導的信號轉導的基本步驟

信號轉導通常包括以下步驟：特定的細胞釋放信息物質→信息物質經擴散或血循環到達靶細胞→與靶細胞的受體特異性結合→受體對信號進行轉換並啟動細胞內信使系統→靶細胞產生生物學效應。通過這一系列的過程，生物體對外界刺激作出反應。

㈩ 簡述經膜受體介導的信號轉導途徑。

（1）受體-G蛋白-Ac途徑：激素為第一信使，帶著內外界環境變化的信息，作用於靶細胞膜上的相應受體，經G-蛋白耦聯，激活膜內腺苷酸環化酶（Ac），在Mg2+作用下，催化ATP轉變為環磷酸腺苷（cAMP），則細胞內的cAMP作為第二信使，激活cAMP依賴的蛋白激酶（PKA），進而催化細胞內多種底物磷酸化，最後導致細胞發生生物效應，如細胞的分泌，肌細胞的收縮，細胞膜通透性改變，以及細胞內各種酶促反應等。

（2）受體-G蛋白PLC途徑：胰島素、縮宮素、催乳素，以及下丘腦調節肽等與膜受體結合使其活化後，經G蛋白耦聯作用，激活膜內效應器酶——磷脂酶C（PLC），它使磷脂醯二磷酸肌醇（PIP2）分解，生成三磷酸肌醇（IP3）和二醯甘油（DG）。IP3和DG作為第二信使，在細胞內發揮信息傳遞作用。IP3首先與內質網外膜上的ca2+通道結合，使內質網釋放Ca2+入胞漿，導致胞漿內Ca2+濃度明顯增加，Ca2+與細胞內鈣調蛋白（CAM）結合，激活蛋白激酶，促進蛋白質酶磷酸化，從而調節細胞的功能活動。DG的作用主要是特異性激活蛋白激酶C（PKC）。PKC與PKA-樣可使多種蛋白質或酶發生磷酸化反應，進而調節細胞的生物效應。