1. wb實驗目的條帶就(一定比內參細嗎
要檢測一個基因的表達產物是否正確，或者比較表達產物量的相對變化，首選方法是western Blot。因為Western Blot操作相對簡單方便，既可以定性分析表達產物，同時還可以指示目的蛋白量的相對變化。雖然，順利的時候Western Blot做起來很簡單，可不順的時候也很令人心煩――做不出結果啦、假陽性啦、結果出現多條帶啦、到底是一抗有問題還是二抗有問題啦……畢竟，作為一種有活性的生物大分子，抗體和頃畢衡抗原的反應畢竟不象1+1那麼明確，而用這種不確定的試劑來測定同樣知之甚少的表達產物，確實是有一定的不確定性的。
所以，嚴謹 的Western Blot實驗設計中要求有良好的參照體系，對實驗結果分析是非常有用。特別是當實驗出現問題時，藉助參照體系很容易就可以查出問題所在，而不必抓耳撓腮怨天尤人。良好的參照體系通常包括分子量marker(用來確定蛋白條帶對應的分子量大小)，空白載體對照(如果是誘導表達體系還應該有誘導前的對照)，已知量標准產物的正對照;另外還有內參。可是由於經費限制或者偷懶的原因，國內的不少人做Western Blot往往省略參照，導致結果出現問題時無法分析結果――即便有結果也可能影響結果的分析。 內參是最容易被忽略的一項。
我們知道，要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的細胞上樣，才有比較的基礎。特別表達量不高時，上樣量的差別就很可能影響結果的分析。所以你需要內參。 內參即是內部參照(Internal Control)，對於哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恆定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting 實驗中，除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要數運進行內參的檢測，以校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的准確性。
在國外發表的文章中，Western Blotting 實驗結果須進行內參校正已成為一種慣例。但是，國內仍有不少科研人員在Western Blotting實驗中忽略了內參的使用，將蛋白濃度測定作為規范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法。然而各種蛋白質濃度定量方法，都存在局限性，不能完全准確的確定各種樣品的准確蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質，相對於比色法來說，操作簡單，但是容易受到平行物質的干擾，如DNA 的干擾;且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測定蛋白濃度一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。Bradford 法敏感度最高，且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑(如DTT，巰基乙醇)相容。但是對於去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點是不同的標准品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。
另外，蛋白質定量以後進行電泳時需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Western blotting實驗時使用內參，即可簡便地對定量和上樣步驟產生的誤差進行校正。 在Western Blotting中使用內參其實就是在WB過程中的另外用內參對應的抗體檢測內參，這樣在檢測目的產物的同時可以檢測內參的表達，由於內參在各組織和細胞 中的表達相對恆定，藉助檢測每個樣品內參的量就可以用於校正上樣誤差，這樣半定量的結果才更為可信。此外使用內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否 完全、整個Western Blot顯色或者發光體系是否正常。
實驗雀做結果分析其實很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進行一次電泳轉膜實驗時，分別檢測樣品的內參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內參含量，得 到的數值即為內參校正後的各樣品中目的蛋白相對含量，再用此數值進行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實際變化結果。如果樣品量充分， 可以先檢測內參，觀測樣品間內參顯色條帶是否一致，根據差異大小調整各樣品的上樣量重新進行Western Blotting實驗，至內參量一致為止;若內參一致，即可進行不同樣品間目的蛋白表達變化分析。這樣雖然麻煩一點，但是可以保證結果更有說服力，更可信。畢竟我們的實驗是一種嚴謹的工作。
附：在Western blotting實驗過程中使用內參的方法有：
一、 超級簡便的標記內參使用法：只要在二抗孵育時加入HRP標記內參抗體，按照正常操作即可。
二、普通內參：當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然後使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。
三、當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉膜後預染，根據蛋白質Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內參蛋白與目的蛋白分開。然後兩塊膜分別與內參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育，二抗溫育以及顯色。
2. wb條帶怎麼分析粗細深淺
根據蛋白質表達量分析。wb就是艾滋病抗體確證試圓搜驗，主要是監測env的條帶，只要出現兩個env條帶，就可以判橘桐歷定是陽性，所以主要是檢測env條帶。wb條帶粗細深淺表示蛋白質表達量，所以粗細深淺根據蛋白質表達量分析。蛋白質表達量是包含蛋白質的聚集體形態、單體形態和含有fc的片段的加和值。輪哪
3. graphpad prism分析WB條帶
打開Image J軟體導入WB條帶圖片：File→Open→找到鄭廳WB條帶把圖片轉化成灰度圖片：Image→Type→8-bit。消除圖片背景的影響：Process→Subtract Background，在彈出的對話框中，填上50基本就可以了，並勾上Lightbackground，點擊OK。此時圖片背景會變白一些。設置定量參數：Analyze→Set Measurements。在彈出的對話框中勾選Area、Mean grayvalue、Min& max gray value、Integrated density。設置單位：Analyze→Set Scale。在彈出的對話框「Unit of length」後面填上「pixels」，其他的不用改動。把WB圖片轉換成亮帶：Edit →Invert選擇菜單欄下的不規則圓形工具，將圓圈手動拉倒第一條帶，並盡量將條帶都圈起來。點擊菜單欄Analyze下拉出現的measurement，即可彈出你選定區域的灰度統計值。也可以點擊快捷鍵英文狀態下的鍵盤m手動移動不規則圓圈至下一條條帶，重復8、9步驟，直至所有條帶都被測量當測定完所有條帶，選結果中的「Edit」的「Select All」，然後鬧啟復制數據「IntDen」到Excel表即可進行分析。也可以直接在Results對話框中，選擇File →Saveas，直接導出excel表格在excel表格中將目的蛋白的灰度值除以內參蛋白的灰度值，進行歸一化處GraphpadPrism軟喊彎隱件中作柱狀圖。
4. wb電泳時條帶不齊
wb電泳時條帶不齊的姿敗原因：根據銀薯自己做的經驗鋒冊者提供一點建議:膠是否是新配的，能先用小電跑，盡量讓條帶跑齊，再換大電壓。板和架子沒合嚴，兩板之間的液面一部分已經低於薄板完成了部分斷路，跑一會停一下打開看看，補下緩沖液試試。
5. wb條帶顏色調深
1、首先打開photoshop軟體，在激配改主界面將wb條帶圖片導入。賣薯
2、其次在上面功能選項中，點擊灰階處理，將wb條帶調整到背景全白，中和灰色階調，強化深色區段為純黑色，把淡色范圍大幅度降低明度。
3、最後將灰度值調到10%，wb條帶的顏明判色就會變深。
6. wb條帶分析
ImageJ的軟體界面
1.ImageJ對WB條帶進行灰度分析
1）File|Open打開WB結果圖片
2）圖片類型設置：Image|Type|8bit
3）去除圖片背景：Process|Subtract Background
在Subtract Background窗慎臘口按照以下條件進行設置：
4）設置定量參數：Analyze |SetMeasurements,點擊Area，Mean Gray Value及Integrated Density
5）設置單位: Analyze|SetScale,在「unit of length」的方框里輸入「寬悄滑pixels」
6）將圖片轉換成亮帶運沖，Edit|Invert
7）選擇Freehand Selection,盡量把條帶圈起來，點擊鍵盤m，出來IntDen灰度值
8）復制數據IntDen進行分析
7. ppt怎麼把wb條帶拉直
選取待調曲線，右鍵編輯頂點。
右鍵編輯頂點，在此基礎上右鍵，刪除頂點，逐一刪除，只剩兩個端點。先選中所有點直線，再擊繪圖工具的下皮培拉箭頭（一般在左下角），對齊或分布，然後再在裡面找到你想要的對齊方式，如：右對齊，垂直分布，水平分布等。
這個組緩做織架構圖一開始自動生成的下方擾握衡都是直的吧。你試著把不整齊的刪掉重新添加。
8. 跑的western條帶很臟怎麼解決
western條帶很臟可通過嘗試使用以下方法解決：
1、過濾封閉液或選用其漏清喊他類型封閉液；
2、與其他品牌已驗證過好用的抗體處理相同樣本，作比較，看是否還有斑點；
3、更換試劑。
western條帶顯影臟，一般由以下原因造成：
1、封正洞閉液溶解不完全或封閉液存放時間太久；
2、抗體返野中可能存在雜質；
3、試劑污染。
9. 如何ps修改western條帶的灰度值
Western Blot是一種對蛋白進行定性的分析方法，屬於常規實驗操作，其數據處理是必不可少的一步。目前，發表的實驗性文獻中大多要求包含WB的半定量分析數據。今天，小編給大家介紹用PS進行灰度分析及之後的數據作圖處理。
使用軟體本文中使用的軟體為Photoshop CC，其他版本的Photoshop，操作步驟基本相似。1、在PS中打開western blot圖片2、設置參數，在圖像-分析-選擇數據點，選擇灰度值（信物平均），其他選項可取消3、處理圖片，圖像-調整-反向4、灰度測量，使用魔棒工具點擊要分析的條帶，下面會顯示出灰度值5、導出數據，點第一行後按住shift鍵，點最後一行進行全選數據，導出數據6、在Excel表格中計算目的蛋白和內參蛋白的平均灰度值，用平均目的蛋白除以平均滑仿液內參蛋白；得到多組比值後，用GraphPad繪制柱狀圖（大正其他軟體也可以）7、GraphPad繪制柱狀圖的過程，8、得到柱狀圖
10. WB相關技巧--quantity one軟體調節內參
1.跑WB 有時碰歷候不想做PCA定量怎麼調節內參呢？
解答：有老司機認為憑借經驗可以用肉眼看出來差異，可是對於新手來說總不能做個幾百次才像他們獲得經驗吧，這時候定量就是急需的內容了，對不對？ 解決方法呢？ 一般可以用image J 軟體笑納搜或者quantity one軟體進行操作， 原理為 ：image J 是依據灰度值（也就是白色到黑色的顏色變化程度茄知）進行的調節；quantity one是依據密度或者體積（也就是條帶的大小）； 結果： quantity one 貌似用體積方法好用一點點。
流程如下：打開quantity one 軟體 之後導入圖片（tiff文件，之前試跑的條帶），
結果為：