武漢腸道微生物多樣性分析方法

① 微生物多樣研究—微生物深度分析概述

一、微生物深度分析方法核心思想

復雜微生物群落解構的核心思想：

不預設任何假定，客觀地觀測整個微生物組所發生的一系列結構性變化特徵，最終識別出與疾病或所關注的表型相關的關鍵微生物物種、基因和代謝產物。

二、微生物深度分析方法—關聯分析

進行微生物群體關聯分析，需要結合兩大類傳統的統計分析方法：

   1）無監督學習（Unsupervised learning）

   2）有監督學習（Supervised learning）

無監督學習： 基於對數據結構的自然分解和觀察。

主要包括以下三類方法：

   1）主成分分析（Principal component analysis，PCA）；

   2）多維手腔頌尺度分析（Multidimensional scaling， MDS）；

   3）聚類分析（Clustering analysis）

有監督的學習： 則是基於某種已知的樣品間相互關系，盡可能地按照這種關系提取原始數據中的相關信息。

傳統的有監督學習方法包括：

 冗餘分析（Rendancyanalysis，RDA） 

 典型相關分析（Canonicalanalysis） 

 偏最小二乘判別分析（Partialleast squares discriminant analysis，PLS-DA） 

 ……等約束排序方法（Constrainedordination）。

三、微生物深度分析方法—多維度結合分析

※ 考慮微生物群落成員之間的系統發育關系，可以將這些有監督的學習方法與無監督的多維尺度分析相結合。

即：把通過給定樣品間距離進行線性變換分解得到的新變數用於有監督的學習。

由此衍生出基於距離的冗餘分析（Distance-basedrendancy analysis，db-RDA）和主坐標典型相關圓緩分析（Canonical analysis of principal coordinates，CAP）

 ▲  通過約束排序，可以對群落樣品間的相互關系是否遵循已知樣品分布規律做出判斷。

四、隨機森林演算法

隨機森林（RandomForests）方法找尋關鍵變數。 

隨機森林：是一種基於決策樹（Decision tree）的高效的機器學習演算法，可以用於對樣品進行分類（Classification），也可以用於回歸分析（Regression）。  

隨機森林屬於非線性分類器，因此可以挖掘變數之間復雜的非線性的相互依賴關系。

五、ROC曲線

接收者操作特徵曲線（Receiveroperating characteristic curve，ROC曲線）也是一種有效的有監督學習方法。  

ROC 分析屬於二元分類演算法，用來處理只有兩種分類的問題，可以用於選擇最佳的判別模型。

六、LEfSe分析

LEfSe分析： 基於線性判別分析（Lineardiscriminant analysis，LDA）效應量（Effectsize）的分析方法。

本質是將線性判別分析與非參數的Kruskal-Wallis以及Wilcoxon秩和檢驗相結合，從而篩選關鍵的生物標記物（也就是關鍵群落成員）。

七、基於微生物成員之間的網路推斷分析

這類分析的 根本目的 ：考察不同群落成員之間的相互作用，通過關聯分析的方法，找尋群落成員在不同生境下共同出現（Co-occurrence）或彼此排斥（Co-exclusion）的相互作用模式，從而推斷不同微生物類群之間可能的「協作」或「競爭」關系。

八、基於微生物成員之間網路推斷分析的延伸和發展

發展延伸的領域： 腸道元基因組學 領域的一系列研究又在此概念的基礎上更進一步，發展出了

「豐度共變化的基因類群」（Co-abundance genegroups，CAGs）

「元基因組學物種」（Metagenomic species，MGS）

……等新名詞，對於闡釋元基畢鄭因組學的復雜數據提供了全新的思路和辦法。

② 微生物多樣研究—β多樣性分析

一、β-多樣性分析

1. 樣品間距離計算

樣品間的物種豐度分布模辯迅差異程度可通過統計學中的距離進行量化分析，使用統計演算法Euclidean，Bray-Curtis，Unweighted_unifrac，weighted_unifrac等，計算兩兩樣品間距離，獲得距離矩陣，可用於後續進一步的beta多樣性分析和可視化統計分析。 ​

例如：將距離矩陣使用熱圖表示可直觀觀察樣品間的差異高低分布。

2. PCA 分析

主成分分析(PCA，PrincipalComponent Analysis)，是一種應用方差分解，對多維數據進行降維，從而提取出數據中最主要的元素和結構的方法。  

應用PCA分析，能夠提取出最大程度反映樣品間差異的兩個坐標軸，從而將多維數據的差異反映在二維坐標圖上，灶搏進而揭示復雜數據背景下的簡單規律。  

如果樣品的群落組成越相似，則它們在PCA圖中的距離越接近。

3.  PCoA分析

主坐標分析（PCoA，PrincipalCo-ordinates Analysis），是一種與PCA類似的降維排序方法，通過一系列的特徵值和特徵向量排序從多維數據中提取出最主要的元素和結構。  

可以基於bray_curtis、WeightedUnifrac距離和UnweightedUnifrac距離分別來進行PCoA分析，並選取貢獻率最大的主坐標組合進行作圖展示。  

如果樣品距離越接近，表示物種組成結構越相似，因此群落結構相似度高的樣品傾向於聚集在一起，群落差異很大的樣品則會遠遠分開。

※   當PCA或PCoA分析的前兩個成分（解釋度）較小（如pc1與pc2之和小於50%）時，可嘗試將前三個成分用於對假設因素進行驗證，並作三維圖來反應樣品間群落組成的關系。

4.  NMDS分析

非度量多維尺度分析（NMDS分析）是一種將多維空間的研究對象（樣品或變數）簡化到低維空間進行定位、分析和歸類，同時又保留對象間原始關系的數據分析方法。 

適用於無法獲得研究對象間精確的相似性或相異性數據，僅能得到他們之間等級關系數據的情形。

基本特徵是將對象間的相似性或相異性數據看成點間距離的單調函數，在保持原始數據次序關系的基礎上，用新的相同次序的數據列替換原始數據進行度量型多維尺度分析。換句話說，當資料不適合直接進行變數型多維尺度分析時，對其進行變數變換，再採用變數型多維尺度分析，對原始資料而言，就稱之為非度量型多維尺度分析。

特點是根據樣品中包含的物種信息，以點的形式反映在多維空間上，而對不同樣品間的差異程度，則是通過點與點間的距離體現的，最終獲得樣品的空間定位點圖。

5. 多樣品相似度樹狀圖

利用樹枝結構描述和比較多個樣品間的相似性和差異關系。 

首先使用描述群落組成關系和結構的演算法計算樣品間的距離，即根據beta多樣性距離矩陣進行層次聚類（Hierarchicalcluatering）分析，使用非加權組平均法UPGMA（Unweightedpair group method with arithmetic mean）演算法構建樹狀結構，得到樹狀關系形式用於可視化分析。

6.  PLS-DA分析

PLS-DA（PartialLeast Squares Discriminant Analysis）分析是以偏最小二乘回歸模型為基礎，作為一種有監督的模式識別方法，根據給定的樣品分布/分組信息，對群落結構數據進行判別分析。 

PLS-DA通過尋找物種豐度矩陣和給定的樣品分布/分組信息的最大協方差，從而在新的低維坐標系中對樣品重新排序。

PLS-DA可以減少變數間多重共線性產生的影響，因此，比較適合用於微生物群落數據的研究。

分析時，會計算每個物種的VIP（Variableimportance in projection）系數（VIP值需>1，值越大，說明該物種對於組間差異的貢獻越大）

7.組合（變換）分析圖

特點： 

集多種分析結果於一身組合成圖，即一整圖表解釋多種生物學意義。 

展現形式、分析名稱發生變化並進行重新調整，但所表述的生物學意義未變化旦此。 

具有一定的觀賞性。

  分析形式多種多樣，但萬變不離其宗。

例如：樣本聚類樹與柱狀圖組合分析

③ 腸道菌群檢測是什麼如何檢測

腸道菌群檢測是通過對人體糞便的提取物檢測腸道菌群狀況，比例是否正常，存在哪些問題和風險。對於前述適應症疑似患者，治療前均需進行腸道菌群進行多項常規生物指標檢測，以初步判斷患者腸道菌群狀況。

在進行此基礎上，進一步對疑似患者進行腸道菌群基因檢測，並對結果進行詳盡解讀，以便給患者菌群移植治療制定個性化精準菌群移植治療方案。

④ 醫院怎麼檢查腸道菌群

腸道菌群有兩種檢查方法。(一)菌群檢查為主要檢查方法，有定性分析和定量分析兩種。(1)定性分析，與一般微生物檢查方法相同，定性分析後，要進一步做定量檢查。(2)定量檢查，手續麻煩，一般實驗室很少採用。(二)結腸鏡檢查：有散在的糜爛性潰瘍及出血，有時可能會見黃色假膜附著。如果症狀嚴重者建議去醫院診斷及治療。
腸道內種類繁多的細菌之間相互作用以維持腸道正常菌群的穩定性。腸道中需氧菌和兼性厭氧菌消耗氧氣，有利於專性厭氧菌生長。專性厭氧菌過度繁殖反過來抑制需氧菌生長，進一步抑制厭氧菌自身繁殖。這些細菌還通過各種代謝產物互相影響，起到自身調節作用。有些學者將胃腸道菌群分為原籍菌（或稱常住菌群或固定菌群）和外籍菌（或稱過路菌群或游動菌群），正常菌群是以原籍菌為優勢菌群，外籍菌參與組成，外籍菌在人體中數量少而且不穩定。當腸道內一些原籍菌由於失去制約而過度生長叫腸道菌群失調。

⑤ 研究腸道微生物有哪些方法與技術

研究腸道微生物有哪些方法與技術
腸道微生態系統是哺乳動物健康與疾病的重要基礎,在生理、病理、預防、治療中都具有重要的地位和作用[1]。對於哺乳動物,腸道微生物的營養作用非常重要,如合成維生素、消化碳水化合物、氨的利用、脂的利用以及合成酶類[2]。在食物相對缺乏時,腸道多形類桿菌對糖苷水解酶的分泌會增多,提高腸道微生物群系利用食物的能力[3]。可見,腸道微生態系統能根據食物的特點做出改變,以其功能的多樣性和較大的適應性來應對外界環境的變化。人體腸道微生物群基因的多態性還為宿主提供了許多人體自身所不具備的酶與生化途徑,從而使得人體不易消化的食物殘渣及上皮細胞分泌的內生粘液被發酵利用[4]。為探尋腸道微生物在機體的營養與健康以及疾病與治療機制中的作用,越來越多的科研工作者開始關注對腸道微生物的研究[5,6]。悉生生物學、厭氧培養技術、電鏡技術、細胞分子生物學、基因組學、代謝組學及蛋白質組學等現代科學技術的發展對腸道微生態的研究起到了積極的推動作用[7,8]。在Biolog等研究方法中,需先將腸道中的微生物提取出來,所得到的菌懸液,既保證活體微生物的種類和數量,又去除可能會干擾研究結果的雜質[9]。

⑥ 微生物多樣性alpha分析看不明白看這里！

在微生物多樣性分析的報告中主要包括五個部分：Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析、物種組成分析、進化關系分析、差異分析，其中Alpha多樣性分析是生態學中生物多樣性的一個重要的組成部分，也是比較基礎的一部分。

Alpha多樣性是指一個特定區域或生態系統內的多樣性，是反映豐富度和均勻度的綜合指標。Alpha多樣性主要與兩個因素有關：一是種類數目，即豐富度；二是多樣性，群落中個體分配上的均勻性。群落豐富度（Community richness）的指數主要包括Chao1指數和ACE指數。群落多樣性（Community diversity）的指數，包括Shannon指數和Simpson指數。另外，還有測序深度指數Observed spieces 代表乎旦OTUs的直觀數量統計, Good』s coverage 指計算加入豐度為1 的OTUs數目，加入低豐度影響。

Alpha多樣性各指數的意義

Chao1： 是用chao1 演算法估計群落中含OTU 數目的指數，chao1 在生態學中常用來估計物種總數，由Chao (1984) 最早提出。Chao1值越大代表物種總數越多。Schao1=Sobs+n1(n1-1)/2(n2+1)，其中Schao1為估計的OTU數，Sobs為觀測到的OTU數，n1為只有一條序列的OTU數目，n2為只有兩條序列的OTU數目。Chao1指數越大，表明群落的豐富度越高。

Ace： 是用來估計群落中含有OTU 數目的指數，同樣由Chao提出(Chao and Yang, 1993)，是生態學中估友頃慶計物種總數的常用指數之一。默認將序列量10以下的OTU都計算在內，從而估計群落中實際存在的物種數。ACE指數越大，表明群落的豐富度越高。

Shannon： （Shannon, 1948a, b）綜合考慮了群落的豐富度和均勻度。Shannon指數值越高，表明群落的多樣性越高。

Simpson： 用來估算樣好握品中微生物的多樣性指數之一，由Edward Hugh Simpson ( 1949) 提出，在生態學中常用來定量的描述一個區域的生物多樣性。Simpson 指數值越大，說明群落多樣性越低。辛普森多樣性指數=1-隨機取樣的兩個個體屬於不同種的概率。

alpha多樣性指數具體描述如下：

計算菌群豐度（Community richness）的指數有:

Chao  - the Chao1 estimator ( http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/generated/skbio.diversity.alpha.chao1.html#skbio.diversity.alpha.chao1 );

ACE  - the ACE estimator ( http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/generated/skbio.diversity.alpha.ace.html#skbio.diversity.alpha.ace );

計算菌群多樣性（Community diversity）的指數有:

Shannon  - the Shannon index ( http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/generated/skbio.diversity.alpha.shannon.html#skbio.diversity.alpha.shannon );

Simpson  - the Simpson index ( http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/generated/skbio.diversity.alpha.simpson.html#skbio.diversity.alpha.simpson );

測序深度指數有:

Coverage - the Good』s coverage ( http://scikit-bio.org/docs/latest/generated/generated/skbio.diversity.alpha.goods_coverage.html#skbio.diversity.alpha.goods_coverage )

alpha多樣性與豐度展示稀釋曲線

微生物多樣性分析中需要驗證測序數據量是否足以反映樣品中的物種多樣性，稀釋曲線（豐富度曲線）可以用來檢驗這一指標，並間接反映樣品中物種的豐富程度。具體方法為:利用已測得16S rDNA序列中已知的各種OTU的相對比例，來計算抽取n個（n小於測得reads序列總數）reads時出現OTU數量的期望值，然後根據一組n值（一般為一組小於總序列數的等差數列）與其相對應的OTU數量的期望值做出曲線來。當曲線趨於平緩或者達到平台期時也就可以認為測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種；反之，則表示樣品中物種多樣性較高，還存在較多未被測序檢測到的物種。

註：橫坐標代表隨機抽取的序列數量；縱坐標代表觀測到的OTU數量。樣本曲線的延伸終點的橫坐標位置為該樣本的測序數量，如果曲線趨於平坦表明測序已趨於飽和，增加測序數據無法再找到更多的OTU；反之表明不飽和，增加數據量可以發現更多OTU。Shannon-Winner曲線

Shannon-Wiener 曲線，是利用shannon指數來進行繪制的，反映樣品中微生物多樣性的指數，利用各樣品的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數構建曲線，以此反映各樣本在不同測序數量時的微生物多樣性。 當曲線趨向平坦時，說明測序數據量足夠大，可以反映樣品中絕大多數的微生物物種信息。樣本曲線的延伸終點的橫坐標位置為該樣本的測序數量，如果曲線趨於平坦表明測序已趨於飽和，增加測序數據無法再找到更多的OTU；反之表明不飽和，增加數據量可以發現更多OTU。其中曲線的最高點也就是該樣本的Shannon指數，指數越高表明樣品的物種多樣性越高。

註：與上圖一樣，橫坐標代表隨機抽取的序列數量；縱坐標代表的是反映物種多樣性的Shannon指數。Rank-Abundance曲線

Rank-Abundance曲線用於同時解釋樣品多樣性的兩個方面，即樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長度來反映，曲線越寬，表示物種的組成越豐富；物種組成的均勻程度由曲線的形狀來反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高。

註：橫坐標代表物種排序的數量；縱坐標代表觀測到的相對豐度。樣本曲線的延伸終點的橫坐標位置為該樣本的物種數量，如果曲線越平滑下降表明樣本的物種多樣性越高，而曲線快速陡然下降表明樣本中的優勢菌群所佔比例很高，多樣性較低。

這部分內容就講到這里，後期我們會介紹微生物多樣性beta多樣性分析，研究微生物的同學請保持關注哦。

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參考文獻

[1] Shannon, C.E. (1948a). A mathematical theory of communication. The Bell System Technical Journal 27, 379-423.

[2] Shannon, C.E. (1948b). A mathematical theory of communication. The Bell System Technical Journal 27, 623-656.

[3] Simpson, E.H. (1949). Measurement of Diversity. Nature 163, 688.

[4] Chao, A., and Yang, M.C.K. (1993). Stopping rules and estimation for recapture debugging with unequal failure rates. Biometrika 80, 193-201.

[5] Chao, A. (1984). Nonparametric Estimation of the Number of Classes in a Population. Scandinavian Journal of Statistics 11, 265-270.

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⑦ 怎麼分析微生物群落結構和多樣性

微生物群落的種群多樣性一直是微生物生態學和環境學科研究的重點。近幾年來，微生物群落結構成為研究的熱點。首先，群落結構決定了生態功能的特性和強弱。其次，群落結構的高穩定性是實現生態功能的重要因素。再次，群落結構變化是標記環境變化的重要方面。因此，通過對目標環境微生物群落的種群結構和多樣性進行解析並研究其動態變化，可以為優化群落結構、調節群落功能和發現新的重要微生物功能類群提供可靠的依據。
從年代上來看，微生物群落結構和多樣性解析技術的發展可以分為三個階段。20世紀70年代以前主要依賴傳統的培養分離方法，依靠形態學、培養特徵、生理生化特性的比較進行分類鑒定和計數，對環境微生物群落結構及多樣性的認識是不全面和有選擇性的，方法的分辨水平低。在70和80年代，研究人員通過對微生物化學成分的分析總結出了一些規律性的結論，從而建立了一些微生物分類和定量的方法即生物標記物方法，對環境微生物群落結構及多樣性的認識進入到較客觀的層次上。在80和90年代，現代分子生物學技術以DNA為目標物，通過rRNA基因測序技術和基因指紋圖譜等方法，比較精確地揭示了微生物種類和遺傳的多樣性，並給出了關於群落結構的直觀信息。
1 傳統培養分離方法
傳統培養分離方法是最早的認識微生物群落結構和多樣性的方法，自1880年發明以來一直到
現在仍被廣泛使用。傳統培養分離方法是將定量樣品接種於培養基中，在一定的溫度下培養一定的時間，然後對生長的菌落計數和計算含量，並通過在顯微鏡下觀察其形態構造，結合培養分離過程生理生化特性的觀察鑒定種屬分類特性。培養分離方法採用配比簡單的營養基質和固定的培養溫度，還忽略了氣候變化和生物相互作用的影響，這種人工環境與原生境的偏差使得可培養的種類大大減少(僅占環境微生物總數的0.1%～10%[1])。而且，此方法繁瑣耗時，不能用於監測種群結構的動態變化。
2 群落水平生理學指紋方法(CLPP)
通常認為微生物所含的酶與其豐度或活性是密切相關的。酶分子對於所催化的生化反應特異性很高，不同的酶參與不同的生化反應。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基質，則這種酶-底物可作為此群落的生物標記分子之一，標記了某種群的存在。由Garlan和Mills[2]於1991年提出的群落水平生理學指紋方法(CLPP)是通過檢測微生物樣品對底物利用模式來反映種群組成的酶活性分析方法。具體而言，CLPP分析方法就是通過檢測微生物樣品對多種不同的單一碳源基質的利用能力，來確定那些基質可以作為能源，從而產生對基質利用的生理代謝指紋。由BIOLOG公司開發的BIOLOG氧化還原技術，使得CLPP方法快速方便。商業供應的BIOLOG微平板分兩種：GN和MT，二者都含有96個微井，每一
128 生態環境 第14卷第1期（2005年1月）

微井平板的干膜上都含有培養基和氧化還原染料四唑[3]。其中，BIOLOG的GN微平板含有95種不同碳源和一個無碳源的對照井，而MT微平板只含有培養基和氧化還原染料，允許自由地檢測不同的碳源基質[3]。檢測的方法是：將處理的微生物樣品加入每一個微井中，在一定的溫度下溫育一定的時間(一般為12 h)，在溫育過程中，氧化還原染料被呼吸路徑產生的NADH還原，顏色變化的速率取決於呼吸速率，最終檢測一定波長下的吸光率進行能源碳的利用種類及其利用程度的分析[4]。
BIOLOG方法能夠有效地評價土壤和其它環境區系的微生物群落結構[3~6]。其優點是操作相對簡單快速，而且少數碳源即能區別碳素利用模式的差別[5]。然而，BIOLOG體系僅能鑒定快速生長的微生物，而且，測試盤內近中性的緩沖體系、高濃度的碳源及有生物毒性的指示劑紅四氮唑(TTC)使得測試結果的誤差進一步增大。姚槐應[5]的研究表明，應根據測試對象的特點（例如pH，碳源利用類型及利用能力）改進BIOLOG體系，並且，有必要研究更好的指示劑來取代TTC。
3 生物標記物方法
生物標記物(Biomakers)通常是微生物細胞的生化組成成分，其總量通常與相應生物量呈正相關。由於特定結構的標記物標志著特定類型的微生物，因此一些生物標記物的組成模式(種類、數量和相對比例)可作為指紋估價微生物群落結構。由於分類的依據是從混合微生物群落中提取的生化組成成分，潛在地包括所有的物種，因而具有一定的客觀性。並且分析簡便快速，適於定性甚至半定量地檢測微生物體系的動態變化。20世紀80年代以來常用於研究微生物群落結構的生物標記物方法包括：醌指紋法(Quinones Profiling)、脂肪酸譜圖法(PLFAs和WCFA-FAMEs)。測定時，首先使用合適的提取劑提取環境微生物樣品中的這些化合物並加以純化，然後用合適的溶劑製成合適的樣品用GC或LC檢測，最後用統計方法對得到的生物標記物譜圖進行定性定量分析。
3.1 醌指紋法(Quinones Profiling)
呼吸醌廣泛存在於微生物的細胞膜中，是細胞膜的組成成分，在電子傳遞鏈中起重要作用[7]。醌的含量與土壤和活性污泥的生物量呈良好的線性關系的研究表明，醌含量可用作微生物量的標記[8]。有兩類主要的呼吸醌：泛醌(ubiquinone, UQ)即輔酶Q和甲基萘醌(menaquinone,MK)即維生素K[9]。醌可以按分子結構在類(UQ和MK)的基礎上依據側鏈含異戊二烯單元的數目和側鏈上使雙鍵飽和的
氫原子數進一步區分。研究表明，每一種微生物都含有一種占優勢的醌[7]，而且，不同的微生物含有不同種類和分子結構的醌[9]。因此，醌的多樣性可定量表徵微生物的多樣性，醌譜圖（即醌指紋）的變化可表徵群落結構的變化。
用醌指紋法描述微生物群落的參數[7]有：(1)醌的類型和不同類型的醌的數目；(2)占優勢的醌及其摩爾分數含量；(3)總的泛醌和總的甲基萘醌的摩爾分數之比；(4)醌的多樣性和均勻性；(5)醌的總量等。對兩個不同的群落，由上述分析所得數據可以計算出另一個參數____非相似性指數(D)，用於定量比較兩個群落結構的差異。
醌指紋法具有簡單快速的特點，近幾年來廣泛用於各種環境微生物樣品(如土壤，活性污泥和其它水生環境群落)的分析。
考察了醌指紋法分析活性污泥群落的分析精度，證明此方法是一種可靠的分析方法。然而，醌指紋法也存在一定的局限性，它不能反映具體哪個屬或哪個種的變化。 3.2 脂肪酸譜圖法(PLFAs、WCFA-FAMEs和其它方法)
從微生物細胞提取的脂肪類生化組分是重要的生物量標記物，例如，極脂(磷脂)、中性脂類(甘油二酯)可分別作為活性和非活性生物量的標記物[10]。更重要的是，提取脂類的分解產物____具有不同分子結構的混合的長鏈脂肪酸，隱含了微生物的類型信息，其組成模式可作為種群組成的標記。多種脂肪酸譜圖法廣泛用於土壤、堆肥和水環境微生物群落結構的分型和動態監測[11~13]。
常用的脂肪酸譜圖法可分為兩種：磷脂脂肪酸(PLFAs)譜圖法和全細胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)譜圖法[14]。二者分析的對象實質上都是脂肪酸甲酯，不同之處在於提取脂肪酸的來源不同。磷脂脂肪酸(PLFAs)譜圖法提取的脂肪酸主要來源於微生物細胞膜磷脂即來源於活細胞，全細胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)譜圖法提取的脂肪酸來源於環境微生物樣品中的所有可甲基化的脂類即來源於所有的細胞（包括活細胞和死細胞）。因此，磷脂脂肪酸(PLFAs)譜圖法的優點在於准確，可靠；全細胞脂肪酸甲酯(WCFA-FAMEs)譜圖法的優點在於提取簡捷，所需樣品量少。對多個環境微生物樣品分析而言，先用WCFA-FAMEs譜圖法預先篩選再用PLFAs法進行分析是提高效率的較佳選擇。
脂肪酸譜圖分析包括兩種形式：一種是脂肪酸，採用GC分析儀達到分離不同結構的分子的目的；另一種是脂肪酸甲基化產物____脂肪酸甲酯，採用GC-MS分析儀進行不同分子的分離和鑒定。

⑧ 微生物多樣性qiime2分析流程(9) 數據可視化分析(中）之繪制相關性熱圖

前面介紹了微生物多樣性如何整合數據並進行了基礎可視化分析，現在讓我們開始進行更加深入的相關性分析和差異分析（相關性熱圖，RDA，CCA，Lefse）

一般我們主要繪制屬水平物種與理化因子的相關性熱圖

依然信譽使用我們轉化為 phyloseq 的對象的數據集，首先讓我們導出屬水平物種組成表：

導出數據之後我們要對屬水平物種組成表進行過濾，把豐度佔比低於1%的歸入others類
讓行坦鏈我們自定義一個函數對其進行過濾

經過上面的步驟我們完成了對數據的過濾，接下來讓我們用屬水平的物種組成表結合理化因子數據繪制檔孫相關性熱圖：

經過上面兩步我們完成了相關性熱圖的分析及可視化，接下來進行RDA，CCA的分析

⑨ 微生物多樣研究—β多樣性分析概述

一、β-多樣性分析介紹

1.  β（Beta）Diversity：

是對不同樣品/不同組間樣品的微生物群落構成進行比較分析。

β多樣性分析前的數據「來源」：

    1）OTUs的豐度信息表；

    2）OTUs之間的系統發生關系，

    計算UnweightedUnifrac及Weighted Unifrac距離。

通過多變數統計學方法主成分分析(PCA， Principal Component Analysis)，主坐標分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)，非加權組平均聚類分析(UPGMA，Unweighted Pair-group Method withArithmetic Means)等分析方法，從中發現不同樣品（組）間的差異。

2. PCA & PCoA分析

主成分分析（PCA）是多變數統計學中最為人熟知的分析方法，它通過線性變換，將原始的高維數據投影至少量新合成的變數（即主成分），從而簡化數據結構，展現樣品的自然分布。

主成分分析不考慮原始變數之間可能存在的相互關系，並且是基於歐式距離評價樣品之間的相似度。

多維尺度分析與主成分分析類似，但是它可以採用任何距離評價樣品之間的相似度。主坐標分析（Principalcoordinates analysis，PCoA）是經典的多維尺度分析方法。

3.  UniFrac距離

由於微生物極其多樣，不同微生物彼此之間的系統發育關系往往千差萬別，僅僅將群落中不同微生物成員視為相互獨立的變數顯然並不合理。  

因此，在比較不同群落樣品之間的差異時，需要考慮兩個群落成員之間的系統發育關系是否相似。 

基於這個思想，計算微生物群落樣品間距離的UniFrac距離應運而生，通過比較兩個群落各自獨有的微生物成員之間系統發育關系的遠近，更為客觀地反映兩個群落樣品之間的相似程度

UniFrac距離有：

1）非加權（Unweighted）

僅僅考慮微生物成員在群落中存在與否，而不考慮其豐度高低。

2）加權（Weighted）

兼顧群落成員之間的系統發育關系以及它們在各自群落中的豐度高低。

兩種距離演算法側重於不同的群落結構特徵：究竟是由於群落成員的截然不同導致樣品的差異，還是由於同一組成員在不同樣品中豐度梯度的改變導致樣品的差異。 

由於主坐標分析是以「無監督」的方式降維分解樣品距離矩陣，因此，合理運用非加權和加權兩種UniFrac距離，可以較全面地揭示微生物群落數據背後隱含的生態學意義（即UniFrac PCoA分析）。

4.  聚類分析

聚類分析：通過等級樹的形式展示樣品間的差異大小。

※ 與多維尺度分析相同，聚類分析可以採用任何距離評價樣品之間的相似度。

常用的聚類分析方法包括：

1)非加權組平均法（Unweightedpair-group method with arithmetic means，UPGMA） 

2)單一連接法（Single-linkageclustering）

3)完全連接法（Complete-linkageclustering）

4)……等。

⑩ 怎樣才能改善人體腸道微生物群落多樣性

人體腸道中龐大而復雜的微生物群落對人體自身代謝表型有深遠的影響。腸道微生物群落在亞種或菌株水平上表現出極大的多樣性。利用微生物分子生態學、元基因組學和代謝組學研究方法,發現腸道微生物與宿主表現出共進化的特點,腸道微生物群落及其基因組為宿主提供了互補的遺傳和代謝功能,表現出互惠共生關系。但孝余轎是,腸道微生物群落中影毀敗響宿主代謝表型的關鍵功能菌鑒定及其作用模式問題仍然懸而巧肆未決,綜合運用多種高通量研究方法和多維數據分析方法可能成為解決這個問題的突破口。