最新研究基因分型的方法

Ⅰ sbt做hla基因分型分析怎麼做

sbt做hla基因分型分析怎麼做
HLA系統研究從70年代到80年代末期主要是血清學研團灶究；90年代以來，HLA進入了分子水平研究階段。HLA分型技術同樣走過了這一歷程。建立於60年代的塌戚扮血清學及細胞學分型技術主要側重於分析HLA產物特異仔閉性。1991年第11屆國際HLA專題討論上提出了HLA的DNA分型方法，隨著測序技術的突飛猛進，基於DNA序列的分型方法已經取代了傳統的血清學及細胞學分型方法。現DNA分型方法主要分為兩種：基於核酸序列識別的方法和基於序列分子構型的方法。基於核酸序列識別的方法主要有：PCR-RFLP,PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT。其中PCR-SBT測序方法是現世界衛生組織（WHO）推薦的HLA分型方法的「金標准」。

Ⅱ 什麼叫基因分型，基因分型的方法有哪些

基因分型（Genotyping）是利用生物學檢測方法測定個體基因型（Genotype）的技術。又稱為基因型分析（Genotypic assay），使用技術包括聚合酶鏈反應（PCR）、DNA片段分析、寡核苷酸探針（ASO probes）、基因測序、核酸雜交、基因晶元技術等。

方法：
一些常用的基因分型技術有：限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）、末端限制性長度多態性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism, t-RFLP）、擴增片段長度多態性（Amplified fragment length polymorphisms, AFLP）、多重連接探針擴增（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA）等。

臨床應用：
DNA片段分析能夠診斷疾病導致的遺傳變異，如微衛星序列不穩定（Microsatellite Instability, MSI）、三體型（Trisomy）、非整倍體（Aneuploidy）、雜合性缺失（loss of heterozygosity, LOH）等。微衛星序列不穩定和雜合性缺失與結腸癌、乳腺癌、子宮頸癌的腫瘤細胞基因型有關。第21號染色體的三體型是種常見的非整倍體，臨床表現為先天愚型（Down Syndrome）。

Ⅲ 基因分型就是把相同的分在一起嗎

基因分型（genotyping），或稱為基因型分析在群體遺傳學（如不同人種的特徵）和法醫學（如親子鑒定）方面有廣泛的應用，早期利用Southernblots進行基因分析，但是這種方法耗時長，操作繁瑣，讓許多研究人員償盡了苦頭。隨著定量PCR的出現，相關技術的革新，PCR已使這些基因組學和轉錄組學發生了翻天覆地的變化，甚至隨著免疫PCR的普及開始進軍蛋白組學。相關技術要點1．實驗設計必需保證野生型的被限制性內切酶切開。因為對於只有少量突變型的SNP位點，如果突變型被切開，那麼所得到的實驗結果就是大量沒有被酶切開的PCR產物，而這個結果與酶切實驗失敗的結果非常類似，不易區分，對結果的判讀造成很大的麻煩，因此保證了主頻鹼基被解開，從根本上保證了實驗的可靠性。2．偏向性擴增的解決。所謂偏向性擴增是因為SNP位點上會往往存在嘌吟和嘧啶的替換，在PCR過程中，聚合反應對嘧啶(C或T)比較敏感，使得嘌吟(A或T)的擴增非常少，而出現偏向性擴增，這在SNP位點附近嘌吟含量較高時特別明顯。為此，本公司專門設計一個方案，用以克服偏向性擴增。3．方案設計中的內切酶的選擇雖然從理論上，我們的方案可以進行任意位點改造，但事實上在改造過程中會出現一系列的問題，包括擴增效率，鹼基劃移等一系列問題，使得改造方案失敗。對此，我們公司專業開發了一個引物設計軟體，通過運算獲得最佳的改造方案，同時通過在正向和反向序列上同時設計方案，以保證試驗的成功。

Ⅳ 人類白細胞抗原（HLA）基因分型

主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC），又稱主要組織相容性復合基因，是存在於大部分脊椎動物基因組中的一個基因家族，與免疫系統密切相關。MHC有兩個類型，第一類MHC（I型）處理細胞內部被分解後的蛋白質（例如病毒的），其分布最廣，存在於體內所有有核細胞表面。而第二類MHC（II型）主要在某些免疫細胞表面表達，其功能在於當外部入侵者經過胞吞並利用溶酶體處理後形成碎片，MHC與這些碎片結合，並呈現在細胞表面上供T細胞所辨識（呈遞抗原）。

其中人類的MHC糖蛋白，又稱為人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，簡稱 HLA ），與人類的免疫系統功能密切相關。其位於6號染色體的短臂上（6p21.31），包括一系列緊密連鎖的基因座，部分基因編碼細胞表面抗原，成為每個人的細胞不可混淆的「特徵」，是免疫系統區分自身和異體物質的基礎。HLA基尺散因高度多態化，存在許多不同的等位基因，因此能夠細致調控後天免疫系統。此外，在進行移植手術時人類白細胞抗原決定組織相容性。捐獻者和接受者的人類白細胞抗原越相似，排異反應就越小。只有同卵雙胞胎的人類白細胞抗原是完全一樣的。

HLA根據不同的基因位點分為三大類型：I型，II型和III型

基於HLA基因座的高度多態性，且由於目前有眾多的研究在深入了解HLA類型和疾病之間的關系，因此HLA分型在免疫學分析中是不可或缺的。在了解HLA基因分型之前讓我們先看看HLA等位基因的命名方式。

HLA等位基因命名方法

HLA基因分型
HLA分好姿型的方法主要有血清分型和DNA分型

隨著二代測序技術的發展，對高通量測序數據的挖掘顯得越來越重要，如何從海量的測序數據中識別出HLA序列從而對其進行分型呢？近年來有許多研究者開發了基於二代測序數據的HLA基因分型方法，這些方法各有各的優勢以及側重點。

基於全外顯子組測序（WES）或全基因組測序（WGS）的HLA分型演算法及工具

基於轉錄組測序（RNA-seq）的HLA分型演算法及工具

以及其他一些工具還待收集 ^ _ ^，下次再講講如友困絕何具體使用這些工具

Ⅳ HLA分型技術的研究

縱觀HLA系統的研究過程，其發展無不與技術的手段的突破與運用有密切關系。70年代到80年代末期主要是血清學研究；90年代以來，HLA進入了分子水平研究階段，進展尤為顯著。HLA分型技術同樣走過了這一歷程。建立於60年代並不斷完善的血清學及細胞學分型技術主要側重於分析HLA產物特異性。
血清學分型藉助的是微量淋巴細胞毒試驗（microlymphocytotoxicitytest）或稱補體依賴的細胞毒試驗（complement dependent cytotoxicity test，CDC）。取已知HLA抗血清加入待測外周血淋巴細胞，作用後加入兔補體，充分作用後加入染料，，著染的細胞為死亡細胞，依據特異性抗體介導的補體系統對靶細胞溶解的原理，待檢淋巴細胞表面具有已知抗血清所針對的抗原。血清學分型存在諸多缺點：①標准分型抗體親和力較弱、效價較低、易產生交叉反應，②缺少某些單價抗血清；③某些病理過程可能導致外周血淋巴細胞表面抗原性質發生改變．干擾抗原—抗體反應；④國內供HLA—I類抗原分型的血清板來源困難、質量欠佳。上述因素均嚴重影響了HLA分型結果的可靠性及該技術的推廣應用。
細胞學分型技術指的是通過純合分型細胞（homozygote typing cell,HTC）及預致敏淋巴細胞試驗（primed lymphocyte test,PLT）對HLA分型。二種方法的基本原理均是判斷淋巴細胞在識別非己HLA抗原決定簇後發生的增殖反應。由於分型細胞來源困難以及操作手續繁瑣，細胞學分型技術下正逐漸淘汰。
1991年第11屆國際HLA專題討論上提出了HLA的DNA分型方法，這類方法近年來在研究和應用方面發展非常快，有取代其他方法的趨勢。DNA分型方法主要分為兩種：基於核酸序列識別的方法和基於序列分子構型的搭野方法。下面簡要的闡述各方法的原理和優缺點。
基於核酸序列識別的方法主要有：PCR-RFLP,PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT。
PCR-RFLP：其原理是將目的基因片段PCR擴增後，利用多種限制性內切酶對擴增產物進行酶切，不同的基因序列會產生不同的酶切產物，從而產生不同的電泳圖譜。它以其簡單、敏感、准確，無需同位素等優點成為目前較常用的HLA基因分型技術之一，但是無法分辨雜合子，且只能區知仔喊分有限的多態性。
PCR-SSO（sequence specific oligonucleotide）：也稱PCR-ASO（allele specific oligonuceotide）。用以同位素或非放射性標記的探針與PCR擴增的目標片斷產物雜交，根據陽性斑點判斷個體基因型。由於HLA等位基因非常多，就需要很多的探針對每個DNA樣品要進行多次雜交（甚至十幾次）才能完成定型分析操作也十分繁瑣。於是在此基礎上又發展起來一種反向雜交法（reverse hybridization）。將各種不同的探針固定於同一張膜上，再將PCR產物標記，以PCR產物（待檢測基因DNA）反過來與探針雜交。這樣一次雜交即可完成多個等位基因分析。此方法具有靈敏度、特異性強、需樣本量少等優點，但不同探針的雜交條件的須嚴格統一（如溫度，離子戚差強度）, 易出現誤差;不能檢測新等位基因，試劑盒需不斷升級; 對某些雜合子解析度也不好;。很多HLA基因型含有相同的多態性，而僅僅由於排列方式不同，因此解析度不及SSP和SBT（4.01#113）。此方法適宜大量和高純度樣本，雜交條帶將作為書面原始記錄長期保存（三種效果比較）。
PCR-SSP：上述的PCR/RFLP、PCR/SSO等，最終均需用標記的特性探針與擴增產物進行雜交，再分析結果。PCR/SSP方法用乃設計出一整套等位基因組特異性引物（sequence specific primer,SSP），藉助PCR技術獲得HLA型別特異的擴增產物，可通過電泳直接分析帶型決定HLA型別，從而大大簡化了實驗步驟。優點是簡單易行, 解析度可從低到高, 成本低 。缺點是不易自動化;不能檢測新的等位基因，試劑盒需不斷升級。此方法適宜零散和純度低樣本，重復實驗時要重提DNA和必須使用紫外凝膠成象儀保留原始資料，增加實驗成本（三種效果比較）。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量試劑（引物）,且不能識別非經典的HLA基因和假基因（綠）。針對HLA外顯子和內含子序列精心設計引物可避免這些問題。
PCR-SBT: 以PCR擴增所要分析的基因片斷，然後對DNA序列進行分析，可以直接得到基因型。解析度高，可大規模進行，精確度高，能直接發現新的等位基因。但是由於雜合子的存在，無法分辨單元型。
以上各個方法都存在無法克服的缺陷，如能配合使用，則能大大提高分型能力。國外有學者對60個樣本進行研究，發現單用SBT，只有18%的樣本能將A，B位點同時分型成功，如結合SSO，則能將所有樣本成功分型。
基於核酸序列識別的分型方法始終無法越過雜合子的難關。HSE(Haplotype-specific extention)技術完美地解決了這一問題。它是利用磁珠與其中一條同源染色體的特異位點結合，達到分離同源染色體的目的，雜合子問題不攻自破。因此，HSE無論與SSO還是SBT結合使用，都有極好的效果（1.01#12，4.01#94）。
近年來，測序新技術發展層出不窮，紛紛運用到HLA分型中。如MSNE(multiplex single nucleaotide extention),應用鏈中止法原理，根據等位基因SNP位點設計特異性引物和生物素熒游標記的ddNTP進行分型，有重復性好，可分辨雜合子等優點，已應用到A位點的分型中。（4.01#93）又如pyrosequencing 法分型，解析度好，可分辨雜合子，自動化程度也高。DNA晶元技術，作為一項檢測SNP的成熟技術，也已應用到HLA 分型中.
基於序列分子構型的分型方法在理論上就避開了雜合子這個難題。SSCP(PCR單鏈構象多態性分析，PCR-single strand conformational polymorphism)是最常用的根據構型的分型方法。擴增的目標產物變形後形成單鏈，不同的序列，甚至僅有一個鹼基的差異，就會形成不同的莖環結構，從而電泳速率不同。但此方法僅限於分辨僅限於200－300bp（綠16），且即使是同一單鏈DNA在相同情況下也會形成不同的構型，使得電泳條帶很難分析;也有可能會出現當某些位置的點突變對單鏈DNA分子立體構象的改變不起作用或作用很小的情況,使聚丙烯醯胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢。
HA(異源二聚體電泳多態性，Heteroplex Analysis)是另一種基於序列分子構型的分型方法，根據異源二聚體未配對區域的長度和分布而顯示出電泳條帶不同（綠18）。但與單鏈DNA相比，異源二聚體電泳條帶過於復雜，難以分析。
新發展的RSCA（Reference Strand Mediated Conformation Analysis）技術根據HA的原理，設計了位點特異性熒游標記的參照DNA片段，與樣本DNA分子的正反鏈形成異源二聚體.帶有熒游標記的電泳條帶易於分析，能夠克服HA的不足。
另外，提取基因組模板的技術也在不斷發展。用於分型的DNA來源也已不局限於血液，口腔塗片、唾液中提取的DNA也有相似的效果（7.01#261）。針對微量基因組模板的情況，現已開發出基於滾環復制的全基因組擴增技術，可以將1ng的模板擴大至100ng，足以應付PCR-RFLP、PCR-SBT等分型技術的要求。

Ⅵ 什麼叫基因分型，基因分型的方法有哪些

我說TaqMan-MGB探針合普通PCR

Ⅶ 基因分型DLBCL

    DLBCL根據基因數據做分型的問題。文章前期對574例DLBCL活檢樣本進行多平台基因組分析，確定了ABC和GCB病例中發生頻率顯著不同（P<0.05）的基因。通過一些GCB分型和基因（NOTCH1，NOTCH2，BCL6，SPEN）之間關系的結果，表明基因表達亞群可能有不同遺傳亞型。通過Genclass和隨機森林模型對基因數據做分型。    

     文中給出了分型方法根據MYD88（L265P），CD79B，BCL6，NOTCH2，NOTCH1，EZH2，BCL2基因狀態判斷分型。見圖1。後邊附加了演算法，個人初步看了一下認為是分型模型演算法的過程，碰到這個機會解剖學習一下。

    第一部分，詳細介紹了mutation，Subclonal Mutation,Truncation,Subclonal Truncation,Focal Amplifictions,Focal Homozygous Deletions,Focal Losses納入分析的標准，也是納入分析的數據的指標篩選介紹。篩選最後剩餘五個特徵，a） MYD88L265P突變，b） 非L265P的MYD88突變，c） BCL6融合，d） BCL2易位，e） CD274（PD-L1）或PDCD1LG2（PD-L2）融合。同時刪除了少於四個樣本中發現的特徵，組合特徵要求因突變而包含在特徵中的樣本數量至少與因拷貝數而包含的樣本數相同，而且因拷貝數而包含的樣本至少為4個。

    第二部分 GenClass迭代遺傳子類型演算法，對遺傳演算法不是很懂，下邊看得有點茫然，要多查查資料啊~從初始seed分類開始，並以這樣一種方式進化它，使其與我們特徵集最大化，同時依然保持初始分類所建議的生物學特徵。 

 演算法遵循的要點：

    1.從初始seed開始，2確定與當前分類關聯度最高的功能列表，3基於這些特徵，計算當前分類和所有分類的關聯統計信息與之不同的替代分類法最多隻改變一個樣本，並確定預測得分最高的分類，4a）如果步驟3中確定的最佳分類不是當前分類，則使用最佳分類替代當前分類，返回步驟2,4b)如果步驟3中確定的最佳分類是當前分類，則停止迭代並將其最為最終結果報告。

詳細步驟：

step1初始樣本分類

    1.那些帶有NOTCH1突變的樣本最初被歸類為N1，2.對同時存在MYD88（L265P）突變和CD79B突變的樣本作為MCD，3.有NOTCH2突變或BCL6融合的樣本最初被歸類為BN2,4.有EZH2突變（克隆，亞克隆）或者BCL2易位的樣本最初被歸類為EZB，5.所有其他樣本最初被歸類為其它樣本。 （這邊有些不懂，之前認為第一部分篩選出來的基因是用於分類的，但是這步突然冒出來NOTCH1，CD79B，NOTCH2，EZH2，前後無關聯）

step2識別與當前分類相關的特徵

    給定樣本S和特徵值F，定義S，F之前關聯的意義，通過貝葉斯連續校正的卡方統計量

公式中的N是總樣本數，IS和IF是樣本集S或者具有特徵F的指標，在F樣本集上求和。

分類和特徵之間的關聯等於最大值

根據這些統計數據，與當前分類關聯的特徵列表被定義為滿足下來條件的所有特徵：1.根據目前分類法，至少有一個特徵F患病率10%；2.不存在其他F』與F對應的基因相關。如果有兩個或者更多的特徵與相同基因同是最高的得分，隨機選擇一個。3.如果F是一個拷貝數或者組合特徵，則沒有其他拷貝數或者組合特徵F，使得V（洞鎮F』）>V(F)與F』相關基因和與F相關基因距離在15MB之間，如果15MB之內得分都昌顫衡是最高，則隨機選擇其中一個特徵，其餘被排除。4.V（C，F）>10.85即P<0.001。

step3計算當前分類和替代分類的關聯統計

    每次最多改變一個class label，計算Ω（Ccurrent），通過公式：耐做

    計算最佳得分。對step2中表示的當前分類下的所有特徵取和。如果多個分類是最佳的，則隨機選擇一個。

step4 停止程序或者繼續下一個迭代

    如果最佳值不是當前值，則樣本重新分類。我們使用最佳值作為當前分類，重新step2。如果當前是最佳分類，則停止。理論上來說迭代可能陷入循環不收斂，為了防止擴展了停止條件，一般在以前的任何迭代中best曾經被用作current則停止。

隨機森林模型的建立

        之後又通過隨機森林建立了模型，和GenClass相同，建立4個種子子集和一個其他集合。1.那些帶有NOTCH1突變的樣本最初被歸類為N1，2.對同時存在MYD88（L265P）突變和CD79B突變的樣本作為MCD，3.有NOTCH2突變或BCL6融合的樣本最初被歸類為BN2,4.有EZH2突變（克隆，亞克隆）或者BCL2易位的樣本最初被歸類為EZB，5.所有其他樣本最初被歸類為其它樣本。

兩種分類模型給出的結果重合度比較高

 項目有時限，具體演算法沒有實際操作，所以理解可能不足，不過也算是有一點點認識了。翻譯和理解有問題的地方，歡迎留言~

Ⅷ 基因型分型的方法

基於分子雜交→基於DNA擴增→基於DNA測序

將DNA轉移到硝酸纖維素膜上，利用DNA-DNA雜交檢測特定DNA片段的方法。

通過設計不同的備埋指DNA探針可實現不同等位基因類型的區分。
探針設計是Southern Blot最為重要的環節之一。

又稱DNA chip/DNA微矩陣（DNA microarray）
將一系列已知序列的DNA探針分子以高密度固定於支持物上，通過與標記的DNA樣品分子進行雜交實現仿配DNA的序列分析。

優點：高通量、大規模、平行液塌化、集約化。
缺點：非特異性高。

以上內容參考中國大學MOOC網站復旦大學遺傳學。