致突變的研究方法

❶ 埃姆斯實驗的介紹

Ames試驗全稱污染物致突變性檢測。艾姆斯(ames)試驗是由美國加州大學生物悄困化學家穗謹艾姆斯等人經多年研究創建的一種用於檢測環境中致突變物的測試方法，是利用經人啟族念工誘變了的微生物作為指示微生物的一監測方法。這種方法實際是檢測化學物質的致突變作用1。

❷ 化學物致癌作用的研究方法有哪些

國際環境致突變物致癌物防護委員會（icpemc）告蔽1983年提出把致突變試驗所反映的遺傳學終點分為5類：
dna完整性的陸做改變（形成加合物、斷裂、交聯）；
dna重排或交換；
dna鹼基序列改變；
染色體完整性早友衡改變；
染色體分離改變。
其中第3實際指基因突變，而第4和第5依次指染色體結構改變和數目改變。

❸ 遺傳毒性與致突變作用的關系是怎樣的

後者屬於前者造成的影響之一。具體關系只能啰嗦點兒才能說清楚了...

首先遺傳毒性指的是化合物能夠作用基爛於細胞的遺傳物質，影響其完整性。比如說具有放射性的化學品會作用於DNA。

所以基本上任何能作用於DNA的物質都屬於有遺傳毒性的物質。比如芳香胺一類的化學品可以通過其親核性與DNA形成穩固的共價鍵，從而妨礙復余脊制，而且有些情況下即便沒有穩固的共價豎鋒滲鍵也能妨礙遺傳信息復制。

而遺傳毒性通過影響生物的遺傳信息造成的三大影響就是致癌作用、致突變作用及致畸作用。其中致突變作用指DNA異常導致蛋白質合成異常，致癌作用指導致細胞增殖失控，致畸作用指導致母體孕期內胚胎畸形。

❹ 毒理遺傳學的致突變、致畸、致癌物質檢測

對各喚胡顫種化學物質的致癌和在胚胎發育過程中的致畸效應的檢測，早期的方法是用待測化學物質喂飼、注射動物或和敗塗布在動物皮膚上，然後觀查動物是否因此而患腫瘤或出現畸胎等。這種方法往往要用幾種動物並重復做橡試驗才能得出可靠的結論，而且費用大，時間長。絕大部分致癌物質具有誘變作用這一發現促使人們考慮用簡便的測試方法來代替動物試驗。現在一般都採用細菌或離體培養的哺乳動物和人類體細胞為測試對象，主要的方法有：

❺ 化學物質致突變的機理

不同的化學物質致突變、致癌和抑制酶活性的生物化學作用機理是不同的。
以二惡英為例：

二惡英類化學物質的毒性機理

二惡英類化學物質毒性的分子機制還沒完全研究清楚，但經過二十多年的研究人們對其機理也有了一定的認識。總的說來二惡英類化學物質產生作用並不是通過直接的損傷，二惡英類化學物質並不與蛋白質和核酸形成加合物，也不直接損害細胞DNA。它們的作用主要是通過芳香烴受體誘導基因表達，改變激酶活性，改變蛋白質功能等而起作用。

通過芳香烴受體介導基因表達（如P4501A1）是二惡英類化學物質毒性作用最主要也是最基本的作用機制。芳香烴受體是一高分子量的蛋白質（110-150KD），與二惡英類化學物質有可逆轉的高親和力，主要存在於細胞漿中（也有小部分在胞核中），其作用模式類似於甾體類受體，但也有不同。該蛋白屬於basichelix-loop-helix PAS(Per-Arnt-Stim)超家族，該家族均為轉錄因子)，均含有兩個功能部位即：basichelix-loop-helix部位和PAS功能部位，該族蛋白對激活基因的轉錄具有重要意義。且各芳香烴受體具有明顯的種間，種內和組織差異。芳香烴受體在細胞漿中是以380 KD的復合物無活性的形式存在，除自身外還有3-4種蛋白質與之結合，其中只鑒別出了90 KD的熱休克蛋白（heatshock protein, HSP90），該蛋白對受體的活性具有重要影響。
芳香烴受體介導的基因表達基本的作用過程可區分以下幾個基本過程：①二惡英類化學物進入細胞；②化合物與芳香烴受體結合；③配體-受體復合物與DNA識別位點結合；④特異基因的轉錄及翻譯；⑤表達蛋白發揮作用。在這些過程中，前三步研究的較清楚，而後續過程還不是很清楚．

❻ 毒理學新技術以及發展方向介紹

毒理學是一門研究化學物質對生物體的毒性反應、嚴重程度、發生頻率和毒性作用機制的科學，也是對毒性作用進行定性和定量評價的科學。毒理學與葯理學密切相關，目前已發展成為具有一定基礎理論和實驗手段的獨立學科，並逐漸形成了一些新的毒理學分支。本文就新技術在分子毒理學中的應用及毒理學的一些發展趨勢作一簡述世困。
1基因引入技術在毒理學中的應用
分子毒理學研究是採用分子生物學技術和方法來研究毒理學問題。如體外採用細胞培養等檢測基因毒性，整體動物試驗採用轉基因動物模型，這對於闡明外源性化學物的毒性及其機制均有重要意義。
基因引入技術是把一段DNA（可以是一個完整的基因，也可以是一個基因片段）引入到細胞或生物體內。引入的DNA可以改變毒物的作用強度，或改變毒物作用方式。因此，可以通過毒物作用程度或方式的改變來判斷引入的DNA所起的毒性作用。
1.1在致突變檢測中的應用
基因毒物是指能損害遺傳物質DNA的化學物，大多為致突變劑。常規的Ame′s試驗是由細菌介導的檢測考試，大網站基因毒物的方法。但這種方法也有一定的局限性，有時可出現假陽性結果。如谷胱甘肽和半胱氨酸均為抗癌劑，但在Ame′s試驗中卻顯示較強的致突變能力。此外，細菌和動物細胞在其生物學方面有很大差異，因此體外動物細胞實驗較細菌更能反映毒物在機體內的作用。有兩類細胞常用於基因毒物的檢測，一類為原代細胞，另一類為傳代細胞。有多種指標用於檢測化笑返褲學物的基因毒性，如核苷酸同位素標記法，若一種化學物能損害DNA，細胞在用該化學物處理後，對損害的DNA要進行修復，修復過程需要核苷酸，如果在培養基中加入同位素標記的核苷酸，則修復的DNA即被同位素標記，在一定情況下，損害的DNA越多，修復的就越多，細胞DNA含的同位素就越多。碰簡因此，通過檢測DNA中同位素的含量來決定該化學物的基因毒性。另一種判斷方法是根據基因毒物能改變細胞的代謝。如正常的V79細胞具有次黃嘌呤磷酸轉移酶，這種酶是正常替代途徑中合成嘌呤核苷酸的必需酶。如果培養基中有嘌呤的同系物（如8-偶氮鳥嘌呤），這種酶能將其同系物轉化成相應的嘌呤核苷酸而合成DNA，但嘌呤同系物沒有正常嘌呤功能，因此會導致細胞死亡。相反，如果一種化學物能損害DNA而使次黃嘌呤磷酸轉移酶的基因發生損害而不能合成正常的酶，其受損的細胞反而存活下來。存活的細胞越多，在一定情況下說明該化學物的致突變能力越強。
某些化學物本身並沒有毒性，但其代謝物顯示出較強的毒性作用。對於這些化學物，上述方法不能檢測出它們的毒性。為了克服這一缺點，可在細胞或細菌培養液中加入肝細胞抽提液以幫助代謝毒物。有的實驗室還用少量原代細胞與被檢的傳代細胞混合培養，由引入的原代細胞提供代謝酶。如硝基二甲基胺，用常規的細菌檢測系統顯示不出任何突變作用，但在細菌培養液中加入肝細胞抽提液後，顯示出很強的基因毒性。這些實驗也存在許多問題，如有些代謝物的半衰期很短，來不及進入檢測細胞與其DNA作用就失活了，肝臟抽提液或原代細胞代謝酶活性隨時間下降得很快；肝臟抽提液或原代細胞含多種酶，即使能代謝毒物並顯示出毒性，也不知道是哪種酶起主導作用。很顯然，建立一種細胞株，能合成某種單一的酶，對研究毒物的毒性作用很重要。利用分子生物學技術，把轉錄某種代謝酶的DNA連接，再接到基因載體上（多為質粒或病毒），這段具有調控能力的DNA，能與體外培養細胞的轉錄因子作用，把含有編碼某種代謝酶的DNA的基因載體引入到體外培養細胞，該細胞就能表達這種特異的酶。這方面較突出的例子是細胞多功能性單胺氧化酶（P450）。體外建立能表達P450的細胞株有兩類，一類是能長期穩定表達的細胞株，一類是能短期表達的細胞株。人的多種P450，如1A1，2A6，2E1，3A4等，已成功地引入人的淋巴樣細胞株、鼠的胎盤細胞株、蒼鼠肝癌細胞株等，這些細胞株由於能表達毒物代謝酶，對需要代謝後才有毒性的化學物，其檢測敏感度提高許多倍。如表達2A6的細胞比不表達2A6的同樣細胞株，在檢測硝基二甲基胺的毒性方面要敏感500倍；比表達2E1的細胞也要敏感大約500倍。說明硝基二甲基胺要代謝以後才能顯示毒性，也說明2A6是能將硝基二甲基胺轉化為毒性代謝物的代謝酶，而2E1則不是。
1.2轉基因動物在毒理學中的應用
轉基因動物是在其基因組中含有外來遺傳物質的動物，它被廣泛應用於科學研究的各個方面。由於轉基因動物集整體、細胞和分子水平於一體，更能體現生命整體研究的效果，因此成為毒理學研究的熱點之一。
1.2.1一般毒性研究模型
C-fos-LacZ轉基因小鼠用於神經毒性的研究。金屬硫蛋白（MT）基因的轉基因和基因刪除小鼠用於金屬和某些非金屬的研究。如用MT轉基因小鼠對鎘等的抗性增加，而MT的基因刪除小鼠對鎘、銀、汞、順鉑和四氯化碳的毒性敏感性增強。
1.2.2致突變檢測模型
轉基因動物為解決遺傳毒性研究中長期存在的一些問題提供了可能性。如體外試驗和體內整體動物的定性、定量外推，整體動物基因突變需消耗大量動物和時間，如確定靶器官以及對誘發的遺傳改變做精細分析等。自Gosen等1989年建立了第一個轉基因突變檢測模型以來，已有十多種模型。
1.2.3致癌檢測模型及其在致癌物質作用機制研究中的應用
轉基因動物為快速檢測致癌物、促癌物和研究化學致癌的機制提供了新的重要途徑。目前已建立的檢測模型或研究模型有：①過量表達癌基因的轉基因動物模型如TG，AC小鼠，HK-fos轉基因小鼠，ras-H2轉基因小鼠，攜帶激活的H-ras原癌基因小鼠等。這些轉基因動物對化學致癌劑的敏感性提高了許多倍。如帶有激活Pim-l腫瘤基因的轉基因動物，對乙基硝基脲的致癌作用，較相應的非轉基因動物，其敏感性提高了25倍；②基因刪除動物致癌檢測模型用同源重組的方法，將一段DNA整合到抗腫瘤基因，使該抗腫瘤基因不能表達具有正常功能的蛋白質，用這種方法培養的動物稱基因刪除動物。在這方面研究得最多的是腫瘤抑制基因P53.基因刪除動物P53（+/-）和正常動物P53（+/+）一樣，發育和生長均無異常，但用致癌劑（如二硝基二甲胺）處理後，P53（+/-）基因刪除動物的平均壽命為29周，而P53（+/+）的平均壽命為42周，其腫瘤的發生與分布也有很大的差異。其他如芳香烴受體（AHR）小鼠、過氧化物酶體增殖劑誘導的受體α（PPARα）小鼠等；③轉基因動物用於生殖毒性研究ZP3（編碼）透明帶硫酸糖蛋白基因刪除小鼠、雌激素受體基因或孕酮受體基因刪除小鼠、DNA甲基轉移酶基因刪除小鼠等。
1.2.4用於特定組織毒性研究的轉基因動物
典型的例子是用含乳糖操縱子的噬菌體培育一種轉基因動物，具有乳糖操縱子的噬菌體在感染某些細菌後，菌落為藍色。如果含有乳糖操縱子的噬菌體在體內由於受化學物的處理而受到損害， 不能抄錄正常的半乳糖苷水解酶，這種噬菌體在體外裝配後，其感染細菌的菌落為無色。因此根據藍色和無色菌落的多少，來判斷某些化學物基因毒性的強弱。此外，用質粒作為載體也獲成功，從而提高了檢測的敏感性，更重要的是，化學物處理後的動物，基因載體可以從不同組織細胞分離出來，因此這種動物能顯示化學物的組織細胞特異毒理學作用。
2毒理學預測范疇的新進展
毒理學和流行病學，特別是與分子流行病學相結合應用於危險度的評價。經典方法中對安全系數作了許多附加修正，以提高種屬之內與之間推導預測的精確性，但其後果使毒理學家面臨來自各種行政規定而缺乏科學依據的一連串修正系數。近年來已提出了新的方法，以盡可能使實際數據而不是人為的假設來確定安全系數。如對致癌物質的評定將使用一種定量的模型，它所重視的是從高劑量到低劑量的推導，而不是從動物到人的種屬間的推導。目前最常見的是線性多級LMS模型，它是將耐受量（MTD）的可信限上端延伸到原點，利用該直線的低劑量區域來估計外源性化學物的量效關系曲線或其毒性強度。這種模型使用一個對應於小生物學單位：即分子的劑量值，而不是將零作為劑量軸的原點。
外源性化學物安全性評價的策略新進展還包括用毒性等效性因子或問答式的方法，構效關系的定量分析，以及葯效和葯代動力學模型來研究復雜化學物。
321世紀毒理學的發展趨勢
3.1傳統和現代毒理學研究方法相結合將推動毒理學的發展過程
過去毒理學研究主要以整體動物試驗和人體觀察相結合，在相當一段時期內這仍然是重要和必要的手段。隨著分子生物學的理論和方法應用於毒理學的研究，將使外源性化學物的毒性評價發展到體外細胞、分子水平的毒性測試與人體志願者試驗相結合的新模式，而傳統以動物為基礎的毒理學研究將減少。某些復雜的整體實驗將逐步為體外試驗或構效關系數學模式所代替。目前用於有害因素的毒性試驗系統將被基因工程的動物和細胞所代替；傳統的發病率和死亡率終點將被生化指標所替代；現在需要數月給葯和評價的毒性研究將在幾小時內完成。轉基因動物對外源性化學物的毒性反應將與人體極為一致，例如取分裂中的人組織培養細胞到體外減數分裂，現行毒性試驗的解釋和外推方式將改變。
3.2大量新技術和新方法的應用將使毒理學研究水平更加深入
上面提到的一些體外細胞檢測和轉基因動物或基因刪除動物模型應用於毒理學研究外，其他新技術如系列分析法、DNA晶元或DNA微點陣等可同時測定數千個基因的表達，用於觀察基因的上調和下調；基因誘捕、代表性差異分析等將為研究化學物致畸的分子機制提供可能；應用基因分布圖能區別特異性或非特異性的細胞損傷；應用絡合物形成作用介導的PCR研究DNA損傷和核苷酸水平上的修復；生物標記物在毒理學中的應用顯得越來越重要，如特異的DNA和蛋白質加合物用於有效暴露的生物標記，用NMR分析尿中的代謝產物，可以確定作為毒性反應生物標記物的代謝變化模式。又如外周血（血小板、白細胞、紅細胞）中的生化標記物可用於測定外源性化學物對神經系統損傷的替代標志物。
在毒理學的研究中，重要的問題是如何把從動物所獲得的資料用於人，把體外資料用於體內，把復雜的整體系統化為簡單的並能人為控制的系統，以及如何提高檢測的敏感性等。轉基因技術為解決這些問題提供了嶄新的手段。在代謝途徑上，通過基因轉移能人為控制某一化學物的代謝；在整體水平上，可以人為控制某一基因的表達水平，從而闡明該基因在化學物致毒過程中的作用。可以預言，各種不同的轉基因動物或基因刪除動物的建立，將對闡明化學物的毒性作用機制，起到重大的作用。
3.3採用多種方法結合起來評價化學物的毒性將是一個重要趨勢
過去20多年應用常規的毒理學方法研究外源性化學物，對於大多數化學物是否獲得足夠的毒理學信息值得懷疑。考慮到化學物質的暴露對人類健康的影響，這一問題就顯得更為突出。由於毒理學試驗要消耗大量動物，因此在毒理學研究中盡量減少動物用量是每一個負責任的毒理學家應該考慮的問題。顯然，如果想對如此眾多的外源性化學物有一個合理的改變，就應該建立新的、可供選擇的、耗費動物少、試驗周期較短、花費較少的毒理學研究方法。這些方法應該根據以下標准來衡量：①動物用量減少；②試驗周期縮短；③研究化學物在環境中的實際濃度；④利用統計或數學模型；⑤預先進行有效的實驗設計；⑥發展管理毒理學等。例如，制葯工業將採用嚙齒類動物（主要是大鼠）的微核試驗與2～4周的毒代動力學研究結合起來的方法來評價葯物。
3.4毒理學分支學科形成發展迅速，「二極」分化現象更為突出
近30年來毒理學由於發展迅速及與相關學科的交叉而形成了許多分支。如根據工作任務可分為臨床毒理學、環境毒理學、工業毒理學、管理毒理學、生態毒理學與法醫毒理學等；根據研究手段與終點不同可分為免疫毒理學、分子毒理學、膜毒理學、遣傳毒理學、分析毒理學等；根據研究對象可分為昆蟲毒理學、獸醫毒理學、人體毒理學與植物毒理學；根據不同外源性化學物可分為金屬毒理學、農葯毒理學、食品毒理學、放射毒理學、葯物毒理學與燃燒毒理學；根據研究工作性質可分為描述毒理學（指常規毒性試驗和安全評價）、機理毒理學和管理毒理學等。近年來還出現更多的毒理學分支，如比較毒理學、地理毒理學、急症毒理學等。可以預見，下世紀還將出現一些新的分支。
此外，毒理學分化將更為明顯。一方面毒理學的軟體部分——管理毒理學仍將是毒理學的研究熱點之一，這將從宏觀上為化學毒物的管理提供科學依據；另一方面，研究水平越來越精細，從細胞、分子和基因水平研究毒理學問題將是普通的科學工作。上述二方面既分化，又相互滲透和結合，使毒理學的軟、硬體結合更為突出。
總之，毒理學與人類日常生活和生產勞動關系日益密切，如環境污染、生態環境的惡化、葯物的不良反應、食品的安全性、獸葯及農葯的危害，以及作業環境的有毒物質是世界范圍內的嚴重問題。可以預見，在21世紀毒理學將會獲得更大的發展，為人類作出更大的貢獻。雖然近年來細胞、分子水平的研究取得了很大的進展，但僅從基因分子水平研究外源性化學物的毒性及其機制是不夠的，因為機體還有宏觀的一面，必須把微觀研究與宏觀研究緊密結合起來，也就是將整體試驗與體外細胞、分子水平的研究結合起來才能得出正確結果。

❼ 遺傳毒理實驗與致突變實驗有什麼不同

差別在於目的性，致突變實驗的目的是驗證物質對生漏岩磨物遺傳性的改變，遺傳毒理實驗是驗證物質對於生物遺傳物質返斗的損害及因此引起的對生物的毒害作用。簡單來說，致突變實驗研究的是因果，什麼物質導致了哪些結果，遺傳毒理實驗研究的是過程，什麼物質怎麼導致了那些結果（生物的遺傳突變棗清往往對於生物自身是有毒害性的，因此此兩種實驗無論實驗過程還是結果以及記錄數據往往很接近或相同）。

❽ 設計一個實驗方案，檢測某工廠排出的污水是否有致突變作用

（1）酸能使石蕊試液變紅色，所以要檢驗廢水仍顯酸性，就可以向廢水樣品中滴加石蕊試液，若溶液變紅色，則說明閉遲廢水顯酸性；（2）酸能和鋅粒反應生成氫氣，所以我們可以向廢水樣品中加入鋅，如果有氣體產生，則說明廢水顯酸性．欲喊態含在處理污水時採用最經濟的方法降低其酸性可以向污水中加入熟石灰．故答案為：（1）取樣，滴加紫色石蕊溶液，若變紅，證明污水顯酸性；（2）取樣，加入鋅粒，有氣鄭笑體生成，證明污水顯酸性；熟石灰．

❾ 羅望子多糖膠的羅望子多糖膠的毒性和致突變性研究

1996年，趙岩等對羅望子多糖膠的毒性和致突變性進行了研究，發現羅望子多糖膠對雌、雄性大鼠、小鼠經口LD50分別為9260mg/kg和做燃大於純仔虛10000mg/kg，屬於實際無毒。在Ames實驗（污染物致突變性的檢測）中，未呈現致突變型。在體內試驗中，未引起小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率和小鼠精子畸變率的增加，在3項致變試驗中，羅望戚謹子多糖膠均未呈現致突變活性。

❿ 遺傳毒性試驗的實驗方法

近十幾年,隨著遺傳毒理學相關領域特別是分子生物學的研究進展,遺傳毒性測試評價方法也在不斷改進。據報道,目前已建立的遺傳毒性短期檢測法已超過200種。根據其檢測的遺傳學終點可分為4種類型:1檢測基因突變;2檢測染色體畸變;3檢測染色體組畸變;4檢測DNA原始損傷。
1現行組合試驗方案由於一種遺傳毒性檢測方法通常只能反映一個或兩個遺傳學終點。沒有一種檢測方法能涵蓋所有的遺傳學終點,故需用一組試驗配套進行試驗。200多種檢測方法中,真正經過驗證有合適靈敏度和特異度的大概不到10種。目前多數國家規定,如體內誘變試驗顯示1個或以上試驗呈陽性結果,則需要進行生殖細胞遺傳毒性測試。
2各類遺傳毒性試驗方法的研究進展
2.1檢測基因突變
遺傳毒性試驗
2.1.1Ames試驗Ames試驗是檢測化學物質基因突變的常用方法。常規的Ames試驗選用四個測試菌株(TA97、TA98、TA100、TA102),最近有人提出增加TA1535測試菌株,該菌株特別適用於檢測混合物的致突變性。目前出現的新生菌株具有更高的敏感性和特異性,如YG7014、TG7108,缺乏編碼O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基化轉移酶的ogtST基因,專用於對烷化劑引起的DNA損傷檢測;引入乙醯轉移酶基因的YG1024、YG1029菌株,對硝基芳烴和芳香胺的敏感性比原菌株高100倍以上[4]。測試代謝活化系統一般採用由Aro-clor1254(PCBs)誘導大鼠肝微粒體酶的S9;國外也有用人肝S9的報道,試驗證明其代謝活性明顯高於鼠S9[5,6]。為了克服S9制備上的困難和不穩定性,Josephy等將沙門氏菌的芳香胺N-乙醯轉移酶基因和人類細胞色素P-450基因Cyp1A2引入細胞,構建了在無外源S9時也可檢出芳香胺誘變性的Ames測試菌株如DJ4501A2[7]。
2.1.2TK基因突變試驗TK基因突變試驗是一種哺乳動物體細胞基因正向突變試驗,近年來其應用價值有明顯的提高。TK基因編碼胸苷激酶,該酶催化胸苷的磷酸化反應,生成胸苷單磷酸(TMP)。如果存在三氟苷(TFT)等嘧啶類似物,則產生異常的TMP,摻入DNA中導致細胞死亡。如受檢物能引起TK基因突變,胸苷激酶則不能合成,而在核苷類似物的存在下能夠存活。TK基因突變試驗可檢出包括點突變、大的缺失、重組、染色體異倍性和其他較大范圍基因組改變在內的多種遺傳改變。試驗採用的靶細胞系主要有小鼠淋巴瘤細胞L5178Y以及人類淋巴母細胞TK6和WTK1等。其基因型均為tk+/-。Honma(本間正充)和張立實(1999)指出原用染毒時間3～6h對於充分檢出斷裂劑和錘體來說這個時間太短,獲陰性結果時應延長至24h。據資料顯示對於同一陽性受檢物,WTK1細胞的突變頻率遠高於TK6細胞,認為與WTK1存在p53基因突變有關。Do-brovolsky(1999)建立了tk+/-轉基因小鼠,可用於體內試驗。
2.1.3轉基因小鼠基因突變試驗轉基因小鼠基因突變試驗可在整體狀態下檢測基因突變,比較不同組織(包括生殖腺)的突變率,確定靶器官,對誘發的遺傳改變作精確分析等[8]。1989年Gossen等報道了LacZ轉基因小鼠突變測試系統。近年來,國外已陸續發展了多種用於突變檢測的轉基因動物,其中3種已投入商品化生產,MutaTM小鼠、Big-BlueTM小鼠和Xenomouse小鼠,它們分別採用大腸桿菌乳糖操縱子的LacZ和/或Lacl作為誘變的靶基因。陳建泉等人(1997)已經以穿梭質粒pESnx載體,以xy1E基因因為誘變靶基因建立了攜帶xy1E的轉基因小鼠,並對轉基因小鼠進行了繁殖建系。並已實驗證明xy1E轉基因小鼠是一個研究體內基因突變的有效模型,它可望成為一種新的轉基因小鼠突變檢測系統[9]。Heddle等(2000)建立了1個種gptdelta轉基因小鼠。HiroyukiHayashi等(2003)將載有E.coligpt基因和λ噬菌體的red/gam基因λEG10DNA整合到SD大鼠每個單倍體基因組q24～q31位點。這種轉基因大鼠對乙基亞硝基脲(ENU)和苯並芘(B[a]P)的肝臟毒性顯示了很好的敏感性,它也有助於研究遺傳毒性物質對小鼠和大鼠的種間差異[10]。
2.1.4反向限制性酶切位點突變分析法(,iRSM)由英國威爾士大學分子遺傳和毒理中心建立並完善的[11]。iRSM適用於快速檢測誘變劑所致體內外DNA的突變,但這些突變的特點是使某一酶切位點變為另一酶切位點。該方法建立者Jenkins等首先將iRSM應用於化學誘變劑所致動物體內p53基因的突變檢測,取得了良好的結果:小鼠分別口服N-乙基N-亞硝基脲(ENU)、2-乙醯氨基芴(2-AAF)和二甲基醯肼(DMH)3天後,以iRSM方法相應地檢測小鼠脾、骨髓和肝組織p53基因第6內含子區域的Apa→Ava位點反向突變。結果表明ENU誘發肝組織p53基因突變的發生率為33%,2-AAF使肝組織突變的發生率為25%,這一陽性突變率反映出了不同誘變劑對相應組織的致突變強度,進一步驗證了該方法的高靈敏度和准確性。它具有靈敏度高、快速、操作簡便、以及突變檢測部位明確等優點,應當說是一種較具實用價值和生命力的突變檢測手段。但是,iRSM的不足之處是僅能檢測誘發限制性酶切位點反向的DNA突變。根據文獻資料分析,化合物致突的發生具有一定的規律性,即結構類似的一組化合物常常引起一些特定序列較固定的鹼基改變。例如,烷化劑和芳香胺類雖易使一連串鳥嘌呤(G)3′端G發生突變[12,13],這可能與該部位電荷密集有關,多數活性氧生成物質的DNA致突作用也具有類似規律[14];CpG二核苷常常是DNA加成物致突變作用部位[15],所以CpG突變的檢測在化合物致突檢測中具有重要意義,而CpG突變常引發某些固定酶切位點的變化。很顯然,iRSM可較廣泛地應用於遺傳毒性化合物致突作用的檢測。
2.2檢測染色體和染色體組畸變
2.2.1微核試驗傳統的體內微核試驗仍然是檢測化學物質染色體損傷的基本方法。目前微核試驗方法主要有以下改進:1體外微核試驗常用細胞有中國倉鼠肺細胞(CHL)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)及中國倉鼠成纖維細胞(V79)等,近年開始有用L5178Y小鼠淋巴瘤細胞和人的類成淋巴細胞TK6。也有用敘利亞倉鼠胚胎(SHE)細胞和BALB/c3T3細胞。體外試驗比體內試驗易於操作和控制。缺點是對直接作用的化合物有可能出現假陽性。2周圍血微核試驗優點是可重復采樣,自身對照,減少實驗動物數。李尊愛(1999)報道剛斷乳不久的小鼠(4～6周齡)用於外周血網織紅細胞微核試驗比年齡更大的敏感些[16]。3胞質分裂阻滯法微核試驗(CB-MNT)很好地排除了細胞分裂的影響。該法中,雙核細胞是只分裂了一次的細胞,其結果更加穩定敏感。CB-MNT可觀察到多種遺傳學終點。觀察不同分裂期的細胞比例,計算核分裂指數能檢測誘變物對細胞周期的影響。還可檢測切除修復,次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)位點變異,凋亡。認為該試驗可使計數值提高,達到傳統方法的兩倍或以上。但也偶小於兩倍的結果(李來玉,1996)。最近Garriott和Phelps等推薦了關於體外雙核細胞微核試驗的幾個參數條件:細胞鬆弛素B不影響試驗結果;計數2000個雙核細胞;長時間暴露沒有必要;結果用趨勢檢驗分析;根據相應的細胞毒性選擇適當的濃度[17]。
2.2.2染色體畸變試驗染色體畸變試驗是檢測化學物質影響染色體數量和結構的基本方法。在化學物質安全性評價中常選體外CHL細胞染色體畸變、精原細胞染色體畸變試驗等檢測化學物質對染色體的影響。為了准確觀察誘發的畸變頻數,本試驗收獲細胞的時間應盡量提前至大多數細胞處於染毒後第1次有絲分裂時(Tucker,1996)。對於染色估數目改變,原則上只適合超倍體的觀察。因為塗片時可能人為地把染色體推出細胞外(Tucker,1997),Danford曾建議在制備標本時減弱低滲處理能力,以免漲破細胞膜,從而能准確觀察亞二倍體。經研究,認為以0.094mo1/LKC1弱低滲液處理2min～3min是達此目的的最佳條件(樓鐵柱,1997)。
2.2.3熒光原位雜交(FISH)技術熒光原位雜交最早由Bauman(1980)建立,後由Lucas(1989)首先應用於染色體畸變分析。其原理是按檢測目標准備恰當的DNA序列作為探針,並用生物素標記,對載玻片上待測標本中的DNA雜交,最後通過雜交位點的熒光觀察染色體結構或數目的改變。應用特殊染色體和染色體某區域的熒光探針可在體內檢測4種類型的細胞遺傳學終點[18]。1檢測中期細胞染色體畸變。2應用亞染色體區域的探針檢測間期染色體斷裂和非整倍體。3應用中心粒探針和/或抗著絲點抗體檢測微核的形成。Schriever-Schwemmet等利用CREST間接免疫熒光法,以及小鼠次要和主要衛星DNA探針,在小鼠骨髓細胞證明了受試物引起微核的來源[19]。4哺乳動物精子非整倍體檢測。徐德祥(1999)用雙色FISH方法對丙烯腈接觸男工精子性染色體數目畸變進行了檢測,證明FISH技術用於檢測精子染色體數目畸變實驗結果穩定可靠。
2.3檢測DNA原始損傷2.3.1單細胞凝膠電泳技術單細胞凝膠電泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)是Ostling等(1984)首創的,以後經Singh等(1988)進一步完善而逐漸發展起來的一種快速檢測單細胞DNA損傷的實驗方法,因其細胞電泳形狀頗似慧星,又稱慧星試驗(cometassay)。Kizilian(1999)改進了一些試驗條件,能明顯將細胞調亡和細胞壞死的形象與「彗星」區分。MarkS.Rundell等(2003)報道彗星試驗測行的損傷主要是由致突變劑引起的[20]。RichardD.Bowden等(2003)研究出了一種新的分析試驗結果的彗星尾圖譜,可以更加准確的分析彗星的長度及密度[21]。SCGE是評價遺傳毒性損害非常敏感的實驗,可以檢測到每1.657×10-37kg中0.1個DNA的斷裂。與經典的染色體畸變、微核、SCE相比,SCGE可以用於活細胞DNA的檢測,也能用於死亡細胞DNA的分析,使SCGE不僅可以研究低劑量下的生物效應,也可用於研究高劑量下的生物效應;同時SCGE又可提供DNA修復能力的信息,這使得SCGE非常適用於評價受試物的遺傳毒性