質粒dna的轉化用的什麼方法

① 質粒在細菌間的轉移方式主要是

質粒在細菌間的轉移方式主要是

接合

質粒在細菌間的轉移方式主要是接合，通過性菌毛的作用從供體菌傳遞給受體菌。

1、接合悶咐陸作用：當細菌與細螞頃菌相互接觸時，質粒DNA就可從一個細菌轉移到另一個細菌。

2、轉化作用：由外源性DNA導入宿主細胞，並引起生物類型改變或使宿主細胞獲得新的遺傳表型的簡燃過程，稱為轉化作用。

3、轉導作用：當病毒從被感染的細胞釋放出來，再次感染另一細胞時，發生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組稱為轉導作用。

4、轉座（轉位）：轉座是指一個或一組基因從一個位置轉到基因組的另一個位置。可分為插入序列轉座和轉座子轉座。

5、基因重組：不同DNA分子間發生的共價連接稱基因重組。有兩種類型：位點特異的重組和同源重組。

基因水平轉移的形成因素：

1、由質粒或病毒等介導的水平基因轉移質粒和病毒是在各生物間進行遺傳物質傳遞的重要媒介。

2、基因的「直接」水平轉移水平基因轉移除了通過質粒和病毒為媒介以外，大量發現的是不需要媒介的「直接」轉移。

3、基因組序列分析和水平基因轉移隨著基因工程的深入開展，人類及其它生物基因組測序工作相繼完成，人們發現不同物種之間，甚至親緣關系很遠的生物之間基因組上有大量同源基因存在。

4、水平基因轉移與進化由前可知，水平基因轉移實際上已被引入了分子進化及宏觀進化領域，被認為是推動進化的重要動力。

② 質粒DNA的提取方法總共有哪些，回答的全給高分

(一)鹼裂解法提取質粒
[實驗原理]
鹼裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們。在pH值介於12.0~12.5這個狹窄的范圍內,線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性,盡管在這樣的條件下,共價閉環質粒DNA的氫鍵會被斷裂,但兩條互補鏈彼此相互盤繞,仍會緊密地結合在一起。當加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復Ph至中性時，共價閉合環狀質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而准確，在而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那麼迅速而准確，它們纏繞形成網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉澱下來而被除去。
[實驗儀器與設備]
1.恆溫培養箱 2.恆溫搖床
3.台式離心機(最大轉速4000rpm) 4.冷凍高速離心機
5.高壓滅菌鍋 6.超凈工作台
7.微量移液器 8.eppendorf tupe、tip
[實驗材料]
1.葡萄糖 2.三羥甲基氨基甲烷(Tris)
3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氫氧化鈉
5.十二烷基硫酸鈉(SDS) 6.乙酸鉀
7.冰乙酸 8.氯仿
9.乙醇 10.胰RNA酶
11.氨苄青黴素 12.蔗糖
13.溴酚藍 14.酚
15.β巰基乙醇 16.鹽酸
17.含pUC18質粒的大腸桿菌
附：試劑的配製
1.溶液Ⅰ
50mmol/L 葡萄糖
5mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris) Tris·HCl (pH8.0)
10mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
2.溶液Ⅱ
0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等體積混合
3.溶液Ⅲ
5mmol/L 乙酸鉀 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
水 28.5 ml
4.TE緩沖液
10mmol/L Tris·HCl
1 mmol/L EDTA(pH8.0)
5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用後即放回)
6.胰RNA酶
將RNA酶溶於10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的濃度，於100℃加熱15min,緩慢冷卻至室溫，保存於-20℃。
7.終止液:40%蔗糖、0.25%溴藍酚
8.酚
[實驗步驟]
(一) 提取質粒
1.將2ml含相應抗生素的LB液體培養基加入到試管中，接入含質粒的大腸桿菌，37℃振盪培養過夜。
2.取1.5ml培養物倒入微量離心管中，4000rpm，離心2min。
3.吸去培養液，使細胞沉澱盡可能乾燥。
4.將細菌沉澱懸浮於100μl溶液Ⅰ中，充分混勻，室溫放置10 min。
5.加200μl溶液Ⅱ(新鮮配製)，混勻內容物，將離心管放冰上5 min。
6.加入150μl溶液Ⅲ(冰上預冷)，蓋緊管口，顛倒數次使混勻。
7.1200rpm，離心15 min，將上清轉至另一離心管中。
8.向上清中加入等體積酚：氯仿(去蛋白)，反復混勻，12000rpm，離心5min,將上清轉移到另一離心管中.
9.向上清加入2倍體積乙醇,混勻後,室溫放置5-10min。12000rpm離心5min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。
10.用1ml70%乙醇洗滌質粒DNA沉澱，振盪並離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中乾燥。
11.加50μl TE緩沖液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。
(二)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA
[實驗原理]
瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的常用方法。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應，DNA分子在高於等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由於糖磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。不同濃度瓊脂糖凝膠可以分離從200bp至50kb的DNA片段。在瓊脂糖溶液中加入低濃度的溴化乙錠(ethim bromide ,EB)，在紫外光下可以檢出 10ng的DNA條帶，在電場中，pH8.0條件下，凝膠中帶負電荷的DNA向陽極遷移。
瓊脂糖凝膠有如下特點：
(1) DNA的分子大小 在凝膠基質中其遷移速率與鹼基對數目的常用對數值成反比，分子越大遷移得越慢。
(2) 瓊脂糖濃度 一個特定大小的線形DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率(u)的對數與凝膠濃度(t)成線性關系。
(3) 電壓 低電壓時，線狀DNA片段遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大於2kb的DNA片段的解析度達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。
(4) 電泳溫度 DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳行為受電泳時的溫度影響不明顯，不同大小的DNA片段其相對遷移速率在4℃與30℃之間不發生明顯改變，但濃度低於0.5%的凝膠或低熔點凝膠較為脆弱，最好在4℃條件下電泳。
(5) 嵌入染料 熒光染料溴化乙錠用於檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料嵌入到堆積的鹼基對間並拉長線狀和帶缺口的環狀DNA,使其剛性更強,還會使線狀遷移率降低15%。
(6) 離子強度 電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配製凝膠，電導率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導很高並明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化。
對於天然的雙鏈，常用的幾種電泳緩沖液有TAE、TBE等，一般配製成濃縮母液，室溫保存，用時稀釋。
[實驗儀器與設備]
1. 恆溫培養箱 2. 瓊脂糖凝膠電泳系統
3. 高壓滅菌鍋 4. 紫外線透射儀
[實驗材料]
1.三羥甲基氨基甲烷(Tris) 2.硼酸
3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚藍
5.蔗糖 6.瓊脂糖
7.溴化乙錠 8.DNA marker
9.DNA樣品
[實驗步驟]
1.緩沖液的配製
① 5×TBE(5倍體積的TBE貯存液)
配1000ml 5×TBE:
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5mol/l EDTA 20ml
Ph8.0
② 凝膠加樣緩沖液(6×)
溴酚藍 0.25%
蔗糖 40%
③溴化乙錠溶液(EB) 0.5μg/ml
2.制備瓊脂糖凝膠
按照被分離DNA的大小,決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。可參照下表：
瓊脂糖凝膠濃度 線性DNA的有效分離范圍
0.3% 5-60 kb
0.6% 1-20 kb
0.7% 0.8-10 kb
0.9% 0.5-7 kb
1.2% 0.4-6 kb
1.5% 0.2-4 kb
2.0% 0.1-3 kb
3.膠板的制備
(1) 用高壓滅菌指示紙帶將洗靜、乾燥的玻璃板的邊緣(或電泳裝置所皿備的塑料盤的開口)封住，形成一個膠膜(將膠膜放在工作台的水平位置上，用水平儀校正)。
(2) 配製足夠用於灌滿電泳槽和制備凝膠所需的電泳緩沖液(1×TBE)。准確稱量的瓊脂糖粉。緩沖液不宜超過錐瓶或玻璃瓶的50%容量。 在電泳槽和凝膠中務必使用同一批次的電泳緩沖液，離子強度或pH值的微小差異會在凝膠中形成前沿，從而大大影響DNA片段的遷移率 。
(3) 在錐瓶的瓶頸上鬆鬆地包上一層厚紙。如用玻璃瓶，瓶蓋須擰松。在沸水浴或微波爐中將懸浮加熱至瓊脂糖溶解。注意：瓊脂糖溶液若在微波爐里加熱過長時間，溶液將過熱並暴沸。應核對溶液的體積在煮沸過程中是否由於蒸發而減少，必要時用緩沖液補充。
(4) 使溶液冷卻至60℃。加入溴化乙錠(用水配製成10mg/ml的貯存液)到終濃度為0.5ug/ml，充分混勻。
(5) 用移液器吸取少量瓊脂糖溶液封固膠模邊緣，凝固後，在距離底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入瓊脂糖後可以形成完好的加樣孔。如果梳子距玻璃板太近，則拔出梳子時孔底將有破裂的危險，破裂後會使樣品從玻璃板之間滲透。
(6)將剩餘的溫熱瓊脂糖溶液倒入膠模中。凝膠的厚度在3-5mm之間。檢查一下梳子的齒下或齒間是否有氣泡。
(7)在凝膠完全凝固後(於室溫放置30-45分鍾) ，小心移去梳子和高壓滅菌紙帶，將凝膠放入電泳槽中。
低熔點瓊脂糖凝膠及濃度低於0.5%的瓊脂糖凝膠應冷卻至4℃，並在冷庫中電泳。
(8)加入恰好沒過膠面約1mm深的足量電泳緩沖液。
4.加樣
DNA樣品與所需加樣緩沖液混合後，用微量移液器，慢慢將混合物加至樣品槽中。此時凝膠已浸沒在緩沖液中。 一個加樣孔的最大加樣量依據DNA的數量及大小而定，一般為20-30μl樣品。
已知大小的DNA標准，應同時加在凝膠的左凝膠的左側和右側孔內。確定未知DNA的大小。測量未知DNA的大小時，要所有樣品都用相同的樣品緩沖液。
5.電泳
在低電壓條件下,線形DNA片段的遷移速度與電壓成比例關系,但是,在電場增加時,不同相對分子質量的DNA片段泳動度的增加是有差別的。因此，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨之減小。為了獲得電泳分離DNA片段的最大解析度，電場強度不應高於5V/cm。當溴酚藍指示劑移到到距離膠板下沿約1-2cm處，停止電泳。

③ dna轉化有哪些方式合有何優點

DNA轉化的范圍較廣，但以植物細胞中的轉化為主，現將其方式及優點闡述如下：

1、農桿菌介導基因轉化：

• 轉化原理:農桿菌是普遍存在於土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物的受傷部位，並誘導產生冠癭瘤或發狀根。根癌農桿菌和發根農桿菌中細胞中分別含有Ti質粒和Ri質粒，其上有一段T-DNA，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞後，可將T-DNA插入到植物基因組中,並且可以通過減速分裂穩定的遺傳給後代，這一特性成為農桿菌介導法植物轉基因的理論基礎。人們將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，藉助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然後通過細胞和組織培養技術，再生出轉基因植株。

• 特點：操作簡便、成本低、轉化率高，廣泛應用於雙子葉植物的遺傳轉化。

2、基因槍轉化：

• 轉化原理：利用火葯爆炸或高壓氣體加速，將包裹了帶目的基因的DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細胞中，然後通過細胞和組織培養技術，再生出植株，選出其中轉基因陽性植株即為轉基因植株。

• 特點：基因槍轉化率差異很大，相對於農桿菌介導的轉化率要低得多，而且基因槍轉化成本高，嵌合體比率大，遺傳穩定性差。它的一個主要優點是不受受體植物范圍的限制，而且其載體質粒的構建也相對簡單。

3、花粉管通道法：

• 轉化原理：在授粉後向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，並進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發育而成為帶轉基因的新個體。

• 特點：不依賴組織培養人工再生植株，技術簡單，不需要裝備精良的實驗室，常規育種工作者易於掌握。

④ 用氯化鈣法將質粒DNA轉化入大腸桿菌實驗中，轉化成功的關鍵因素有哪些

影響轉化效率的因素很多，主要有：感受態細胞制備的質量、受體菌生長期（大腸桿菌在對數生長期易產生感受態）、質粒的大小和構型、所用試劑的純度、接種前菌種的保藏方式、冰浴時間（延長冰浴時間可略微提高轉化率）、器皿的清潔度、化合物及無機離子（rb+、mn+、如燃二甲基亞碸能適當提高轉化率）、質粒與細胞個數的比例（質粒與細胞個數比例在1:1以下時，轉化率隨著加入dna的量增加而呈線性增加）。
注意事項：
（1）細胞生長狀態和密度。密度不足或過高會使轉化率下降。
（2）質粒dna的質量和濃度。用於轉化的質粒dna應主要是共價閉環dna。轉化率與外源dna的濃度在一定范圍內成正比，量過多貨體積過大時，轉化率下降。
（3）試劑的質量。
（4）防止雜菌和其他外源鍵橡正dna的污染。
（5）根據所需質粒dna的特性，設置相應的選擇性培養基進稿悔行篩選，有的可能還需進行多補篩選。

⑤ 質粒的轉換的方法有哪些質粒轉化後如何篩選

轉化的方法：最常用的是感受態法，包括熱激和電轉化等，轉染不是轉化，這是不同的概念。

轉化後，可以根據質粒上帶有的某種特殊基因的表達來鑒定菌落，最常用的有：抗葯性基因的表達，比如質粒帶有氨苄抗性基因，能在AMP平板上長的一般可以初步判斷為轉化成功的菌；還有就是顯色篩選，比如質粒上的LacZ基因表達，間接促使添加了X-gal的培養基變藍，綠色熒光蛋白基因表達後菌落發熒光等。

⑥ 質粒轉化步驟

質粒的轉化，滿滿干貨
原理：在受體細胞經過化學試劑或者電擊處理等方法處理後，受體細胞的膜通透性發生改變，質粒DNA或者以其為載體的重組DNA分子，進入到細菌體內而實現擴增。

感受態細胞：是指細胞自然或者經過誘導處於容易吸收外源DNA的一種生理狀態。在基因工程中，用於轉化的受體菌（Restriction-Modification 缺陷變異株，以防止對導入外源DNA進行切割）一般通過誘導的方式實現。主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大，直觀的說，使得細胞膜表面出現一些孔洞，便於外源基因或載體進入感受態細胞。由於細胞膜的流動性，這種孔洞會被細胞自身所修復。

質粒的轉化主要包含

Ⅰ感受態細胞制備

Ⅱ質粒DNA轉化

Ⅲ質粒DNA的提取

（Ⅰ）感受態細胞制備

1）從新活化的大腸桿菌（常用DH5a）平板上挑取一個單菌落，接種於3ml LB培養基的試管中，37℃振盪培養過夜。

2）將該菌懸液按照1:100轉接到液體培養基中，100ml，37℃振盪擴大培養，2~3h。當培養液開始渾濁時，間段性測試OD600，在數值為0.3-0.5時停止培養。

3）培養好的菌液轉移到離心管中，冰上放置20min，0℃-4℃離心10min（4000r/min）。

4）棄掉上清，管口倒置以便培養液棄除干凈。

5）加入0.1mol/L冰冷的氯化鈣溶液30ml，小心懸浮沉澱細胞，冰浴30min。（氯化鈣的濃度和純度非常重要，不同批次不同廠家的產品均可影響感受態轉化率）

6）4℃離心10min（4000r/min）。

7）棄掉上清，用0.1mol/L氯化鈣2ml冰浴懸浮細胞（冰上放置）片刻，感受態細胞製成。

8）可直接用於實驗，4℃保存。也可分裝長期保存，加入總體積15%的滅菌甘油，-70℃條件下保存。

（Ⅱ）質粒DNA的轉化

1）取100ul新鮮制備的感受態細胞，加入質粒1ul DNA混勻,同時設置對照組（未加質粒，未加受體菌，已知具有轉化活性的DNA）。

冷凍的感受態細胞要在冰上解凍，待管中最後一點冰融化後，迅即加入DNA. 解凍感受態細胞溫度高於0℃，會降低轉化效率。

2）冰浴30min，離心管放到42℃保溫90s（不要搖動離心管）。冰浴時間短於30min ,可能影響轉化率。然後迅速冰浴2min。

3）向離心管加800ulLB液體培養基，37℃振盪培養1h（150r/min）。37℃生長1小時能夠對於細胞恢復和抗生素抗葯性表達具有最佳效果。

4）取適當（50ul）的復甦細胞培養液，塗布在含抗性的選擇性培養基上，將培養皿放置在37℃恆溫培養箱中，正置30min。等菌液完全被培養基吸收後，倒置培養皿，在37℃恆溫培養箱中，培養12~16h，出現菌落。

5）菌落結果：

① 無菌落

失敗或者培養條件不充分

② 布滿菌落,

呈苔樣，失敗。可能是抗生素濃度不夠或失敗。出現大菌斑，大多是由於黴菌污染所致

③ 布滿菌落

濃度太高，失敗

④ 出現菌落

符合要求

Ⅲ）質粒DNA的提取

質粒DNA的提取，由於其本身分子量小，一般採用鹼裂解法提取。目前已研發出多種質粒提取試劑盒，實驗操作簡單，只需按照產品操作說明操作即可。不過對於其中主要試劑和作用的理解，能夠避免實驗過程中的一些問題，或者能夠更好的解決問題。

各廠家提供的試劑盒中試劑不盡相同，一般的提取純化試劑盒，主要包括以下試劑：

A. 細胞懸浮試劑: 主要作用是將菌體細胞懸浮起來。菌體懸浮不完全會導致裂解不完全，質粒的提取純度和得率都會下降。通常需要在裡面加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。通常選用Tris-HCl作為體系中pH穩定緩沖液。EDTA，金屬離子螯合劑可以和細菌體內的金屬離子結合而DNase的活性受到抑制。有的會有葡萄糖，可用來增加溶液粘度，保證菌體懸浮，延緩菌體沉澱時間。

B. 細胞裂解試劑：主要作用是裂解細胞，通過鹼溶液的作用破壞細胞膜結構，使其雙層膜結構改變，而導致細胞裂解。一般由一定濃度的NaOH和SDS組成。SDS的作用與後期中和過程中清除掉蛋白質等細胞雜質有關系。此步驟中需要注意的是，鹼溶液的作用時間不能太長，也不可劇烈離心管，反之會導致鹼破壞基因組DNA，導致同等大小的基因組DNA被提純，造成污染。

C. 中和試劑：主要作用使中和掉細胞裂解試劑中的鹼性物質，並去除掉其中的蛋白等雜質物質。組份有醋酸鉀和醋酸，或者乙酸鉀和冰乙酸。

D. 清洗Buffer: 主要是清洗掉多餘的鹽離子。DNA被試劑盒中的提取柱吸附之後，需要用wash buffer 洗脫掉多餘的鹽離子。主要成分有Tris-HCl和乙醇。需要注意的使乙醇對後續酶切和測序反應會有影響，因此在後續洗脫DNA前，必須完全清除柱子中的乙醇。

E. 洗脫Buffer: 主要作用就是洗脫硅膠柱上的DNA樣品。

1.柱平衡：在柱中加入2ml的平衡buffer，通過重力的作用，使平衡buffer都流出。

2.細胞收獲：對於高拷貝質粒（培養液中，>2µg DNA/mL)，吸取1-3ml培養液,離心去上清；對於低拷貝質粒（培養液中，<2µg DNA/mL)，吸取10-15ml培養液，離心去上清。

3. 細胞懸浮：加0.4mL的細胞懸浮液(containing RNase A)懸浮細胞，並使其混勻。

4. 細胞裂解：加入0.4mL細胞裂解液，通過上下顛倒帶蓋子管子5次使其輕輕混勻，不要渦旋，之後在室溫下放置5min.

5. 中和：加入0.4mL的中和試劑，立即混合均勻。當大的細胞顆粒被處理後，可能會進行更劇烈的搖動。但是，不要渦旋！~12,000xg離心混合物10min. 如果是採用的4°離心，上清液需要恢復到室溫，再加入到柱子中。

6. 裝柱：吸取步驟5中的上清液到平衡柱中。讓混合液通過重力的作用流出，棄掉流出液。

7. 柱子清洗：2.5 mL的Wash Buffer洗脫柱子量次。每次清洗讓清洗液通過重力的作用流出，棄掉流出液

8. 質粒DNA洗脫：加入0.9mL的Elution Buffer。讓Elution Buffer通過重力的作用流出。不要強行弄出裡面的液體。

9. 質粒DNA沉澱：加入0.63mL異丙醇去析出，混勻，~12,000xg at/4°C離心30min。小心的去掉上清，之後風干10分鍾

10. DNA純化：將管子中的DNA溶解到TE buffer中。將這些溶液轉移到新管中。

重組質粒鑒定的方法：

① 雙酶切後跑電泳；直接DNA電泳可判斷整個DNA重組質粒是否正確。② PCR(插入片段在2kb以下時)，然後電泳。

③ 送公司測序（最為准確的鑒定方式）。

影響轉化效率的因素：

① 細胞狀態和細胞密度: 培養菌最好選用傳代次數少，且保存於-70℃或者-20℃。不要使用經過多次轉接或者保存於4℃環境中培養菌。細胞生長密度以剛進入對數其為最好，可通過檢測培養液的OD600值來判斷，密度過高或者不足，都會影響轉化效率。通常DH5α菌株在OD600的值為0.5左右，細胞密度在5*107個/ml左右比較合適。密度過高或者不足均會影響轉化效率。

② 質粒的質量和濃度：轉化的質粒DNA中，超螺旋狀態的質粒，轉化效率最好。在一定濃度范圍內，轉化的效率與添加質粒的濃度成正比。不過在添加的質粒的量和體積過大的時候，轉化效率也會降低。質粒的分子量越大，通常來說轉化率也會降低。

③試劑的質量：轉化過程中所用的試劑，如氯化鈣的濃度和純度非常重要，不同批次不同廠家的產品均可影響感受態轉化率。

④防止雜菌和DNA污染：實驗需要在無菌條件下進行，所用的儀器和試劑均需要滅菌處理，並防止在實驗過程中引入其他污染。

⑤培養過程的條件：培養瓶中培養基的量關乎到菌體生長過程中的能量代謝。通常來說厭氧環境做出來的感受態的轉化效率較低。建議500ml三角瓶液體培養基量不超過100ml, 250ml三角瓶液體培養基量不超過50ml. 培養基的pH值要適宜，接種前一般pH值在6.8-7.2，等培養結束後可以再測一下pH值最好在6.5以上（不低於6.0），表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態良好。培養基中的各種離子和溫度，也對形成好的感受態有關系。

幾種擴增常用感受態細胞：

① 普通骨架載體cDNA產品

DH5α：常用於質粒克隆，可用於藍白斑篩選

TOP10：適用於高效的DNA克隆和質粒擴增，能夠保證高拷貝質粒的穩定遺傳。

TG1: 生長速度快，常用於噬菌體的制備，同時也可用於普通質粒的構建。

CopyCutter：適用於有毒克隆。

② 慢病毒載體質粒：

Stbl3: 是慢病毒載體系統推薦使用的菌株，可有效抑制長片段末端重復區的重組，降低錯誤重組的概率

Stable（NEB）：可用於逆轉錄病毒/慢病毒載體系統擴增。

⑦ 質粒的提取原理

質粒提取是指去除 RNA，將質粒與細菌基因組 DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒。

目錄

一、質粒提取原理

質粒是細胞內的一種環狀的小分子DNA，是進行DNA重組的常用載體。作為一個具有自身復制起點的復制單位獨立於細胞的主染色體之外，質粒DNA上攜帶了部分的基因信息，經過基因表達後使其宿主細胞表現相應的性狀。在DNA重組中，質粒或經過改造後的質粒載體可通過連接外源基因構成重組體。

從宿主細胞中提取質粒DNA，是DNA重組技術中最基礎的實驗技能。分離質粒DNA有三個步驟：培養細菌使質粒擴增，收集和裂解細菌，分離和純化質粒DNA。

在質粒提取過程中，由於機械力、酸鹼度、試劑等的原因，可能使質粒DNA鏈發生斷裂。所以，多數質粒粗提取物中含有三種構型的質粒：共價閉合環狀DNA（cccDNA）： 質粒的兩條鏈沒有斷裂；超螺旋開環DNA（ocDNA）： 質粒的一條鏈斷裂；鬆弛的環狀分子線形DNA（lDNA）： 質粒的兩條鏈均斷裂；線性分子質粒DNA的分子構型 。

質粒DNA瓊脂塘凝膠電泳模式圖可分為：鬆弛線性的DNA； 鬆弛開環的OC構型； 超螺旋的SC構型。由於瓊脂糖中加有嵌入型染料溴化乙錠，因此，在紫外線照射下DNA電泳帶成橘黃色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA則位於凝膠的最後邊；道中的L DNA 是經核酸內切限制酶切割質粒之後產生的，它在凝膠中的位置介於OC DNA 和 SC DNA 之間。

二、質粒提取方法

質粒DNA的提取方法主要有鹼裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法。跟據不同的實驗目的和儀器設備擇取不同的實驗方案。

(一) 鹼裂解法：

此方法適用於小量質粒DNA的提取，提取的質粒DNA可直接用於酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下：

1. 接1%含質粒的大腸桿菌細胞於2ml LB培養基。

2. 37℃振盪培養過夜。

3. 取1.5ml菌體於Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。

4. 加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5. 加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，輕輕翻轉混勻，置於冰浴5 min 。

6. 加入0.15m1預冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，輕輕翻轉混勻，置於冰浴5 min 。

7. 以10，000rpm離心20min，取上清液於另一新Ep管

8. 加入等體積的異戊醇，混勻後於0℃靜置10min。

9. 再以10，000rpm離心20min，棄上清。

10. 用70％乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。

11. 待沉澱乾燥後，溶於0.05mlTE緩沖液中

(二) 煮沸法：

1. 將1.5ml培養液倒入eppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。

2. 棄上清，將管倒置於衛生紙上幾分鍾，使液體流盡。

3. 將菌體沉澱懸浮於120ml STET溶液中，渦旋混勻。

4. 加入10ml新配製的溶菌酶溶液(10mg/ml)， 渦旋振盪3秒鍾。

5. 將eppendorf管放入沸水浴中，50秒後立即取出。

6. 用微量離心機4℃下12000g離心10分鍾。

7. 用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。

8. 取20ml進行電泳檢查。

(三) 酚氯仿裂解法：

1. 從瓊脂平板上挑取轉化菌陽性克隆，接種到標准LB培養液中（含有卡那黴素30 μg/mL）搖菌12 h；收集1.5 mL菌液，8000 g/min離心3 min，棄上清，沉澱加入200 μL TE，充分混勻；加入400 μL酚氯仿（1∶1體積）混合液，劇烈振動10 s，混勻；12 000 g/min離心5 min，1 mL胰島素注射針收集上清，盡量避免吸入蛋白沉澱層；上清經國產0。22 μm針式濾器過濾1次；向過濾上清液內加入2倍體積無水乙醇，振盪10 s，12 000 g/min離心5 min；沉澱溶於20 μL的RTE溶液中，37℃水浴。

2. 按PstI內切酶說明書進行酶切反應（37℃，1 h）。 酶切產物10 μL，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

3. PCR引物根據參考文獻〔1〕設計，預計擴增產物片斷大小為714 bp。

4. 常規制備感受態菌E。coli DH5a，提取質粒DNA常規轉化感受態，塗於含有卡那黴素（30 μ/mL）LB培養平板中，37℃培養，15 h後觀察篩選克隆情況。

三、質粒提取常見問題

(一) 溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小於8時，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。

EDTA：1. 螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;2. EDTA的存在，有利於溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環境。

(二) 溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大於5，小於9的溶液中，是穩定的。但當pH＞12或pH＜3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時，該系統的pH就高達12.6，因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性。

SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：1. 溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。2. 解聚細胞中的核蛋白。3. SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉澱下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以後的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。

(三) 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：

NaAc的水溶液呈鹼性，為了調節pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調回pH至中性，使變性的質粒DNA能夠復性，並能穩定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利於變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉澱之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，後者是因為鈉鹽與SDS－蛋白復合物作用後，能形成較小的鈉鹽形式復合物，使沉澱更完全。

(四) 為什麼用無水乙醇沉澱DNA？

用無水乙醇沉澱DNA，這是實驗中最常用的沉澱DNA的方法。乙醇的優點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉澱劑。

DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易於聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量佔67％左右。因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉澱時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉澱DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵，最後的沉澱步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉澱DNA。一般在室溫下放置15－30分鍾即可。

(五) 在用乙醇沉澱DNA時，為什麼一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達0.1～0.25mol/L？

在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易於互相聚合而形成DNA鈉鹽沉澱，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉澱不完全，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉澱的DNA中，由於過多的鹽雜質存在，影響DNA的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉澱。

(六) 加核糖核酸酶降解核糖核酸後，為什麼再要用SDS與KAc來處理？

加進去的RNase本身是一種蛋白質，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉澱，再加KAc使這些復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物，使沉澱更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉澱，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。

(七) 為什麼在保存或抽提DNA過程中，一般採用TE緩沖液？

在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統（pKa＝7.2）和硼酸系統（pKa=9.24）等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉化實驗時，磷酸根離子的種類及數量將與Ca2＋產生Ca3(PO4)2沉澱；在DNA反應時，不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，採用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統，由於緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都採用Tris-HCl系統，而TE緩沖液中的EDTA更能穩定DNA的活性。

(八) 如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來沉澱DNA？

採用PEG（6000）沉澱DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉澱DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1％左右，小分子所需PEG濃度高達20％。本實驗選擇性沉澱4.3kb的pBR322質粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最終PEG濃度為12％。PEG選擇性沉澱DNA的解析度大約100bp。

(九) 抽提DNA去除蛋白質時，怎樣使用酚與氯仿較好？

酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當蛋白水溶液與酚或氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態而變性。經過離心，變性蛋白質的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉澱在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經酚第一次抽提後的水相中有殘留的酚，由於酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。

(十) 為什麼用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？

在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振盪容器數次，這時在混合液內易產生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產生。一般採用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可採用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配製，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助於分相，使離心後的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。

(十一) 為什麼要用pH8的Tris水溶液飽和酚？呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？

因為酚與水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調節至pH為8是因為DNA在此條件下比較穩定。在中性或鹼性條件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。

保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以便用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1％。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，並在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和後的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮氣，防止與空氣接觸而被氧化。平時保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時，打開蓋子吸取後迅速加蓋，這樣可使酚不變質，可用數月。

(十二) 未提出質粒或質粒得率較低？

1. 大腸桿菌老化

請塗布平板培養後，重新挑選新菌落進行液體培養。

2. 質粒拷貝數低

由於低使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷

貝數載體。

3. 菌體中無質粒

有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經多次轉接後有可能造成質粒丟失。

例如，柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定，因此不要頻繁轉接，每次接種時

應接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

4. 鹼裂解不充分

使用過多菌體培養液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液P1、

P2和P3的用量。對低拷貝數質粒，提取時，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能

有助於增加質粒提取量和質粒質量。

5. 溶液使用不當

溶液P2、P3在溫度較低時可能出現渾濁，應置於37℃保溫片刻直至溶解為清亮的

溶液，才能使用。

6. 吸附柱過載

不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若

用富集培養基，例如TB 或2×YT，菌液體積必須減少；若質粒或宿主菌是非常高

的拷貝數或生長率，則需調整LB培養液體積。

7. 質粒未全部溶解（尤其質粒較大時）

洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。

8. 乙醇殘留

漂洗液洗滌後應離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗後應晾乾樹脂，再加

入洗脫緩沖液。

9. 洗脫液加入位置不正確

洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫

效率。

10. 洗脫液不合適

DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB (10 mM Tris?Cl, pH 8.5)

或水。洗脫效率取決於pH值。最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當用水洗脫時確保

其pH值在此范圍內，如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫

緩沖液加熱至60℃後使用有利於提高洗脫效率。

11. 洗脫體積太小

洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產品濃度降

低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

12. 洗脫時間過短

洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置一分鍾可達到較好的效果。

(十三) 質粒純度不高？

1. 混有蛋白

不要使用過多菌體。溶液P1、P2、P3處理並離心後溶液應為澄清的，如果還混有

微小蛋白懸浮物，可再次離心去除後再進行下一步驟。

2. 混有RNA

RNase A處理不徹底，請減少菌體用量或加入溶液P3之後室溫放置一段時間。如

果溶液P1已保存6個月以上，請在溶液P1中添加RNase A。

3. 混有基因組DNA

加入溶液P2和P3後應溫和混勻，如果劇烈振盪，可能把基因組DNA剪切成碎片從

而混雜在質粒中。如果加入溶液P2後過於粘稠，無法溫和混勻，請減少菌體用

量。細菌培養時間過長會導致細胞和DNA的降解，不要超過16 小時。

4. P3溶液加入時間過長

P3溶液加入後，放置時間不要太長，否則有可能會產生小片段DNA污染。

5. 含大量核酸酶的宿主菌

宿主菌含大量核酸酶，在質粒提取過程中降解質粒DNA，影響提取質粒DNA的完

整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和Top10。

6. 裂解時間過長

加入溶液P2後裂解時間不應超過5分鍾。

7. 質粒的二聚體和多聚體形式

質粒復制過程中形成的，與宿主菌相關，電泳可檢測出。