細胞周期研究方法

⑴ 如何在觀察根尖分生組織細胞的有絲分裂計算細胞周期

細胞周期中每個時期分別所經歷的時間長短，
每一時期的時間=細胞周期x每一時期的細胞數占計數細胞總數的比例

實驗目標
1、初步掌握製作根尖細胞有絲分裂裝片的技術。
2、觀察植物細胞有絲分裂的過程，識別分裂的不同時期。
3、初步掌握繪制生物圖的方法。

實驗原理
細胞的有絲分裂是一個連續動態的變化過程，但可以通過它的形態變化，特別是細胞核中的染色體行為，人為地劃分階段，並進行比較研究。在自然狀態下，一大群處於各個分裂期的細胞混雜在一起。必須仔細觀察，尋帶瞎找有絲分裂過程各期典型形態特徵的細胞，從而建立起細胞周期的概念。植物的分生組織（如根尖分生區、莖尖生長點等）細胞，能夠通過有絲分裂增加其數目。依據植物細胞分裂周期中各個時期細胞中染色質或染色體的形態、數目、位置變化，確定該細胞所處的時期。為了看清染色體或染色質，要用鹼性染料將其染色。

實驗材料
蠶豆、蒜和蔥的根尖。

試劑儀器
洋蔥鱗莖，鑷子，刀片，培養皿，載玻片，蓋玻片，滴管，紗布，吸水紙，酒精燈，顯微鏡；固定液，15%鹽酸，醋酸洋紅染液，95%乙醇。

方法步驟
1、嫌洞洋蔥根尖的培養
（1）培養洋蔥生根時，避免用新採收的洋蔥，因它尚在休眠不易生根。如果必須用當年剛採收的新洋蔥培養生根，則應設法打破它的休眠。常用的方法是用低濃度的赤黴素溶液浸泡洋蔥底盤，這樣可以促使其生根。培養過程中，注意每天至少換水一次，以防爛根。
（2）對於頭年收下的洋蔥，可以採用如下方法促使它生根：
①選擇底盤大的洋蔥作生根材料。
②剝去外層老皮，用刀削去老根（從底盤中央向四周削），注意不要削掉四周的「根芽」。
③用燒杯裝滿清水，放上洋蔥，放置在光照處。水要保持清潔，注意每天換水l～2次。一般2～3d即可獲得實驗所需材料（根長5cm）。
（3）固定時間取材。洋蔥根尖細胞有絲分裂的時間是有規律的。通常在每天上午10時至下午2時分裂活躍，尤其以下午2時最活躍，可在這時取材。可以把培養好的洋蔥根用卡洛氏固定液固定起來備用。因為培養一次洋蔥根不容易。
2、解離。用刀片切下長約2～3mm的根尖，放入盛有15%鹽酸和體積分數為95%的酒精溶液的混合液（1︰1）的培養皿中，解離3～5min，使根尖組織的細胞相互分開，待根尖透明酥軟即停止解離。如果要使解離加快，可以把培養皿放在酒精燈上微微加熱（不可煮沸）3～5 min。待根酥軟後，用鑷子取出。解離充分是實驗成功的必備條件；解離的目的是用葯液溶解細胞間質，使組織細胞相互分離開。
3、漂洗。把取出的根尖放入清水漂洗約10min，也可以在培養皿口上蒙上—層紗布，用自來水細小的水流漂洗3～5min。漂洗的目的是洗去根中多餘的解離液。如果不把多餘的解離液洗去，一方面會影響染色效果，因為解離液中含有HCl溶液，而用來染色的染料呈鹼性；另一方面還會腐蝕顯微鏡的鏡頭。
4、染色。把漂洗好的根尖置於載玻片上，用鑷子頭截下長約3mm的根尖，其餘部分丟棄，在根尖上滴一滴醋酸洋紅染液染色3～5min，如果要使染色加快，可把載玻片在酒精燈的火焰上快速過幾下（不可煮沸）。
5、裝片。在染好色的材料上蓋上蓋玻片，上面再覆一片載玻片，用拇指輕輕壓一下，使根尖組織成為均勻薄層的細胞層。
6、鏡檢
（1）低倍鏡觀察
把製成的洋蔥根尖裝片先放在低倍鏡下觀察，慢慢移動裝片，找到分生區細胞，其特點是：細胞呈正方形，排列緊密，有的細胞正在分裂。
（2）高倍鏡觀察
找到分生區細胞後，把低倍鏡移走，換上高倍鏡，用細准焦螺旋和反光鏡把視野調整清晰，直到看清細胞物像為止。
（3）仔細觀察
仔細觀察的目的是區芹行枯分細胞分裂中各個時期內染色體變化的特點。可先找出處於細胞分裂中期的細胞，然後再找出前期、後期、末期的細胞，處於間期的細胞數目最多，最容易找到。
（4）在一個視野里，往往不容易找全有絲分裂過程中各個時期的細胞。如果是這樣，可以慢慢地移動裝片，從鄰近的分生區細胞中尋找。
7、繪圖。在仔細觀察清楚有絲分裂各個時期的細胞的以後，繪出洋蔥根尖細胞有絲分裂的簡圖。

注意事項
1、培養產生洋蔥根尖的材料是洋蔥鱗莖。鱗莖底部接觸水，不能離開水，也不能被水淹。其目的是同時滿足其對水和空氣的需要。同時要經常換水，因為水中由於微生物的活動和根細胞的活動，代謝產物增多；此外，還由於根細胞的呼吸不斷產生CO2，使水中H2CO3增多，氧氣缺少；微生物，如細菌的大量繁殖也使水質受到污染，這些都不利於根尖生長，所以要經常換水。—般一天至少一次，還要提供適宜的溫度。
2、剪取洋蔥根尖材料時，應該在洋蔥一天之中分裂最活躍的時間，一般在上午11點左右。如果因氣溫影響或不在—上述時間做實驗的話，可以在細胞有絲分裂最盛時取材，放人盛有固定液的培養皿中固定，即浸泡半天到一天。固定後用75%乙醇沖洗幾次，再放入盛有70%乙醇的小廣口瓶中保存。注意要等根尖長到l～5cm時才能切取，而切取的洋蔥根尖長度是2～3mm。根據實驗得知，根長到1～5cm時，根的長勢最佳，此時細胞分裂最旺盛，容易找到不同時期的分裂圖象。此時可取生長健壯的根進行觀察，切取洋蔥根尖2～3mm，這個長度要從根的頂端（根冠）開始算起，這個長度已將分生區包括了進來。若取材過長，在低倍鏡下尋找分生區就會很困難。
3、根尖培養好以後，裝片製作是否成功，關鍵的步驟是解離。15%的鹽酸溶液能溶解細胞壁之間的中層物質（胞間質），使組織中的細胞相互分開。否則，在顯微鏡下觀察時，細胞將發生重疊現象，導致實驗失敗。解離不充分，細胞重疊；解離過度，細胞會腐爛，所以解離要適度。為達到這一目的，配製的鹽酸濃度要適宜，切取的根尖應立即放入15%的鹽酸中，在室溫下解離10～15min。解離時間要視室內溫度而定，溫度低，時間稍長，溫度高，時間短。也可手拿鑷子，輕輕按正在解離的根尖，感覺酥軟即可。
4、漂洗的目的是洗去根中多餘的解離液。如果不把多餘的解離液洗去，一方面會影響染色效果，因為解離液中含HCl，而用染色的染料呈鹼性；另一方面還會腐蝕顯微鏡的鏡頭。
5、染色時，染色液的濃度和染色時間必須掌握好。特別是染色不能過深，否則鏡下一片紫色，無法觀察。也不能過淺，否則染色質和染色體的形態和數目不易辨清。
6、製片時，一方面要用鑷子把洋蔥根尖弄碎，另一方面要壓片，這樣可以使細胞分散開來。壓片時，在蓋玻片上再加一片載玻片的目的，一是避免壓碎和移動蓋玻片。二是使壓力大小適中，從而使組織細胞均勻分散。同時用力必須恰當，過重時會將組織壓爛，過輕則細胞未分散開，二者都將影響觀察。
7、結果與討論
在顯微鏡的一個視野中看到的細胞，多數處於細胞有絲分裂的間期，因為在一個細胞周期中，間期所佔的時間占整個細胞周期的90%一95%，時間與細胞數目成正比。另外，在一個視野中，往往不容易找全有絲分裂過程中各個時期的細胞，可以慢慢地移動裝片，從鄰近的分生區細胞中尋找。
拓展：有絲分裂（mitosis），又稱做間接分裂，由W. Fleming於1882年首次發現於動物及E. Strasburger（1880）年發現於植物。特點是有紡錘體染色體出現，子染色體被平均分配到子細胞，這種分裂方式普遍見於高等動植物（動物和高等植物）。是真核細胞分裂產生體細胞的過程。動物細胞（低等植物細胞）和高等植物細胞的有絲分裂是不同的。
分裂間期
有絲分裂間期分為G1（DNA合成前期）、S（DNA合成期）、G2（DNA合成後期） 三個階段，其中G1期與G2期進行RNA（即核糖核酸）的復制與有關蛋白質的合成，S期進行DNA的復制；其中，G1期主要是染色體蛋白質和DNA解旋酶的合成，G2期主要是細胞分裂期有關酶與紡錘絲蛋白質的合成。在有絲分裂間期，染色質沒有高度螺旋化形成染色體，而是以染色質的形式進行DNA（即脫氧核糖核酸）單鏈復制。有絲分裂間期是有絲分裂全部過程重要准備過程，是一個重要的基礎工作。（現代醫學，利用有關葯物，制止了細胞中的紡錘絲的形成，從而抑制了細胞的有絲分裂，使細胞分裂停止於G0（G0階段指因某些因素使細胞分裂停止，改變外因可使細胞重新進行分裂的時期）階段，利用該技術的有關葯物有效地遏制了癌細胞的惡性增殖和擴散。）

分裂期
前期 （prophase）
自分裂期開始到核膜解體為止的時期。間期細胞進入有絲分裂前期時，細胞核的體積增大，由染色質構成的細染色線螺旋纏繞並逐漸縮短變粗，形成染色體。因為染色質在間期中已經復制，所以每條染色體由兩條染色單體組成，即兩條並列的姐妹染色體，這兩條染色單體有一個共同的著絲點連接。核仁在前期的後半期漸漸消失。在前期末核膜破裂，於是染色體散於細胞質中。動物細胞有絲分裂前期時靠近核膜有兩個中心體。每個中心體有一對中心粒和圍繞它們的亮域，稱為中心質或中心球所組成。由中心體放射出星體絲（又叫紡錘絲），即放射狀微管。帶有星體絲（紡錘絲）的兩個中心體逐漸分開，移向相對的兩極（圖1）。這種分開過程推測是由於兩個中心體之間的星體絲（紡錘絲）微管相互作用，更快地增長，結果把兩個中心體（兩對中心粒）推向兩極，而於核膜破裂後終於形成兩極之間的紡錘體。
前中期
自核膜破裂起到染色體排列在赤道面上為止。核膜的斷片殘留於細胞質中，與內質網不易區別，在紡錘體的周圍有時可以看到它們。前中期的主要過程是紡錘體的最終形成和染色體向赤道面的運動。紡錘體有兩種類型：一為有星紡錘體，即兩極各有一個以一對中心粒為核心的星體，見於絕大多數動物細胞和某些低等植物細胞。一為無星紡錘體。兩極無星體，見於高等植物細胞。曾經認為有星紡錘體含有三種紡錘絲，即三種微管。一種是星體微管，由星體散射出的微管；二是極微管，是由兩極分別向相對一級方向伸展的微管，在赤道區來自兩極的極微管互相重疊。認為極微管可能是由星體微管伸長形成的。三是著絲點微管，與著絲點聯結的微管，亦稱著絲點絲或牽引絲。著絲點是在染色體的著絲粒的兩側發育出的結構。有報告說著絲點有使微管蛋白聚合成微管的功能。無星紡錘體只有極微管與著絲點微管。
核膜破裂後染色體分散於細胞質中。每條染色體的兩條染色單體其著絲點分別通過著絲點與兩極相連。由於極微管和著絲微管之間的相互作用，染色體向赤道面運動。最後各種力達到平衡，染色體乃排列到赤道面上。
中期 （metaphase）
從染色體排列到赤道板上，到它們的染色單體開始分向兩極之前，這段時間稱為中期。有時把前中期也包括在中期之內。中期染色體在赤道面形成所謂赤道板。從一端觀察可見這些染色體在赤道板呈放射狀排列，這時它們不是靜止不動的，而是處於不斷擺動的狀態。中期染色體濃縮變粗，顯示出該物種所特有的數目和形態。因此有絲分裂中期適於做染色體的形態、結構和數目的研究，適於核型分析。中期時間較長。
後期 （anaphase）
每條染色體的兩條姊妹染色單體分開並移向兩極的時期。分開的染色體稱為子染色體。子染色體到達兩極時後期結束。染色單體的分開常從著絲點處開始，然後兩個染色單體的臂逐漸分開。當它們完全分開後就向相對的兩極移動。這種移動的速度依 細胞種類而異，大體上在0.2～5微米/分。平均速度約為為 1微米/分。同一細胞內的各條染色體都差不多以同樣速度同步地移向兩極。子染色體向兩極的移動是靠紡錘體的活動實現的。
末期 （telophase）
從子染色體到達兩極開始至形成兩個子細胞為止稱為末期。此期的主要過程是子核的形成和細胞體的分裂。子核的形成大體上是經歷一個與前期相反的過程。到達兩極的子染色體首先解螺旋而輪廓消失，全部子染色體構成一個大染色質塊，在其周圍集合核膜成分，融合而形成子核的核膜，隨著子細胞核的重新組成，核內出現核仁。核仁的形成與特定染色體上的核仁組織區的活動有關。 細胞體的分裂稱胞質分裂。動物和某些低等植物細胞的胞質分裂是以縊束或起溝的方式完成的。縊束的動力一般推測是由於赤道板的細胞質周邊的微絲收縮的結果。微絲的緊縮使細胞在此區域產生縊束，縊束逐漸加深使細胞體最後一分為二。高等植物細胞的胞質分裂是靠細胞板的形成。在末期，紡錘絲首先在靠近
兩極處解體消失，但中間區的紡錘絲保留下來，並且微管增加數量，向周圍擴展，形成桶狀結構，稱為成膜體。與形成成膜體的同時，來自內質網和高爾基器的一些小泡和顆粒成分被運輸到赤道區，它們經過改組融合而參加細胞板的形成。細胞板逐漸擴展到原來的細胞壁乃把細胞質一分為二（右圖）。細胞質中的有關細胞器，如線粒體，葉綠體等不是均等分配，而是隨機進入兩個子細胞中。細胞板由兩層薄膜組成，兩層薄膜之間積累果膠質，發育成胞間層，兩側的薄膜積累纖維素，各自發育成子細胞的初生壁。

動植物比較

不同
動物細胞有絲分裂的過程，與植物細胞的基本相同，不同的特點是：
1.動物細胞有中心體，在細胞分裂的間期，中心體的兩個中心粒各自經過中心粒復制新的中心粒，因而細胞中有兩組中心粒。在細胞分裂的過程中，兩組中心粒分別移向細胞的兩極。在這兩組中心粒的周圍，發出無數條星射線,兩組中心粒之間的星射線形成了紡錘體。
2.動物細胞在有絲分裂間期中心體復制，植物細胞中心體則沒有復制。（高等植物沒有中心體）
3.植物細胞分裂末期，在赤道板部位出現細胞板，並由中央向周圍擴展形成細胞壁。動物細胞分裂末期，赤道板處細胞膜向內凹陷，縊裂成兩個細胞。
有絲分裂的重要意義，是將親代細胞的染色體經過復制（實質為DNA的復制）以後，精確地平均分配到兩個子細胞中去。由於染色體上有遺傳物質DNA，因而在生物的親代和子代之間保持了遺傳性狀的穩定性。可見，細胞的有絲分裂對於生物的遺傳有重要意義。

相同
動物細胞有絲分裂的過程與植物細胞的分裂過程存在一個十分重要的相同點：
無論是動物細胞分裂過程還是植物細胞分裂過程都會有染色體的出現和紡錘體的形成。（植物：無星射線紡錘體；動物：星射線紡錘體）。染色體復制後平均分配。

⑵ 細胞周期通路

一般而言， 細胞周期可以分為四個時相： G1(DNA 合成前期)； S 期（ DNA 合成期） ； G2 期（ DNA 合成後期） 和 M 期（ 有絲分裂期） 。 有知陪些學者把某些從G1 期退出細胞周期但是仍然存活， 在適當刺激後還能再次進入細胞周期的一類細胞， 稱為G0 期。 所以如果把 G0 期細胞也算上， 細胞周期可以分為 5 個時相。 在實際的研究工作中，為了簡化細胞周期， 也常常根據染色體的倍數進行分類： G0/G1 期細胞因為在 DNA 復制過程之前， 因此細胞內染色體是二倍體（ 2N） ； S 期細胞正在進行 DNA 的復制， 但是整個DNA 復制的過程並沒有全部完成， 因此細胞內染色體介於二倍體和四倍體之間； G2/M 期的細胞已經完成了 DNA 復制過程， 因此細胞內染色體是四倍體（4N） 。 所以如果根據染色體的倍數進行分類， 細胞周期的時相可以分為： G0/G1 期、 S 期和 G2/M 期三個時相。

1） 是 G1/S 期檢查點； 2） 是 G2/M期檢查點。

整個過程的精準調控。
Cyclin 和 CKI 都能調控 CDK， 但是 Cyclin 正向調控 CDK； 而 CKI負向調控 CDK。G1 期主要表達的 Cyclin 分子是 Cyclin D 和 Cyclin E。Cyclin D 可以和 CDK4或者 CDK6 相互結合； Cyclin E 主要和 CDK2 相互結合。 S 期主要表達 Cyclin A， 它也是和CDK2 相互結合。 M 期主要表達 Cyclin B， 它主要和 CDK1 相互結合。 CKI 可以分為兩類 Ink4（代表分子： p16、 p 15、 p18 和 p19） ； 另一類是 KIP（包括 p21， p27 和 p57） 。

在 Rb 調控通路中，生長因子慧春結合相應的受體， 促進 Cyclin 表達； Cyclin 與相應 CDK 結合形成復合物， 促進
Rb 蛋白磷酸化， 磷酸化的 Rb 釋放核轉錄因子 E2F， 游離的 E2F 進入核內， 促進下游基因的轉錄表達。 在 p53 調控通路中， p53 主要在 G1 檢查點上發揮重要作用。 最常見的作用機制和通路是： p53 可作為轉錄因子結合到 p21 的啟動子區域並激活 p21 基因轉錄。 當細胞DNA 受損後， p21 基因在 p53 誘導下表達水平升高， 抑制 CDK 活性， 阻止細胞從 G1 期進入 S 期， 使細胞停止於 G1 期。

1） 檢測細胞周期相關的明星分子（例如： Cyclin、 CDK、CKI 以及相應的信號通路中的明星核心分前猛耐子） ； 2） 是通過 PI 染色實驗， 採用流式細胞儀檢測細胞周期的變化。

⑶ 細胞周期測定實驗有哪些，怎麼做

細胞計數法

實驗方法原理： 體外培養細胞生長、分裂繁殖的能力，可用分裂指數來表示。它與生長曲線有一定的聯系，如隨著分裂指數的不斷提高，細胞也就進入了指數生長期。

分裂指數指細胞群體中分裂細胞所佔的百分比，它是測定細胞周期的一個重要指標，也是不同實驗研究選擇細胞的重要依據。

實驗步驟：

一、消化細胞，將細胞懸液接至內含蓋玻片的培養皿中。

二、CO2培養箱中培養48小時，使細胞長在蓋片上。

三、取出蓋片，按下列順序操作：

PBS漂洗3分鍾→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分鍾→Giemsa液染色10分鍾→自來水沖洗。

四、蓋片晾乾後反扣在載玻片上，鏡檢。

五、計算

分裂指數=分裂細胞數/總細胞數×100%

BrdU參入法

實驗方法原理： 細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。

單個細胞的周期測定可採用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多採用其他方法測群體周期。

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養基後，可做為細胞DNA復制的原料，經過兩個細胞周期後，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將佔1/2，反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經歷了三個周期，則染色體中約一橡鬧半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。

一、試劑配製

二、細胞生長至指數期時，向培養液中加入BrdU，使最終濃度為10 μg/ml。

三、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1 μg。

四、48小時後常規消化細胞至離心管中，注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。

五、常規染色體製片。

六、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6 cm處紫外照射30分鍾。

七、棄去2×SSC液，流水沖洗。

八、Giemsa液染色10分鍾，流水沖洗，晾乾。

九、鏡檢100個分裂相，計第一、二、三、四細胞期分裂指數。

十、計算

細胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時）

細胞周期 （cell cycle) 是指細胞從前一次分裂結束起到下一次分裂結束為止的活動過程，分為間期與分裂期兩個階段。

1.間期

間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成後期（G2期）。

（1）G1期

此期長短因細胞而異。體內大部分細胞在完成上一次分裂後，分化並執行各自功能，此G1期的早期階段特稱G0期。在G1期的晚期階段，細胞開始為下一次分裂合成DNA所需的前體物質、能量和酶類等。

（2）S期

S期是細胞周期的關鍵時刻，DNA經過復制而含量增加一倍，使體細胞成為4倍體，每條染色質絲都轉變為由著絲點相連接的兩條染色質絲。與此同時，還合成組蛋白，進行中心粒復制。S期一般需幾個小時。

（3）G2期

為分裂期做最後准備。中心粒已復制完畢，形成兩個中心體，還合成RNA和微管蛋白等。G2期比較恆定，需用1～1.5小時。

2.分裂期

細胞的有絲分裂（mitosis）需經前、中、後，末期，是一個連續變化過程梁慶罩，由一個母細胞分裂成為兩個子細胞。一般需1～2小時。

（1）前期（prophase） 染色質絲高度螺旋化，逐漸形成染色體（chromosome）。染色體短而粗，強嗜鹼性。兩個中心體向相反方向移動，在細胞中形成兩極；而後以中心粒隨體為起始點開始合成微管，形成紡錘體。隨著核仁相隨染色質的螺旋化，核仁逐漸消失。核被膜開始瓦解為離散的囊泡狀內質網。

（2）中期（metaphase） 細胞變為球形，核仁與核被膜已完全消失。染色體均移到細胞的赤道平面，從紡錘體兩極發出的微管附著於每一個染色體的著絲點上。從中期細胞可分離得到差做完整的染色體群，共46個,其中44個為常染色體,2個為性染色體。男性的染色體組型為46，XY，女性為46,XX。分離的染色體呈短粗棒狀或發夾狀，均由兩個染色單體借狹窄的著絲點連接構成。

（3）後期（anaphase） 由於紡錘體微管的活動，著絲點縱裂，每一染色體的兩個染色單體分開，並向相反方向移動，接近各自的中心體，染色單體遂分為兩組。與此同時，細胞波拉長，並由於赤道部細胞膜下方環行微絲束的活動，該部縮窄，細胞遂呈啞鈴形。

（4）末期（telophase） 染色單體逐漸解螺旋，重新出現染色質絲與核仁；內質網囊泡組合

為核被膜；組胞赤道部縮窄加深，最後完全分裂為兩個2倍體的子細胞。

在體內根據細胞的 分裂能力 可把它們分為三類：

①增殖細胞群 ，如造血幹細胞，表皮與胃腸粘膜上皮的幹細胞。這類細胞始終保持活躍的分裂能力，連續進入細胞周期循環。

②不再增殖細胞群 ，如成熟的紅細胞、神經細胞、心肌細胞等高度分化的細胞，它們喪失了分裂能力，又稱終末細胞（end cell）。

③暫不增殖細胞群 ，如肝細胞、腎小管上皮細胞、甲狀腺濾泡上皮細胞。它們是分化的，並執行特定功能的細胞，在通常情況下處於G0期，故又稱G0期細胞。在某種刺激下，這些細胞重新進入細胞周期。如肝部分切除術後，剩餘的肝細胞迅速分裂。

流式細胞儀

實驗方法原理： 流式細胞儀的工作原理是將待測細胞放入樣品管中，在氣體的壓力下進入充滿鞘液的流動室。在鞘液的約束下細胞排成單列由流動室的噴嘴噴出，形成細胞柱。通過對流動液體中排列成單列的細胞進行逐個檢測，得到該細胞的光散射和熒光指標，分析出其體積、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等物理及化學特徵。

細胞內的DNA含量隨細胞周期進程發生周期性變化，如G0/G1期的DNA含量為2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI標記的方法，通過流式細胞儀對細胞內DNA的相對含量進行測定，可分析細胞周期各時相的百分比。

實驗步驟：

一、取對數生長期細胞，倒去培養液，胰酶適度消化細胞，用培養液吹打，800 rpm，離心15 min去上清。

二、PBS洗2次，加0.5 mLPBS吹勻，務必吹散。

三、用5 mL注射器將細胞吸起，用力打入5 mL 70%(預冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定過夜（可長至2周）。

四、800 rpm 15 min收集固定細胞，PBS洗2次。

五、用0.4 mLPBS重懸細胞並轉至Tube中輕輕吹打（防止細胞破碎）。

六、加RNase-A約3 μL至終濃度約為50μg/mL ，37℃水浴消化30 min；

七、加PI約50 μL至終濃度約為65μg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。

八、用300目（孔徑40~50微米）尼龍網過濾，上機檢測。

九、樣品分析測定及列印。

常見問題

1.Q：胃粘膜組織的DNA含量及倍體檢查，取材後要等幾個星期才會做流式細胞術檢查，請問：胃組織要怎樣保存好呢？用低溫保存，還是用乙醇固定？或者固定後再低溫下保存？

A：以乳腺細胞的DNA含量測定為例，取得組織以後，先處理成單細胞懸液，然後再加70%冰乙醇固定，要保證冰乙醇的最終濃度為50%，這樣固定的細胞懸液可以至少保存12小時，最多可保存一個月，上機檢測前再加PI綜合染液。保存了將近三個星期，結果還可以，變異系數為5%.

2.PI分析細胞周期及凋亡率相關問題

Q： （1）所用的RNAs酶用什麼配製呢？用PBS配嗎？

A：RNaseA用PBS配製沒有問題，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。

Q： （2）測細胞周期和凋亡率時都要用RNAs酶，可以一起檢測嗎？

A：用流式細胞儀測定時細胞周期和凋亡率是同時測定。

Q： （3）Triton－x－100是固定劑吧，用了70％的冷乙醇（是4℃嗎？），是不是就不用Triton－x－100固定了？

A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定劑，可以用75％的乙醇於-20度固定。

Q： （4）還要設什麼內參標准（5％雞紅細胞）嗎？

A：對照肯定是需要的，這個根據自己的需要進行設置。

3.Q：流式檢測細胞周期時加RNA酶所需的溫度？

A：其實有關RNA酶在凋亡檢測制樣過程中使用的必要性問題尚有人持不同意見，該觀點的人認為RNA酶在環境中無所不在，常規制樣過程中所接觸的試劑和環境中的RNA酶已足以降解樣品中的RNA，所以為了簡便實驗操作，也有人不加RNA酶或如你所參考的方法將其與PI染液一起使用。不過經典的方法還是「先加RNA酶37度孵育30min，然後加PI

  4度孵育30min」。至於染色時使用4度，是因為低溫可減弱分子運動，增強熒光染料結合的穩定性和減少可能的熒光損耗。

4.Q：腫瘤細胞測周期。70％乙醇是否必須用PBS和乙醇配，用水配細胞會碎裂，PBS和乙醇配會出現絮狀物？上流式前細胞用75％乙醇固定，使用瓶裝75％乙醇是否可行？

A：先用冷PBS懸浮細胞，大約1-2ml，充分懸浮，使細胞充分分散成單細胞。之後緩慢加入無水乙醇，終濃度為70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇會導致細胞團聚的現象，很難重懸成單細胞。乙醇固定之後沒有細胞沉澱。

5.Q：流式分析細胞周期，收集了10的6次方細胞，但細胞在乙醇固定之後，還看到有細胞沉澱的，但PBS洗滌兩次之後，就基本沒什麼細胞沉澱了，上機發現看不到細胞了。這是怎麼回事啊？怎麼解決這個問題啊？

A：很可能是洗細胞的過程中丟失了，解決辦法有：

（1）盡量採用尖底的離心管和水平離心機

（2）離心後盡量用吸管吸取上清，不要傾倒；吸上清時最好殘留1mm左右的水膜，不要吸完。

（3）離心的轉速或時間可稍微增加一點兒

（4）每次加抗體時，吸頭最好不要接觸液面；混勻時最好不要用吸頭吹打，以免吸頭掛壁帶走部分細胞。

⑷ 在研究細胞周期時，可以用BrdU進行標記．將細胞置於含有BrdU的某種培養基中培養，當細胞的DNA復制時，Brd

（1）根據題意分析，若觀察到置於含有BrdU的某種培養基中培養的細胞中所有染色體上的兩條姐妹染色單體著色深，說明每條染色單體的DNA兩條鏈中只有一條鏈中具有BrdU，另一條鏈中肯定沒有BrdU．染色體復制一次，則該細胞正處於第一指或個細胞周期的中期．
（2）若細胞中的所有染色體上的兩條姐妹染色單體一條著色深、一條著色淺，說明一條染色單體的DNA兩條鏈中只有一條鏈中具有BrdU，另一條鏈中肯定沒有BrdU．另一條染色單體的兩個DNA兩條鏈都具有BrdU，此時細胞每條染色體中有3條脫氧核苷酸鏈含有BrdU，染色體復制兩次．
（3）姐妹染色單體之間的交換發生在減數分裂，對於四分體中的一對同源染色體A、B，我們不妨設A的兩條染色單體是a1、a2，其中a2中含有BrdU；B的兩條染色單體是b1、b2，其中b1、b2中都含有BrdU．且兩者之間發生部分基因的交換，交換後會出現染色體上著色深的染色單體中含有著色淺的染色單體片段，著色淺的染色肢逗脊單體中含有著色深的染色單歷滲體片段．
（4）癌細胞是不斷分裂細胞，記憶細胞在受到抗原刺激後能迅速增殖分化，叫暫不增殖細胞，效應T細胞是不再分裂的細胞；
（5）①雞成纖維細胞在體外培養時進行的是有絲分裂，B組實驗說明了37℃時tsRSV基因組中的癌基因能表達致癌．
②DNA雜交利用鹼基互補配對原則，些高度相似的序列在正常情況下與細胞的分裂分化有關，叫做原癌基因．
故答案為：
（1）一
（2）二32
（3）染色體上著色深的染色單體中含有著色淺的染色單體片段，著色淺的染色單體中含有著色深的染色單體片段
（4）①③②
（5）①有絲分裂37℃時tsRSV基因組中的癌基因能表達致癌
②鹼基互補配對原則原癌基因

⑸ 細胞周期的表示方法

細胞周期的表示方法：畫圖法。

細胞周期的重要性：

以有絲分裂方式增殖的細胞從一次分裂結束到下一次分裂結束所經歷的過程。這一過程周而復始。

細胞周期是50年代細胞學上重大發現之一。細胞生命活動大部分時間是在間期度過的，如大鼠羨盯角膜上皮細胞的細胞周期內，間期佔14000分鍾。分裂期僅佔70分鍾。細胞周期各階段都有復雜的生化變化。

間期是細胞合成DNA、RNA、蛋白質和各種酶的時期，是為細胞分裂准備物質基礎的主要階段。在這之前認為有絲分裂期是細胞增殖周期中的主要階段，而把處於分裂間期的細胞視為細胞的靜薯旅止階段。

細胞周期也受機體調節系統的影響，例如肝再生就是由調節系統的作用加速肝細胞增殖。但是腫瘤細胞，由於宿主失去對它的調控，因而惡性增殖。在腫瘤治療中可應用細胞周期的原理。

如G0期細胞對化療不敏感，往往成為日後癌症復發的根源，因而可通過調控機理的研究，誘發G0期癌細胞進入細胞周期，再合理用抗癌葯物加以殺滅，是防止癌轉移和擴散的重要調控措施，是細胞動力學中有理論意義和實踐意義的研究問題。

總之，至今所了解的細胞增殖調控的分子基礎還少，尚待進一步探索。

⑹ 細胞周期包括哪幾個階段

1、分裂間期有絲分裂間期分為G1（DNA合成前期）、S（DNA合成期）、G2（DNA合成後期） 三個階段，其中G1期與G2期進行RNA（即核糖核酸）的復制與有關蛋白質的合成，S期進行DNA的復制；其中，G1期主要是染色體蛋白質和DNA解旋酶的合成，G2期主要是細胞分裂期有關酶與紡錘絲蛋白質的合成。

在有絲分裂間期，染色質沒有高度螺旋化形成染色體，而是以染色質的形式進行DNA（即脫氧核糖核酸）單鏈復制。有絲分裂間期是有絲分裂全部過程重要准備過程，是一個重要的基礎工作。

2、細胞有絲分裂前期是指自分裂期開始到核膜解體為止的時期。

間期細胞進入有絲分裂前期時，細胞核的體積增大，由染色質構成的細染色線螺旋纏繞並逐漸縮短變粗，形成染色體。因為染色質在間期中已經復制，所以每條染色體由兩條染色單體組成，即兩條並列的姐妹染色體，這兩條染色單體有一個共同的著絲點連接。核仁在前期的後半期漸漸消失。在前期末核膜破裂，於是染色體散於細胞質中。

3、中期是指從染色體排列到赤道板上，到它們的染色單體開始分向兩極之間的時期。有時把前中期也包括在中期之內。

中期染色體在赤道面形成所謂赤道板。從一端觀察可見這些染色體在赤道板呈放射狀排列，這時它們不是靜止不動的，而是處於不斷擺動的狀態。中期染色體濃縮變粗，顯示出該物種所特有的數目和形態。因此有絲分裂中期適於做染色體的形態、結構和數答旁滲目的研究，適於核型分析。而且中期時間較長。

4、後期是指每條染色體的兩條姐妹染色單體分開並移向兩極的時期。在後期被分開的染色體稱為子染色體。子染色體到達兩極時後期結束。染色單體的分開常從著絲點處開始，然後兩個染色單體的臂逐漸分開。當它們完全分開後就向相對的兩極移動。

5、末期是指從子染色體到達兩極開始至形成兩個子細胞為止的時期。此期的主要過程是子核的形成和細胞體的分裂。

子核的形成大體上是經歷一個與前期相反的過程。到達兩極的子染色體首先解螺旋而輪廓消失，全部子染色體構成一個大染色質塊，在其周圍集合核膜成分，融合而形成子核的核膜，隨著子細胞核的重新組成，核內出現核仁。核仁的形成與特定染色體上的核仁組織區的活動有關。

(6)細胞周期研究方法擴展閱讀：

分裂具有周期性，即連續分裂的細胞，從一次分裂完成時開始，到下一次分裂完成時為止，從形成子細胞開始到再一次形成子細胞結束（下圖）為一個細胞周期。一個細胞周期包括兩個階段：分裂間期和分裂期。

分裂間期分G1、S和G2期，分裂間期為分裂期進行活躍的物質准備，完成DNA分子的復制和有關蛋白質的合成。

同時細胞有適度的生長（這兩個階段所佔的時啟櫻間相差較大，一般分裂間期大約占細胞周期的90%-95%；分裂期大約占細胞周期的5%-10%。細胞種類不同，一個細胞周期的時間也不相同。）

分裂期又分為分裂前期、分裂中期、分裂後期和分裂末期。細胞在分裂之前，必須進行一定的物質准備。細胞增殖包括物質准備和細胞分裂整個過程。有絲分裂是一個連續的過程按先後順序劃分為間期、前期、中期、後期和末期五個時期，在前期和中期之間有時還劃分出一個前中期。

與有絲分裂有關的細胞器

中心體——與紡錘體的形成有關；

線粒體——與提供能量有關 ；

高爾基體——與植物新形成的細胞壁有關；

核糖體——與全過程清脊需要的蛋白質合成有關，主要與間期進行的DNA復制需要的蛋白質有關；

紡錘體——紡錘體是產生於細胞分裂前初期到末期的一個特殊細胞器。

紡錘體的形成

由微管蛋白聚合成紡錘體微管的過程。微管蛋白的聚合有兩種基本形式：一種是自我裝配型，另一種是位點起始裝配型，後者有特殊位點做為聚合的起始部位，前者沒有這種特殊位點。

形成紡錘體時的位點統稱為「微管組織中心」(MTOC)。中心體和著絲點都是MTOC，它們在離體情況下都能表現出使微管蛋白聚合成微管的能力。紡錘體的形成顯然和這些MTOC的活動是分不開的。

參考資料來源：網路-有絲分裂

⑺ 細胞周期是如何調控的

細胞周期運檔簡族轉的調控研究中，細胞周期蛋白（cyclin）家族和周期蛋白依賴激酶（cdk）家族發揮了重要作用。
cdks和cyclins結合形成異源二聚行弊體的復合物，具有蛋白激酶活性。cdk是催化亞基，cyclin是調節亞基。只有與相應的cyclin結合後，在一些蛋白激酶和磷酸酶參與下經過磷酸化和去磷酸化作用，cdk才能表現出激酶活性。cdk-cyclin復合物可參與磷酸化多種咐如蛋白、調節與dna復制和有絲分裂等有關的分子事件。
希望能幫到那你！

⑻ 探究細胞周期實驗的要點

細胞周期(cell cycle)是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。
生命是從一代向下一代傳遞的連續過程，因此是一個不斷更新、不斷從頭開始的過程。細胞的生命開始於產生它的母細胞的分裂， 結束於它的子細胞的形成，或是細胞的自身死亡。通常將子細胞形成作為一次細胞分裂結束的標志，細胞周期是指從一次細胞分裂形成子細答改胞開始到下一次細胞分裂形成子細胞為止所經歷的過程。在這一過程中，細胞的遺傳物質復制並均等地分配給兩個子細胞。
（一） 間期

間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）清彎判與DNA合成後期（G2期）。

1. G1期（first gap）從有絲分裂到DNA復制前的一段時期，又稱合成前期，此期主要合成RNA和核糖體。該期特點是物質代謝活躍，迅速合成RNA和蛋白質，細胞體積顯著增大。這一期的主要意義在於為下階段S期的DNA復製作好物質和能量的准備。細胞進入G1期後，並不是毫無例外地都進入下一期繼續增殖，在此時可能會出現三種不同前景的細胞：①增殖細胞：這種細胞能及時從G1期進入S期，並保持旺盛的分裂能力。例如消化道上皮細胞及骨髓細胞等；②暫不增殖細胞或休止細胞：這類細胞進入G1期後不立即轉入S期，在需要時，如損傷、手術等，才進入S期繼續增殖。例如肝細胞及腎小管上皮細胞等；③不增殖細胞：此種細胞進入G1期後，失去分裂能力，終身處於G1期，最後通過分化、衰老直至死亡。例如高度分化的神經細胞、肌細胞及成熟的紅細胞等。

2. S期（synthesis）即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同時還要合成組蛋白。DNA復制所需要的酶都在這一時期合成。

3. G2期（second gap）期為DNA合成後期，是有絲分裂的准備期。在這一時期，DNA合成終止，大量合成RNA及蛋白質，包括微管蛋白和促成熟因子等。

（二）分裂期

M期：細胞分裂期。

細胞分裂期：前期，中期，後期，末期。

細胞的有絲分裂（mitosis）需經前、中、後，末期，是一個連續變化過程，由一個母細胞分裂成為兩個子細胞。一般需1～2小時。

1. 前期（prophase）染色質絲高度螺旋化，逐漸形成染色體（chromosome）。染色體短而粗，強嗜鹼性。兩個中心體向相反方向移動，在細胞中形成兩極；而後以中心粒隨體為起始點開始合成微管，形成紡錘體。隨著核仁相隨染色質的螺旋化，核仁逐漸消失。核被膜開始瓦解為離散的囊泡狀內質網。

2. 中期（metaphase）細胞變為球形，核仁與核被膜已完全消失。染色體均移到細胞的赤道平面，從紡錘體兩極發出的微管附著於每一個染色體的著絲點上。從中期細胞可分離得到完整的染色體群，共46個，其中44個為常染色體，2個為性染色體。男性的染色體組型為44+XY，女性為44+XX。分離的染色體呈短粗棒狀或發夾鬧悄狀，均由兩個染色單體借狹窄的著絲點連接構成。

3．後期（anaphase）由於紡錘體微管的活動，著絲點縱裂，每一染色體的兩個染色單體分開，並向相反方向移動，接近各自的中心體，染色單體遂分為兩組。與此同時，細胞波拉長，並由於赤道部細胞膜下方環行微絲束的活動，該部縮窄，細胞遂呈啞 鈴形。

4．末期（telophase）染色單體逐漸解螺旋，重新出現染色質絲與核仁；內質網囊泡組合為核被膜；細胞赤道部縮窄加深，最後完全分裂為兩個2倍體的子細胞。

G0期：暫時離開細胞周期，停止細胞分裂，去執行一定生物學功能的細胞所處的時期。

在體內根據細胞的分裂能力可把它們[1]分為三類：①周期性細胞，如造血幹細胞，表皮與胃腸粘膜上皮的幹細胞。這類細胞始終保持活躍的分裂能力，連續進入細胞周期循環；②終端分化細胞，如成熟的紅細胞、神經細胞等高度分化的細胞，它們喪失了分裂能力，又稱終末細胞（end cell）；③暫不增殖細胞群（G0期細胞），如肝細胞、腎小管上皮細胞、心肌細胞、甲狀腺濾泡上皮細胞。它們是分化的，並執行特定功能的細胞，在通常情況下處於G0期，故又稱G0期細胞。在某種刺激下，這些細胞重新進入細胞周期。如肝部分切除術後，剩餘的肝細胞迅速分裂。

周期作用折疊編輯本段
目前，科學家已發現有幾類調控因子在細胞周期中起著重要作用。一類是對細胞分裂增殖有調控作用的細胞生長因子。如第二類細胞周期調控因子，又稱內源性調節因子，是細胞內自己合成的蛋白質。

細胞周期調控機制的序幕已經拉開，科學家們正在從不同的角度研究細胞周期與癌基因、抑癌基因、生長因子以及細胞增殖分化的關系，相信通過努力，我們最終能找到控制細胞周期的神奇「開關」。在腫瘤治療中我們也可利用細胞周期的原理對症下葯。如G0細胞對化療不敏感，往往成為日後癌症復發的根源。因而可以設法誘導G0期癌細胞進入增殖周期再行殺滅。這是一個尚在探索中具有理論意義和實踐意義的問題。

相關檢測折疊編輯本段
Ⅰ、樣品准備准備以下一種或幾種樣品

A、組織單細胞懸浮液（如淋巴腺、脾、骨髓、胎盤細胞）
B、組織培養細胞

C、Ficoll-hypaque分離的單核細胞

Ⅱ、反應體系－DNA低滲緩沖液

檸檬酸三鈉 0.25g

Triton-X 100 0.75ml

Propidium iodide 0.025g

核糖核酸酶0.005g

蒸餾水250ml

我們將該DNA低滲溶液於密閉瓶子中存放數月後並無發現有任何染色活性的丟失

Ⅲ、染色

1、 每一個管子中放入1×106個細胞；

2、 樣品離心後盡可能完全地移去上清液，並且不要打碎沉澱塊；

3、 入1ml的DNA低滲染色（可用甲基綠進行染色）緩沖液至沉澱中，並混勻；

4、 樣品於4℃下避光30分鍾或最長不超過1個小時以備流式細胞儀分析。

注意：延長在低滲緩沖液的曝光時間會引起樣品碎片的增加。細胞周期檢測可以作為生物相容性評價指標，示例如下：應用體外細胞培養法，觀察不同質量分數羥基磷灰石浸提液對L-929細胞的細胞學形態的影響，同時採用MTT比色法評價羥基磷灰石對L-929生長和增殖的影響，流式細胞儀檢測羥基磷灰石浸提液對L-929細胞生長周期及凋亡的影響。結果表明，羥基磷灰石浸提液對體外培養的細胞形態無明顯影響，對細胞生長和增殖無明顯抑製作用；不同質量分數材料浸提液的細胞毒性為 0~1級，隨羥基磷灰石浸提液質量分數的升高，細胞凋亡率逐漸上升；50%、75%、100%羥基磷灰石浸提液組能明顯降低G0 /G1 期細胞比例，增加S,G2 /M期細胞比例，能增加L-929細胞DNA的合成，促進細胞生長和組織修復。細胞周期檢測是生物材料生物相容性評價的一種可靠方法和指標。

其他資料折疊編輯本段
細胞周期（細胞有絲分裂）口訣 折疊

以植物細胞有絲分裂為例：

有絲分裂分五段

間前中後末相連

間期首先作準備

間期染體復制在其間

前期 兩消兩現一散亂

中期 著絲點聚赤道板

後期 絲牽染體兩極走

末期 兩消兩現壁重建

註：動物細胞末期不生成細胞壁。

周期詳解 折疊

以有絲分裂方式增殖的細胞從一次分裂結束到下一次分裂結束所經歷的過程。這一過程周而復始。細胞周期是50年代細胞學上重大發現之一。在這之前認為有絲分裂期是細胞增殖周期中的主要階段，而把處於分裂間期的細胞視為細胞的靜止階段。1951 年霍華德等用P-磷酸鹽標記了蠶豆根尖細胞，通過放射自顯影研究根尖細胞DNA合成的時間間隔，觀察到P之摻入不是在有絲分裂期，而是在有絲分裂前的間期中的一段時間內。發現間期內有一個DNA合成期（S期），P只在這時才摻入到DNA;S期和分裂期（M期）之間有一個間隙無P摻入，稱為G2期，在M期和S期之間有另一個間隙稱為G1期，G1期也不能合成DNA。

於是他們提出了細胞周期的概念，並首先證明間期是細胞周期中極為重要的一個階段，發生著許多與細胞分裂有關的特殊生化事件。這一發現被以後學者們用H-胸腺嘧啶核苷進行的類似研究所證實。

細胞生命活動大部分時間是在間期度過的，如大鼠角膜上皮細胞的細胞周期內,間期佔14000分鍾。分裂期僅佔70分鍾。細胞周期各階段都有復雜的生化變化。間期是細胞合成DNA、RNA、蛋白質和各種酶的時期，是為細胞分裂准備物質基礎的主要階段。

在一個增殖的細胞群中，所有細胞並非是同步增殖的，它們在細胞周期運行中，可能有四種命運（圖1）：①細胞經M期又開始第二次周期；②停止於G2期，稱為G2期細胞（R2），它受某種刺激後可進入周期；③停止在G1期，稱為休止細胞或名G0期細胞，這類細胞受某種刺激仍能進入周期，並開始DNA合成和有絲分裂；④喪失生命力近於死亡的細胞，稱為丟失細胞，或稱不再分裂的細胞。繼續分裂的細胞沿著細胞周期從一個有絲分裂期到下一個分裂期。不再分裂的細胞離開了細胞周期不再分裂，最終死亡。

G1期 進行大量物質合成時期。細胞體積逐漸增大，製造RNA（包括tRNA，mRNA，rRNA以及核糖體等）。RNA的合成又導致結構蛋白和酶蛋白的形成，這些酶又控制著形成新細胞成分的代謝活動。G1又分為G1早期和G1晚期兩個階段；細胞在G1早期中合成各種在G1期內所特有的RNA和蛋白質，而在G1晚期至S期則轉為合成DNA復制所需要的若干前體物和酶分子，包括胸腺嘧啶激酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、脫氧胸腺嘧啶核苷酸合成酶等，特別是DNA聚合酶急劇增高。這些酶活性的增高對於充分利用核酸底物在S期合成DNA是不可少的條件。

G1期持續時間變異很大，多數細胞的G1期較長，是與細胞需要增加質量有關。但在某些單細胞生物如大變形蟲、四膜蟲和多細胞生物的某些細胞（如海膽胚胎，小鼠胚胎細胞）則無G1期，中國倉鼠卵巢細胞的變異株無G1和G2期，以致M期和S期連接在一起。G1期的長短之所以變化很大，與G1期內存在一個校正點或阻止點（簡稱R點）有關。R點主要控制 G1期時間的長短。通過了此點，細胞就能以正常速度不受外界條件的影響而完成細胞周期的其他時期。因此，有人認為細胞的生長是在G1期R點上停止的，例如當細胞內環腺苷酸（cAMP）水平增高，細胞密度增加時，可阻止細胞從G1期向S期過渡，用嘌呤黴素抑制蛋白質合成或用放射線菌素D抑制RNA合成，也能延緩細胞從G1期進入S期。有人發現 G1期內能合成一種有觸發作用的蛋白質；它是不穩定的，極易被分解，故稱為v蛋白。v蛋白在G1細胞中達到一定水平時，細胞便可通過R點進入S期。

G0期 細胞周期的調節主要是通過G1期的阻留而實現的，G0期即指細胞處於阻留的狀態。細胞通過M期一分為二，有的可繼續分裂進行周期循環，有的轉入G0期。G0期是脫離細胞周期暫時停止分裂的一個階段。但在一定適宜刺激下，又可進入周期（圖1），合成DNA與分裂。G0期的特點為：①在未受刺激的G0細胞，DNA合成與細胞分裂的潛力仍然存在;②當G0細胞受到刺激而增殖時，又能合成DNA和進行細胞分裂。

S期 在這一階段完成DNA的合成以及合成與DNA組裝構成染色質等有關的組蛋白。DNA含量在此時期增加一倍。S期終結時，每一染色體復製成兩個染色單體（Hole,1979）。生成的兩個子代DNA分子與原來DNA分子的結構完全相同。一個人體細胞核直徑10～20微米，其中DNA含量為10克，如拉成一根DNA鏈，長度可達3米。哺乳類動物細胞S期一般為6～8小時。DNA的復制能在幾小時內完成，主要是由於DNA鏈分成許多的復制單位（復制子）（可多達10000個左右），它們可在S期的不同時間分別復制。另外，在S期內還有組蛋白的合成──組蛋白基因在G1-S期之間活化，組蛋白mRNA的轉錄增大，並在整個S期內連續進行。已合成的組蛋白使新合成的DNA很快轉為核組蛋白復合體。

S期細胞含有一種因素能誘導DNA合成，用細胞融合實驗證明，G1細胞在與S期細胞融合後能加速其核內DNA復制的起點啟動。S期不同階段復制的DNA鹼基組成是不同的，早期復制的DNA富有G-C鹼基，晚期復制的DNA富有A-T鹼基，即常染色質比異染色質復制較早（圖2）。

G2期 是DNA復制結束和開始有絲分裂之間的間隙，在這期間細胞合成某些蛋白質和RNA分子，為進入有絲分裂提供物質條件。用放射標記的RNA前體和蛋白質前體示蹤，表明G2期進行著強烈的RNA和蛋白質的合成。假如破壞這些合成過程，細胞就不能過渡到M期。G2期合成的是染色體濃縮以及形成有絲分裂器所需的成分。有人認為G2期繼續完成從S期就開始的微管蛋白的合成，為M期紡錘絲的組裝提供原料。在G2晚期開始合成有絲分裂因子。在某些缺少G1期細胞中，G2期更為復雜，還要擔負起其他細胞G1期中所要完成的事件。也有少數情況，S期結束後立即開始有絲分裂，而不存在G2期。

M期 有絲分裂時期，是細胞形態結構發生急速變化的時期，包括一系列核的變化、染色質的濃縮、紡錘體的出現，以及染色體精確均等地分配到兩個子細胞中的過程，使分裂後的細胞保持遺傳上的一致性。M期分為前期、中期、後期和末期（見有絲分裂）。M期雖是形態變化最為顯著的時期，但其呼吸作用反而降低，蛋白質合成明顯下降，RNA合成及其他代謝周轉停止，這是由於有絲分裂期所需要的能量和其他基本物質均在間期內合成和貯備好了有關。

細胞周期中，細胞形態也發生一系列變化，從光學顯微鏡下可看到G1期細胞最小，細胞扁平而光滑，隨著向S→G2→M期的發展細胞逐漸增大，從扁平變成球形。掃描電鏡下可明顯看到各時期內細胞表面形態的變化，如微絨毛逐漸增加，這些變化和細胞內各種生化的和生理的周期性變化是有關的。

調控細胞周期中的許多生化事件是按一定順序，有條不紊地進行著，這和基因按一定順序表達密切相關。

有人認為，細胞周期內有兩個階段最為重要：G1到S和G2到M；這兩個階段正處在復雜活躍的分子水平變化的時期，容易受環境條件的影響，如果能夠人為的進行調控，將對深入了解生物的生長發育和控制腫瘤生長等有重要意義。

已發現很多體內因素可以激發或抑制細胞的增殖，例如多種激素、血清因子、多胺、蛋白水解酶、神經氨酶、cAMP、cGMP以及甘油二脂（DG）、 三磷酸肌醇（1P3）和Ca信使系統等等。細胞內cAMP濃度增加對細胞增殖有抑製作用，凡能使細胞內cAMP增高的因素都能抑制細胞的增殖，降低細胞生長速度；反之，凡能使細胞內cAMP含量下降的因素都能促進DNA的合成與細胞的增殖。細胞周期的各期中的cAMP含量也不相同（見表）。在中國倉鼠卵巢細胞株中，M期cAMP含量最低，M期後cAMP的水平增高三倍，從G1早期至G1晚期，cAMP水平降低到中等水平，直至S期仍維持低的水平（圖3）。

還有許多實驗指出cGMP 也對細胞增殖起調控作用，如將cGMP或雙丁醯cGMP加到休止在G1期的 3T3 細胞時，能誘導DNA含量的增加， 促進細胞的分裂。如提高細胞cGMP水平，就可促進細胞的有絲分裂，反過來，促進有絲分裂的葯物也能增加cGMP的濃度。

cAMP能抑制細胞的分裂，促進細胞的分化，cGMP則能抑制細胞分化，促進細胞增殖，在正常生長的細胞中，cAMP和cGMP維持在適當的水平，調節控制細胞周期的運轉。

抑素是細胞產生的一種小分子蛋白質或多肽，有的還含有糖或RNA。它無種屬特異性，但有細胞特異性，對同類細胞增殖有抑製作用並且可逆。當抑素含量達到一定濃度時可抑制同類細胞的增殖，抑素濃度下降則細胞增殖活躍。有人認為抑素作用的機制，在於它能激活細胞膜上的腺苷環化酶活性，提高細胞內cAMP的濃度，因而抑制細胞的增殖，也可能通過cAMP-依賴性蛋白激酶對蛋白質的磷酸化作用來影響調節基因的活動。

細胞周期也受機體調節系統的影響，例如肝再生就是由調節系統的作用加速肝細胞增殖。但是腫瘤細胞，由於宿主失去對它的調控，因而惡性增殖。在腫瘤治療中可應用細胞周期的原理，如G0期細胞對化療不敏感，往往成為日後癌症復發的根源，因而可通過調控機理的研究，誘發G0期癌細胞進入細胞周期，再合理用抗癌葯物加以殺滅，是防止癌轉移和擴散的重要調控措施，也是細胞動力學中有理論意義和實踐意義的研究問題。

總之，目前所了解的細胞增殖調控的分子基礎還少，尚待進一步探索。

細菌DNA增值特點 折疊

細菌DNA復制、RNA轉錄和蛋白質合成同時進行，這是細菌對快速生長的適應。

DNA復制不受細胞周期的限制，快速生長的細菌，在上一次細胞分裂結束時，細胞內的DNA經復制到一半進程，以保證迅速進行下一次分裂。

⑼ 手把手帶你邁過「細胞周期」流式檢測的門檻

開始講周期檢測前先帶大家回憶一下細胞周期的基本知識（高手可自行跳過）。

細胞周期(cell cycle)是指細胞從第一次分裂結束產生新細胞到第二次分裂結束所經歷的全過程，分為分裂間期(interphase)和有絲分裂期(mitosis)兩個階段。

分裂間期分為三個連續的階段：第一階段稱為 G1期，細胞對環境進行「褲迅監測"，當接收到必要的信號後，細胞便開始合成 RNA和蛋白質來誘導細胞生長；一旦條件合適細胞便進入S期，開始合成 DNA和復制其染色體 DNA，使體細胞成為4倍體，與此同時還合成組蛋白，進行中心粒復制，S期一般需幾個小時；最後在 G2期細胞持續生長並准備進行有絲分裂，中心粒已復制完畢，形成兩個中心體，還合成RNA和微管蛋白等，G2期比較恆定，需用1～1.5小時。

有絲分裂需經前期(prophase)、中期(metaphase)、後期(anaphase)和末期(telophase)，是一個連續變化過程，由一個母細胞分裂成為兩個子細胞。一般需1～2小時。

此外還有G0期，G0期是細胞暫時離開細胞周期，停止細胞分裂，去執行一定生物學功能的細胞所處的時期。

我們之所以能夠對細胞周期進行檢測主要就是根據周期不同階段細胞DNA含量不同的原理進行檢測，此外這個過程中一些蛋白的表達水平也會發生變化，亦可以成為周期檢測的輔助手段。

檢測周期最簡單、最基本的方法就是利用DNA染料，如PI、7-AAD等（各染料特徵見文末附表）對細胞進行染色，DNA含量多則熒光強度高，DNA含量低則熒光強度低，根據熒光強度的變化就可判斷細胞處在周期的哪個階段。理想狀態下，如果G0/G1期細胞的熒光強度為N，則S期細胞的熒光強度處於N～2N之間，G2/M期細胞的熒光強度為2N，如圖示：猜臘

但實際情況則如下圖所示：

實際的圖形中各期的細胞和理想情況相比都具有一定的寬度，這是由於細胞染色和激光照射不完全均一等原因所致，通常用變異系數(CV)來衡量，一般來講CV值應該小於3%。這就帶來了一個問題，圖中紅色圓圈部位的細胞到底處於哪個周期？解決方法是計算機上的周期分析軟體可以利用數學模型通過一定的演算法對結果進行分析，從而估算出各階段的細胞比例。

下圖為BD公司的Modfit軟體分析得到的結果：

如果上述方法得到的結果已經能夠滿足你的需要，請點擊返回鍵退出閱讀。但如果你有追求完美的處女座性格，並不滿意計算機通過數學模型估算出的結果，請繼續閱讀周期檢測的「進階方法」。

進階方法--雙參數檢測周期

為了克服單參數法不能真實的反映出周期不同階段細胞的比例這種困境，BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)，一種胸腺嘧啶核苷類似物，被引入了周期的檢測方法中。BrdU能夠在DNA合成期(S期)代替胸腺嘧啶(T)，進入正在復制的DNA中，而後利用抗BrdU抗體便可對其進行檢測，這樣便可明確將S期細胞與G0/G1期細胞和G2/M期細胞進行區分。

但BrdU需要變性DNA後才能與抗體結合，破壞了DNA雙鏈結構，影響了Hochest等染色，導致染色彌散，准確性降低等問題，逐漸被EdU取代。EdU是另外一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細胞內很容易擴散，無需DNA變性（酸解、熱解、酶解等）即可有效檢測，可有效避免樣品損傷。

看似問題已經得到了解決，那麼關於細胞周期檢測我們還能做得穗純滑更好嗎？

答案是肯定的。因為上述方法都不能對G0期和G1期的細胞進行區分，亦不能對G2期和M期的細胞進行區分。為了實現這個目標Christine Vignon等人發明了一種三參數雙熒光的檢測方案。除了常規的DNA染料7-AAD，研究人員引入了Ki-67和磷酸化組蛋白H3這兩個指標，Ki-67在G0期不表達可以用來區分出G0期細胞，Ser10磷酸化的組蛋白H3與染色體凝縮高度相關可用來區分出處於M期的細胞。詳情請見圖：

上述方法基本上可以滿足大部分研究者對於周期研究的需求，至於對周期更極致的區分已經超出了我的能力范疇，就不再獻丑了。

雙參數法都可以怎麼玩？

雙參數法雖然對周期的區分不如三參數法細致，但根據不同的實驗目的還是能夠玩出一些不一樣的感覺。

如果你想知道在給定時間里有多少個細胞處於周期循環中，您可以將細胞暴露於BrdU下較短的時間(如30分鍾)，然後進行檢測。這樣你就可以比較同種細胞接受不同處理方式後周期各個階段細胞百分比的差異，或者比較不同細胞類型間的差異。

如果你想知道培養的細胞中是否有靜止的，未進入周期循環的細胞，可將細胞暴露於BrdU較長一段時間(例如24小時)後再進行檢測。任何BrdU陰性的細胞都是未進入細胞周期循環的靜止細胞。

如果你對細胞跨越周期不同階段所需時間感興趣，您可以將BrdU添加到培養液中15分鍾，然後換成不含BrdU的培養液。在不同時間點取樣品進行檢測。追蹤實驗開始時BrdU陽性的處於S期的細胞，比如當你看到標記的細胞重新出現在G1期，你就知道該細胞通過G2和有絲分裂期用了多長時間。

⑽ 細胞周期測定

兒童白血病細胞DNA含量及細胞周期的臨床分析
劉愛國 胡 群 陶紅芳 張柳清 胡 迎
華中科技大學附屬同濟醫院兒科(湖北 武漢) 430030
中國圖書分類號 R725·2 文獻標識碼 B 文章編號 1001-4411 (2008) 07-0980-03
【摘 要】 目的:探討小兒急性白血病(AL)患者骨髓細胞周期分布與分型和治療的關系。方法:應
定96例小兒AL骨髓單個核細胞DNA含量和細胞周期。結果:不同類型的AL異倍體發生率不同,急性淋巴
異倍體率55·7% (44/79),明顯高於急性非淋巴細胞白血病(ANLL)的29·41% (5/17), T-ALL異倍體
高於B-ALL (41·67% ),統計學差異均有顯著意義。AL初診病例和復發病例的G0/G1期細胞比例高於完全
G2M+S期比例低於完全緩解組和對照組(P<0·05),完全緩解組和對照組無顯著差異。結論:圖像分析系統
異倍體的分析,有利於判斷高危ALL,對細胞周期的測定給化療個體化提供了具體的參考指標。
【關鍵詞】 兒童白血病 DNA含量 細胞周期 圖像分析系統
C linical implication ofDNA content assay and cell cycle distribution in
cute leukem ia
LIUAi-Guo, HU Qun, TAO Hong-Fang et al·Department ofPediatrics, TongjiHospital, HUST,
China
〔Abstract〕 Objective:To investigate the distribution ofmarrow cell cycle and the relationshipwith the types o
peutic effects in childhood acute leukemia (AL)·M ethods:Mononuclear cellularDNA contents in bonemarrowwere
nalysis system in 96 patientswith childhoodAL·Results:The proportion ofpatientswith DNA-aneuploidwas differen
ofAL: DNA-aneuploid in the patientswithALLwas 55·7% (44/79), much higher than that in the children withA
17)·Statistically significantdifferenceswere found between the T-ALL group and B-ALL group in the DNA- aneu
vs 41·67%,P<0·05)·The leukemia cell cycle distribution indicated thatG0/G1-phase compartment in untreate
group were higher than in complete remission group and normal controls, G2M+S-phase compartmentwere lower tha
sion group and normal controls (P<0·05)·There were no significant differences in cell cycle distribution between
group and normal controls·Conclusion:The analysis ofAL, especiallyALL aneuploid, by image analysis system can
guishing the high riskALL from the standard riskALL, and the determination of cell cycle distribution can provide a c
for chemotherapy·
〔Key words〕 Childhood leukemia; DNA content; Cell cycle; Image analysis system
細胞DNA含量及細胞周期的變化與白血病發生、發展及
轉歸有密切的關系。快速分析白血病細胞的動力學變化,可
以評估其增殖能力,初步判斷化療的療效。研究白血病細胞
的DNA指數和細胞周期的變化,對協助臨床診斷和制定個體
化的化療方案有著重要意義。經典的細胞周期分析方法為流
式細胞儀,但儀器和試劑昂貴限制了其在臨床的廣泛應用。
筆者採用圖像分析系統檢測不同病程的兒童白血病細胞DNA
指數、倍體的改變和細胞周期的變化,以及這種變化與臨床
的關系,報道如下。
1 資料與方法
1·1 對象及分組 2003年4月~2005年8月兒科血液病房
住院急性白血病(AL) 96例,,男60例,女36例,年齡8個
月~14歲,平均7·1歲。其中急性淋巴細胞白血病(ALL )
79例(初治31例,復發/難治5例,完全緩解43例),急性
非淋巴細胞白血病(ANLL) 17例(初治8例,復發/難治4
例,完全緩解5例)。所有病例均經細胞學及免疫學檢查確
診。
1·2 方法 分別選取不同病程的白血病患兒及正常對照組骨
髓穿刺塗片標本,空氣中乾燥至少1 h,多聚甲醛固定30 min,
然後進行Feulgen染色〔1〕。採用CMIAS-B圖像分析系統測定
細胞核DNA相對含量及DNA指數(DI),同時分析不同細胞
周期的細胞所佔百分比。
1·3 DNA倍體判斷標准 根據DI判斷, DI系樣本的G0/G1
期細胞與正常二倍體G0/G1期細胞熒光強度之比。DI正常范
圍為0·9~1·1, DI<0·9為亞二倍體, DI>1·1為超二倍體,
亞二倍體和超二倍體均為異倍體。
1·4 統計學方法 應用SPSS 8·0軟體,進行χ2檢驗和t檢
驗。
2 結果
2·1 DNA異倍體檢出情況 79例ALL檢出DNA-異倍體
44例,異倍體率55·7%其中48例B-ALL檢出異倍體20
例,異倍體率41·67%, 31例T-ALL檢出異倍體24例,異
倍體率77·42% ,兩個不同免疫類型ALL出現異倍體的陽性
率有顯著差異(χ2=9·76, P<0·05)。檢出的5例亞二倍體
中,全部為T-ALL。17例ANLL檢出異倍體5例,異倍體率
29·41%,與ALL組比較有顯著性差異(χ2= 3·84, P<
0·05)。見表1。對照組10例無異倍體檢出。
2·2 細胞周期分布 AL初治組患兒的G0/G1(% )明顯高
於完全緩解組(t=2·83,P<0·05)和
P<0·05), S+G2/M (% )則明顯低於
2·06,P<0·05)和對照組(t=2·74,P<
復發/難治組差異無顯著意義(t分別為1·
0·05)。進一步分析ALL組和ANLL組,各
著差異性。見表2。
表1 AL異倍體檢出率(
組別初診緩解
ALL 58·06 (18 /31) 48·84 (21 /43)
B-ALL 55·00 (11 /20) 26·92 (7 /26)
T-ALL 90·91 (10 /11) 64·71 (11 /17)
ANLL 25·00 (2 /8) 20·00 (1 /5)
表2 AL不同病情細胞周期
組別nG0/G1S G
初診39 89·8±5·3 9·4±8·9 2·7
完全緩解48 72·9±6·5 19·1±10·1 7·4
復發/難治9 83·5±7·1 8·3±5·3 9·4
對照10 70·4±5·4 22·1±4·5 7·3
3 討論
DNA異倍體是腫瘤的特異性標志已為
體改變在白血病中很常見,國內外均有報
體檢出率約為50%〔1〕,本試驗79例AL異
與文獻報道相符,其中T-ALL異倍體檢出
二倍體集中出現於T-ALL中,而B-ALL
41·67% ,明顯低於T-ALL。從診斷AL
T-ALL、亞二倍體均作為高危因素,由此
不好與異倍體的出現特別是亞二倍體有關〔
檢出率明顯高於ANLL組,從遺傳學角度
制,表明ANLL患兒的染色體異常較多地
而不是數目異常,這可能是臨床ANLL較
因之一〔2〕。
ALL初診組及難治/復發組DNA異倍
其中難治/復發組與CR組的差異更為顯著,
義。隨著患者的完全緩解, DNA異倍體率
有部分CR患者存在DNA異倍體。故此類
師重視,以最大限度地延長患者長期生存率
文獻記載,白血病細胞的細胞周期比
處於S期和G2M +S期的細胞比例比正
劉愛國等 兒童白血病細胞DNA含量及細胞周期的臨床分析 第7期
G2M+S期比例代表該細胞群體中增殖細胞的數量,從另一側
面反映細胞的增殖狀態。本實驗顯示, AL組患兒骨髓細胞的
G0/G1(% )明顯高於緩解組和正常對照組,而S%及S+
G2/M (% )明顯低於緩解組和對照組,說明了白血病骨髓細
胞從G0/G1期至S期之間存在運行阻滯,表明白血病骨髓細
胞的增殖能力低於正常。亞二倍體ALL患兒的骨髓細胞增殖
能力低,故預後相對較差。而超二倍體骨髓細胞的增殖分化
需要復制合成更多的遺傳物質, S期相對延長,進入S期的細
胞增多,因而臨床上對於超二倍體的ALL患兒,聯合使用作
用於S期白血病細胞的葯物,能達到更佳的治療效果〔3〕。
故我們認為,在評定AL患者危險度和制定化療方案時,
除可以MDR作為依據外,患者DNA指數及DNA異倍體率以
及細胞周期分析均可作為重要參考指標。
4 參考文獻
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op