基因序列分析處理方法

㈠ 已知一段序列，如何利用多種方法對其進行基因功能驗證

用基因敲除，表達，和過表達來驗證。
先用基因敲除看看，這種代謝產物是否還能表達。
還有就是把預測的這個片段導漏核讓入不能氏弊產生這種功能的宿主中去，看看這個被導入的宿主是返局否也能表達產生這種代謝產物。

㈡ DNA測序的測序技術

高通量測序技術（High-throughput sequencing）又稱「下一代」測序技術（Next-generation sequencing technology），以能一次並行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。
根據發展歷史、影響力、測序原理和技術不同等，主要有以下幾種：大規模平行簽名測序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸測序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導體測序（Ion semiconctor sequencing）、DNA 納米球測序 （DNA nanoball sequencing）等。 基因分析儀(即DNA測序儀)，採用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯醯胺平板電泳，應用該公司專利的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應，生成的PCR產物則是相差1個鹼基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由於分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發的熒光經光柵分光，以區分代表不同鹼基信息的不同顏色的熒光，並在CCD攝影機上同步成像，分析軟體可自動將不同熒光轉變為DNA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或鹼基排列順序等多種形式輸出。
它是一台能自動灌膠、自動進樣、自動數據收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的鹼基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。這些凝膠顆粒孔徑均一，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色列印機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟體。它使用最新的CCD攝影機檢測器，使DNA測序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。
由於該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構象多態性分析(SSCP)、微衛星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進行常規DNA測序外，還可進行單核苷酸多態性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。
一、准備工作
1. BigDye測序反應試劑盒 主要試劑是BigDye Mix，內含PE專利四色熒游標記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應緩沖液等。
2. pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對照模板 0.2 g/L，試劑盒配套試劑。
3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl，試劑盒配套試劑。
4. DNA測序模板 可以是PCR產物、單鏈DNA和質粒DNA等。模板濃度應調整在PCR反應時取量1 μl為宜。本實驗測定的質粒DNA，濃度為0.2 g/L，即200 ng/μl。
5. 引物需根據所要測定的DNA片段設計正向或反向引物，配製成3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl。如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6. 滅菌去離子水或三蒸水。
7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 蓋體分離。
8. 3 mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8 g NaAc·3H2O溶於70 ml蒸餾水中，冰醋酸調pH至5.2，定容至100 ml，高壓滅菌後分裝。
9. 70%乙醇和無水乙醇。
10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml無水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。
11. POP 6測序膠 。
12. 模板抑制試劑(TSR) 。
13. 10×電泳緩沖液 。
14. 全自動DNA測序儀。
15. PCR儀。
16. 台式冷凍高速離心機。
17. 台式高速離心機或袖珍離心機。
二、PCR測序反應
1. 取0.2 ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：
所加試劑 測定模板管 標准對照管
BigDye Mix 1 μl 1 μl
待測的質粒DNA 1 μl －
pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA － 1 μl
待測DNA的正向引物 1 μl －
M13(-21)引物 － 1 μl
滅菌去離子水 2 μl 2 μl
總反應體積5 μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。
2. 將PCR管置於9600或2400型PCR儀上進行擴增。98℃變性2 min後進行PCR循環，PCR循環參數為96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25個循環，擴增結束後設置4℃保溫。
三、醋酸鈉/乙醇法純化PCR產物
1. 將混合物離心，將擴增產物轉移到1.5 ml EP管中。
2. 加入25 μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振盪，置冰上10 min以沉澱DNA。12 000 r/min於4℃離心30 min，小心棄上清。
3. 加70%(V/V)的乙醇50 μl洗滌沉澱2次。12 000 r/min於4℃離心5 min，小心棄上清和管壁的液珠，真空乾燥沉澱10～15 min。
四、電泳前測序PCR產物的處理
1. 加入12 μl的TSR於離心管中，劇烈振盪，讓其充分溶解DNA沉澱，稍離心。
2. 將溶液轉移至蓋體分離的0.2 ml PCR管中，稍離心。
3. 在PCR儀上進行熱變性(95℃ 2 min)，冰中驟冷，待上機。
五、上機操作 1. 按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件。2. 儀器將自動灌膠至毛細管，1.2 kV預電泳5 min，按編程次序自動進樣，再預電泳(1.2 kV，20 min)，在7.5 kV下電泳2 h。3. 電泳結束後儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預電泳和電泳。4. 每一個樣品電泳總時間為2.5 h。5. 電泳結束後儀器會自動分析或列印出彩色測序圖譜。
六、序列分析 儀器將自動進行序列分析，並可根據用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標出差異鹼基處，提高工作效率。
七、儀器清洗 測序完畢按儀器操作規程進行儀器清洗與保養。
八、計算
1. 測序反應精確度計算公式：100%－差異鹼基數(不包括N數)/650×100%。
2. 差異鹼基即測定的DNA序列與已知標准DNA序列比較不同的鹼基，N為儀器不能辨讀的鹼基。 SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。 銀染提供了一種對於放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成後經90分鍾就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。 此外，SILVER SEQUENCETM系統用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物，減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。
Taq DNA聚合酶在95℃時極強的熱穩定性。本系統利用的測序級Taq DNA聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾產品，對於雙鏈DNA模板有非常好的效果，具有高度的准確性，能產生均一的條帶，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系統包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP（7-deaza dGTP，或dITP）替代dGTP可清除由GC豐富區域所引起的條帶壓縮現象。
退火溫度是熱循環測序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結構。提高引物結合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結構則限制了小片斷PCR產物（<500bp）得到清楚的序列數據的能力。引物延伸起始於每個循環的退火階段。在較低溫度時，聚合酶可能會遇到堅固的二級結構區域，它可導致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因，應該使用盡可能高的退火溫度。對於有牢固二級結構的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環模式。一般來說，較長的引物及GC含量高的引物能得到較強的信號。實驗結果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到最佳結果。
由於本系統採用熱循環裝置, 與常規的測序方法相比具有如下幾點好處：(1).本方法線性擴增模板DNA產生足夠的產物使銀染技術能夠檢測序列條帶，測序反應需要0.03～2pmol模板DNA，隨模板種類而定。(2). 在每一個變性循環中的高溫可以取代對雙鏈DNA（dsDNA）模板的鹼變性及乙醇沉澱過程，變性循環也有助於消除由於線性dsDNA模板（如PCR反應產物）快速重退火所引起的問題。(3). 高溫聚合酶反應減弱了DNA模板的二級結構，允許聚合酶穿過高度二級結構化的區域。
一、試劑准備
1. SILVER SEQUENCETM DNA測序試劑盒。
2. 丙烯醯胺和甲叉雙丙烯醯胺儲備液（38%丙烯醯胺 W/V，2%甲叉雙丙烯醯胺 W/V）：95 g丙烯醯胺，5 g甲叉雙丙烯醯胺溶於140 ml 雙蒸水中，定容至250 ml，0.45 mm過濾器過濾後，貯於棕色瓶中，置於4℃冰箱可保存2周。
3. 10%過硫酸銨，0.5 g過硫酸銨溶於4 ml水中，定容至5 ml，應新配新用。
4. 10×TBE緩沖液（1 mol/L Tris， 0.83mol/L 硼酸，10 mmol/L EDTA）： 121.1 g Tris，51.35 g硼酸，3.72 g Na2EDTA ·2H2O，溶於雙蒸水中定容至1升，置於4℃下可貯存2周，其pH約為8.3。
5. TBE電極緩沖液：10×TBE 緩沖液稀釋至1×TBE備用。
6. TEMED
7. 固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配製2升備用。
8. 染色溶液：硝酸銀2 g，甲醛3 ml，溶於2升超純水中備用。
9. 顯影溶液：60 g碳酸鈉（Na2CO3)溶於2升超純水中，使用前加3 ml 37%甲醛和40 ml硫代硫酸鈉溶液（10 mg/ml）。
10. 95%乙醇。
11. 0.5%冰乙酸。
12. Sigmacote （Sigma CAT. #SL-2）。
二、測序反應
1. 對於每組測序反應，標記四個0.5 ml eppendorf管（G、A、T、C）。每管加入2 ml適當的d/ddNTP混合物（d/ddNTP Mix）。各加入1滴（約20 μl）礦物油，蓋上蓋子保存於冰上或4℃備用。
2. 對於每組四個測序反應，在一個eppendorf管中混合以下試劑：
（1） 樣品反應：
質粒模板DNA ：2.1 pmol
5×測序緩沖液 ： 5 ml
引物： 4.5 pmol
無菌ddH2O 至終體積16 ml
（2）對照反應
pGEM-3Zf（+）對照DNA（4 mg） ：4.0 ml
5×測序緩沖液： 5 ml
pUC/M13正向引物（4.5 pmol） ：3.6 ml
3. 在引物/模板混合物（以上第2步）中加入1.0 ml測序級Taq DNA聚合酶（5 μ/ml）。用吸液器吸動幾次混勻。
4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4 ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。
5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位於eppendorf管底部。
6. 把反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，以【注意】中循環模式為基準，開始循環程序。對於每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350鹼基的長度。
7. 熱循環程序完成後，在每個小管內加入3 μlDNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。
【注意】
（1）測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：
模板種類/長度 模板量
200 bp（PCR產物）：16 ng（120 fmol）
3000～5 000 bp（超螺旋質粒DNA）： 4 mg（2 pmol）
48 000 bp（λ,粘粒DNA）： 1 mg（31 fmol）
由於超螺旋質粒產生的信號比鬆弛的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。
（2）計算與4.5 pmol相當的引物納克數可用以下一般公式：
4.5 pmol=1.5 ng×n，其中n為引物鹼基數
計算與1p mol相當的引物微克數可用以下一般公式：
dsDNA：1 pmol=（6.6×10mg）×n，其中n為模板鹼基對數
ssDNA：1pmol=（3.3×10mg）×n，其中n為模板鹼基數
（3）為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環儀必須預熱至95℃。溫度變換應越快越好。下面的循環時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。
模式1：適用於引物<24鹼基或GC含量<50%
95℃ 2分鍾，然後： 95℃ 30秒（變性），42℃ 30秒（退火），70℃ 1分鍾（延伸）。
模式2：適用於≥24鹼基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分鍾，然後：95℃ 30秒（變性），70℃ 30秒（退火/延伸）。
（4）在加入終止溶液之後樣品可在4℃保存過夜。
三、測序凝膠板的制備
1. 玻璃板的處理
銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最後用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導致凝膠染色時背景偏高（棕色）。短玻璃板經粘合溶液處理可將凝膠化學交聯於玻璃板上。這一步對於在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關重要。
（1）短玻璃板的處理
① 在1 ml95%乙醇，0.5%冰乙酸中加入5 ml粘合硅烷（Bind Silane），配成新鮮的粘合溶液。
② 用經浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過並已經自然乾燥的玻璃板，整個板面都必須擦拭。
③ 4～5分鍾後，用95%乙醇單向擦玻璃板，然後略用力沿垂直方向擦拭。重復三次這一清洗過程，每次均須換用干凈的紙，除去多餘的粘合溶液。
【注意】
① 在95%乙醇單向擦玻璃板時過度用力會帶走過多的粘合硅烷，使凝膠不能很好地粘附。
② 准備長玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。
③ 防止粘合溶液沾染在長玻璃板上是很重要的，否則將導致凝膠撕裂。
（2）長玻璃板的處理：
① 用浸透Sigmacote溶液的棉紙擦拭清洗過的長玻璃板。
② 5～10分鍾後用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多餘的Sigmacote溶液。
【注意】
① 用過的凝膠可在水中浸泡後用剃須刀片或塑料刮刀颳去。玻璃板須用去污劑完全清洗。或者凝膠用10%NaOH浸泡後除去。為防止交叉污染，用於清洗短玻璃板的工具必須與清洗長玻璃板的工具分開，如果出現交叉污染，以後制備的凝膠可能撕裂或變得鬆弛。
2. 凝膠的制備
（1）玻璃板經粘合硅膠和Sigmacote處理後，即可固定玻璃板。該方法是用0.2 mm或0.4 mm厚的邊條置於玻璃板左右兩側，將另一塊玻璃板壓於其上。在長玻璃板的一側插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。
（2）根據所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%～8%的膠濃度可獲得較好的結果。配製過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE緩沖液，再用雙蒸水調終體積至99.2 ml，並用0.45 mm的濾膜過濾，然後加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應等溶液完全冷卻後，方可加入TEMED和過硫酸銨。一般在膠灌制後4～6分鍾，即開始聚合，如果聚合不好，則應使用高濃度的TEMED和過硫酸銨。
（3）膠配製好後，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完後，靜止放置使之聚合完全。
【注意】
① 使用夾子固定玻璃板時，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過程中出現漏膠液現象。
② 灌制凝膠的過程中要嚴防產生氣泡，否則影響測序的結果。
四、電泳
1. 預電泳
（1）當凝膠聚合完全後，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。
（2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板後，方能加入TBE緩沖液。
（3）稀釋10×TBE緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳槽中，去除產生的氣泡，接上電源准備預電泳。
（4）有些電泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加熱的，則應先將水浴加熱至55℃後進行預電泳。有的不使用水浴加熱，依靠電泳過程中自身產生的熱進行保溫，如上海求精有機玻璃儀器生產的測序電泳槽，這種槽需夾上二塊散熱鋁板，使整個凝膠板的溫度一致。
（5）按30 V/cm的電壓預電泳20～30分鍾。預電泳的過程是去除凝膠的雜質離子，同時使凝膠板達到所需的溫度。高溫電泳可防止GC豐富區形成的發夾狀結構，影響測序的結果。
【注意】
① 用鯊魚齒梳製作加樣孔時，應注意將齒尖插入膠中0.5mm左右，千萬注意不能使加樣孔滲漏，否則得不到正確的結果。
② 應時刻注意上面電泳槽中的緩沖液是否滲漏，否則極易造成短路而損壞電泳儀。
2. 樣品的制備
當在預電泳時，即可進行樣品的制備，將反應完畢的樣品在沸水浴中加熱1～3分鍾，立即置於冰上即可。如果樣品長時間不用，則應重新處理。可使用4～6%聚丙烯醯胺凝膠，膠厚0.4 mm。厚度小於0.4 mm的膠可能導致信號太弱。加樣時不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地吸取礦物油下的藍色樣品。
3. 上樣及電泳
關閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預電泳時擴散出來的尿素，然後立即用毛細管進樣器吸取樣品，加入樣品孔中。上樣順序一般為G、A、T、C。加樣完畢後，立即電泳。開始可用30 V/cm進行電泳，5分鍾後可提高至40～60 V/cm，並保持恆壓狀態。一般來說，一個55 cm長，0.2 mm厚的凝膠板，在2500 V恆壓狀態下電泳2小時即可走到底部，同時在電泳過程中，電流可穩定地從28 mA降至25 mA。為了能讀到更長的序列，可採用兩輪或多輪上樣。
【注意】
① 上樣電泳時，一定要注意凝膠板的溫度是否達到55℃左右，如果還沒有達到，則應等溫度達到後才能上樣電泳。
② 一般來說電泳時，不宜使用太高的電壓，因為太高的電壓會使凝膠的解析度降低，並且使帶擴散。電泳中可進行恆功率電泳。
五、測序凝膠的銀染
染色過程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質量的水洗滌盤子。
1. 電泳完畢後用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應該牢固地附著在短玻璃板上。
2. 固定凝膠：將凝膠（連玻璃板）放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒，充分振盪20分鍾或直至樣品中染料完全消失，膠可在固定/停止溶液中保存過夜（不振盪）。保留固定/停止溶液，用於終止顯影反應。
3. 洗膠：用超純水振盪洗膠3次，每次2分鍾。從水中取出，當轉移至下一溶液時拿著膠板邊沿靜止10～20秒，使水流盡。
4. 凝膠染色：把凝膠移至染色溶液充分搖動30分鍾。
5. 凝膠顯影
（1）在顯影溶液中加入甲醛（3 ml）和硫代硫酸鈉溶液（400 μl）以完成顯影液的配製。
（2）從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5～10秒。注意，把凝膠從超純水轉移到顯影溶液的總時間不能長於5～10秒。浸泡時間過長則導致信號微弱或喪失信號。若浸泡時間過長，可重復第五步用染色液浸泡。
（3）立刻將凝膠轉移至1升（總量的一半）預冷的顯影液充分振盪直至模板帶開始顯現或開始出現第一批條帶，把凝膠移入剩下的1升顯影液中繼續顯影2～3分鍾或直至所有條帶出現。
6. 固定凝膠：在顯影液中直接加入等體積的固定/停止溶液。停止顯影反應，固定凝膠。
7. 在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2分鍾，注意在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋。
8. 將凝膠置於室溫乾燥或用抽氣加熱法乾燥。在可見光燈箱或亮白，黃色背景（如紙）上觀察凝膠，若需永久保存的記錄, 則可用EDF膠片保留實驗結果。
【注意】
測序產物的銀染是顯現序列信息的一種新方法，本系統的成敗受幾個因素的影響
① 水的質量對於染色的成功極其重要。超純水（NANOpureR或Milli-QR的水）或雙蒸水可獲得較好的效果，如果水中有雜質，則低分子量條帶可能無法出現。
② 碳酸鈉也非常重要。使用新鮮的，美國化學學會級碳酸鈉較好，如Fisher和Kodak ACS試劑級碳酸鈉（Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990），一般可獲得較好的結果。
③ 色後的洗滌步驟是非常關鍵的。如果凝膠洗滌時間太長，銀顆粒會脫離DNA，產生很少或沒有序列信號。如果洗滌時間過長，染色步驟可以重新進行。
④ 如果凝膠厚度超過0.4 mm或丙烯醯胺濃度高於4～6%，則有必要延長固定和染色的時間。如果凝膠比0.4 mm薄，染色反應後的洗滌必須縮短至不超過5秒。
⑤ 在室溫下進行所有步驟，顯影反應除外。顯影溶液必須預冷至10～12℃以減小背景雜色。注意：臨用前在顯影溶液中加入甲醛和硫代硫酸鈉。用新配的染色及顯影溶液。不要重復使用任何溶液。
六、EDF膠片顯影
使用EDF膠片可增強測序條帶的對比度，如果測序膠上條帶很淡，我們建議把數據轉移至EDF膠片，銀染膠在其影像轉移至EDF膠片之後可增強條帶可讀性。
1. 在暗室內，將染色過的粘於玻璃板的凝膠（膠面向上）置於熒光燈箱上。如有合適的漫射板，亦可用白燈箱，為確保曝光時間，用一小條EDF膠片曝光不同時間，檢查不同的曝光強度，一般曝光20～40秒可得較好結果。
2. 在紅燈下找到EDF膠片有缺刻的一角，然後把膠片置於凝膠上，使缺口位於左上角。由於EDF膠片是單面的，因此必須確保缺口在左上角。
3. 在EDF膠片上放置一干凈、乾燥的玻璃板，開亮燈箱約20秒。
4. 用沖顯放射自顯影膠片的步驟手工顯影EDF膠片，可使用下列操作過程：
（1） 在Kodak GBX顯影液中顯影1～5分鍾；
（2） 水洗1分鍾；
（3）在Kodak GBX定影液中定影3分鍾；
（4）水洗1分鍾。
【注意】
① 進行EDF膠片顯影之前凝膠必須完全乾燥。戴手套進行操作，以免印上指紋。同時注意EDF膠片不能用自動膠片處理器。
② 對於不同的光源最佳曝光時間可能不同，通過對一小條EDF膠片曝光不同時間以選擇你所用光源的最佳曝光時間，參閱膠片說明書。
③ 曝光時間短則EDF膠片影像較深，曝光時間長則有助於減弱背景。 「鳥槍法」是一種由生物基因組提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超聲波等)或酶化學方法(如限制性內切核酸酶)將生物細胞染色體DNA切割成為基因水平的許多片段，繼而將這些片段與適當的載體結合，將重組DNA轉入受體菌擴增，獲得無性繁殖的基因文庫，再結合篩選方法，從眾多的轉化子菌株中選出含有某一基因的菌株，從中將重組的DNA分離、回收。
這種方法也就是應用基因工程技術分離目的基因，其特點是繞過直接分離基因的難關，在基因組DNA文庫中篩選出目的基因。可以說這是利用「溜散彈射擊」原理去「命中」某個基因。由於目的基因在整個基因組中太少太小，在相當程度上還得靠「碰運氣」，所以人們稱這個方法為「鳥槍法」或「散彈槍」實驗法。
一、用限制酶切下目的片段的大片段InsertDNA，並用Agarose凝膠電泳進行回收。
二、對回收的大片段DNA用物理方法（如超聲波等）進行切斷處理，然後用T4DNAPolymerase對小片段DNA進行末端平滑化。
三、進行Agarose電泳，切膠回收1kbp～2kbp的小片段DNA。然後用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3'端加上一個A鹼基。
四、把加上A-tail的DNA片段連入T-Vector中，然後轉化，挑選克隆。
五、對陽性克隆（含1kbp～2kbpInsert）進行DNA測序。
六、對數據進行編輯，最後連成一條大片段的DNA序列。

㈢ 基因診斷常用技術方法

基因診斷（gene diagnosis）是以探測基因的存在，分析基因的類型和缺陷及其表達功能是否正常，從而達到診斷疾病的一種方法。它是繼形態學、生物化學和免疫學診斷之後的第四代診埋物斷技術，它的誕生與發展得益於分子生物學理論和技術的迅速發展。

常用基因診斷技術：
一、Southern印跡法（Southern blot）

基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強，當電泳後凝膠經過DNA變性處理，覆以上述濾膜，再於其上方壓上多層乾燥的吸水紙，藉助它對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉移到濾膜上。轉移是原位的，即DNA片段的位置保持不變。轉移結束後，經過80℃烘烤的DNA，將原位地固定於膜上。
當含有特定基因片段已原位轉移到膜上後，即可與同位素標記了的探針進行雜交，並將雜交的信號顯示出來。雜交通常在塑料袋中進行，袋內放置上述雜交濾膜，加入含有變性後探針的雜交溶液後，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定於膜上的單鏈基因DNA分子按鹼基到互補原理充分結合。結合是特異的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能結合上β珠蛋白的探針。雜交後，洗去膜上的未組合的探針，將Ⅹ線膠片覆於膜上，在暗盒中日光進行放射自顯影。結合了同位素標記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能導致帶的缺失或位置改變。

二、聚合酶鏈反應

近年來，基因分析和基因工程技術有了革命性的突破，這主要歸功於聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）的發展和應用。應用PCR技術可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小時內體外擴增數十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用於進一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴增至百萬倍後直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數小時。

三、高納擴增片段長度多態性

小衛星DNA和微衛星DNA的長度多態性可以通過PCR擴增後電泳來檢出，並用於致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）連鎖分析法。PCR擴增後，產物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用於突變性質不明的連鎖分析.

四、等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法

當基因的突變部位和性質已完全明了時，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素標記進行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用於探測點突變時一般需要合成兩種探針彎念液，與正常基因序列完全一致，能與之穩定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩定雜交，但不能與正常基因序列穩定雜交，這樣，就可以把只有一個鹼基發生了突變的基因區別開來.

PCR可結合ASO，即PCR－ASO技術，即先將含有突變點的基因有關片段進行體外擴增，然後再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。

五、單鏈構象多態性診斷法

單鏈構象多態性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指單鏈DNA由於鹼基序列的不同可引起構象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用於DNA中單個鹼基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設計一對引物進行PCR擴增，然後將擴增物用甲醯胺等變性，並在聚丙烯醯胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構象差異將表現為電泳帶位置的差異，從而可據之作出診斷。

㈣ 基因測序結果怎麼看

問題一：測序結果怎麼分析 測序結果的分析
測序都是從5端進行的，正向和反向測序是指對DNA的兩條互補鏈分別測序，通常兩個方向測序結果經校讀後完全一致才能認為得到可靠結果。生工測序結果一般都提供兩個文檔，一個是TEXT的序列文檔，一個是用Chromas軟體打開的ABI文檔。

1.尋找引物

blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 比對，去除引物序列，找到目的片段。
在DNAMan上進行比對，看引物能不能比對上（一個不變，一個反向互補），如果比不上，那可能就不是你要的序列，如果能比上，上游以引物第一個為分界線，去除前面的；下有一最後一個為分界線，去除後面的，剩下的就是目的序列。然後在NCBI上Blast.就OK了。

批註：PCR產物進悉睜行測序的結果可能不包含引物序列

2.將找到的對應目的片段轉成*.txt格式巧和

3.下載BioEdit軟體

第一：打開Bioedit軟體，導入拼接好的樣品序列與標准亞型參考序列
File New Alignment Sequence New Sequence 導入拼接好的樣品序列和標准參考序列（從TEXT文檔利用復制粘貼工具） Apply and close 保存結果 關閉窗口

第二：點擊菜單欄上按鈕 Accessory Application ，選擇 Clustalw Multiple Alignment

File Open Accessory Application Clustalw Multiple Alignment

第三：比對結束後，刪除比對序列兩端的多餘序列，使所有序列等長

選擇需要編輯的序列 Sequence Edit Sequence 進行序列的編輯 保存修改後結果

第四：選擇 Sequence 菜單下的 Gaps ，點擊 Lock Gaps

第五：將比對後的序列保存為Fasta 格式文檔

4.下載MAGE4.0軟體

1) 打開MEGA軟體，選擇 File 菜單欄中的 Convert To MEGA Format ，把序列文件的格式轉換為meg文檔保存；
2) 雙擊序列的meg文檔，選擇 Nucleotide Sequences ，點擊 OK ；
3) 程序運行中詢問是否為蛋白編碼序列，選擇 NO ；
4) 在MEGA操作界面選擇 Phylogeny 菜單欄下 Bootstrap Test of Phylogeny 中的 Neibour-Joining ；
5) 選擇 Test of Phylogeny 欄中的 Bootsrap ， Replications 設定為1 000；在 Options Summary 欄中的 Model 項中，設定參數為 Kimura 2-Paramete r，最後選擇 pute ；
6) 將分析結果採用Los Alamos HIV序列庫提供的HIV-BLAST和Subtyping工具進行驗證。...>>

問題二：dna測序結果分析怎麼看進化圖 如果是用Sanger測序的話，電泳得到的條帶是模板連的互補鏈，電泳的方向是有3『段到5』段的，那麼從下往上讀，就可以的出互補鏈，根據反向平行，就可以推倒出模板連的鹼基序列。

問題三：怎樣分析基因測序結果 1.假設你測的是一個基因的序列,如果已知這個基因的序列,則將你測序得到的基因序列與已知的序列相比對,分析看兩者在哪個地方不對應,不對應的地方即為突變的地方.比對的軟體有sequencher,或者去NCBI網站點擊BLAST進行.
2.如果你測的是一個以前未知的序列,那麼要測幾個不同的單克隆,將測得的結果進行比對,分析一致的地方以及不一致的地方.

問題四：細菌基因組重測序結果分析報告怎麼看 測序只是最基礎的，接下來你要做功能基因分析，查找確定哪孝陸盯一些是編碼基因的序列，然後做表達檢測。。 如果你事先知道自己的目的基因序列，測序結束後，應該可以直接找到。

問題五：高通量基因測序檢驗報告單怎麼看 哪個公司出的，可撥打他們的客服電話。從業人員素質普遍較高，可以很詳細解答您的疑問。

問題六：如何看測序的結果與預期相差很大 先注意染色體與基因的關系，一條染色體有多個基因。
所以基因結構變異（鹼基對增、減、變）導致一個基因變。染色體結構變異，導致多個基因的重復，缺失，排列順序的改變等。所以基因突變是某一性狀改變，而染色體變異是某一系列性狀的改變。

㈤ 基因序列比較怎麼分析

基因序列比較怎麼分析
測序得到基因序列後一般都需要進行序列比對，看和目的序列的差異情況，常用的軟體有DNAman,還有invitrogen的vectorVI也不錯。此外還可以直接在網上進行比對，推薦NCBI網站的BLAST可以直接網上進行。

不用擔心，多熟悉幾遍就可以操作了，很簡單的，要對自己有信心，加油！

㈥ 基因測序的步驟是什麼

PCR產物直接測序技術現已成為分子生物學和基因組學研究中的一個重要技術,廣泛用於基因突變檢測、遺傳性疾病診斷、單核苷酸多態性研究、基因組重疊序列群等.與傳統克隆測序技術相比較,直接對PCR擴增的DNA進行測序,省去了耗時的克隆步驟,避免了傳統的細菌培養,模板提取等重復性操作,可以從少量的原始樣品中得到正確的DNA序列信息.PCR產物直接測序技術具有快速、簡便、穩定經濟的優點.
試驗試劑
PCR擴增的雙鏈DNA模板
長約20個核苷酸的DNA引物
DNA聚合酶
測序膠
0.1mol/L DDT
α-32P-dATP
dNTP/ddNTP混合物(80μmol/L/8μmol/L)
dNTP(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L)
測序反應緩沖液：40mmol/L Tris-HCl(pH7.5),20mmol/L MgCl2,50mmol/L NaCl
終止緩沖液：95% 甲醯胺,20mmol/L EDTA,0.05% 溴酚藍,0.05% 二甲苯腈
試驗步驟：
1、 4個微量離心管中各加入dNTP/ddNTP混合物2.5μl,混合物37OC溫浴5min,備用.
2、 在一個空的微量離心管中加入1pmol的PCR擴增雙鏈DNA,10pmol測序引物,2μl 5×測序緩沖液,加雙蒸水至總體積10μl,96OC加熱8min,冰浴泠卻1min,4OC 10000g離心10s.
3、 加入2μl預冷的標記混合物(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L),α-32P-dATP 5μCi,1μl 0.1mol/L DDT,測序酶2U,加水至15μl,混勻後置冰上2min,標記新合成的DNA鏈.
4、 在第1步驟的4個管中各加入3.5μl標記反應混合物,37OC溫浴5min.每管各加入4μl終止液.
5、 樣品在80OC的水浴中熱變性5min,每一泳道加2μl 加到測序膠上,電泳分離這些片段.
注意事項：
1.?PCR產物要有一定的長度(>200bp),因為測序結果兩端20-30bp的電泳峰圖的准確性較低.
2.?純化PCR產物可通過離子交換層析使擴增的DNA段與反應剩餘的dNTP及引物分離；也可通過瓊脂糖凝膠電泳,將PCR產物與非特異性擴增產物和引物分離開來；如果擴增的特異性較高時,可直接通過酚：氯仿抽提,乙醇沉澱的方法來純化.
3.?測序引物設計原則類似於PCR引物設計,可在DNA合成儀上合成20個左右的核苷酸作為引物,經過高壓液相層析或聚丙烯醯胺凝膠桐清電泳純化後,即可用作測序引物.
PCR循環測序法
PCR循環測序法是將PCR擴增和核酸序列分析技術相結合,從而形成的一種測定核苷酸序列的研究方法,也稱作線性擴增測序.該首洞方法採用PCR儀加熱使DNA模板變性,在TaqDNA聚合酶作用下,以溫度循環模式在模板上進行多輪的雙脫氧核苷酸測序反應,線性擴增標記的DNA分子.
PCR循環測序法與以往的測序方法相比,其優點在於：大大減少所需的模板量；能提高測序反應產生的信號,降低了操作的復雜性,且聚合酶的用量減少；可在小量制備的模板上進行篩選反應；高溫下進行的測序反應使DNA聚合酶催化的聚合反應能夠通過模板二級結構的區域；雙鏈閉環DNA可以直接作為反應模板應用,不用作預先鹼變性處理.由於PCR循環測序法能夠簡單、快速地檢測特定序列,因此, PCR循環測序法在核酸序列分析研究中受到廣泛的重視.
試驗試劑：
DNA測局芹前序試劑盒
dNTP
ddNTP
丙烯醯胺
雙丙烯醯胺
尿素
TEMED(N,N,N『,N』-四甲基乙二胺)
過硫酸銨
6%測序膠：6%丙烯醯胺,7mmol/L 尿素,1×TBE.
10×測序緩沖液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.8),500mmol/L KCl,40mmol/L MgCl2,0.01%明膠,20μmol/L dATP,50μmol/L dCTP,50μmol/L dGTP,50μmol/L dTTP
終止混合液：ddATP (600μmol/L),ddCTP (600μmol/L),ddGTP (100μmol/L),ddTTP(1000μmol/L)
終止緩沖液：95%甲醯胺,20mmol/L EDTA,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯腈
試驗步驟
1、 4個小離心管,每個小管加入3μl的終止混合液,將管子放在冰上.
2、 在DNA模板中加入引物(4pmol), 4μl 10×測序緩沖液, 10μlα-32P-dATP, 2U TaqDNA聚合酶,加雙蒸水到30μl徹底混勻,每管7μl加入上面4個小管中.
3、 反應液上加30μl的石蠟油.
4、 95OC 30S,50OC 30S,72OC 60S共30個循環,可根據具體的情況進行適當的調整循環條件及循環次數.
5、 反應結束後在油層下加入5μl的終止緩沖液並用加樣槍混勻.
6、 上樣前將樣品在大於80OC的水浴中熱變性5min,每一道加2μl加到測序膠上,電泳分離這些片段.
注意事項：
1、 制備測序模板：PCR 擴增的產物可以經過低熔點的瓊脂糖凝膠電泳純化回收後,用於序列分析；可經過柱層析純化,去除PCR 反應後剩餘的dNTP和引物後,用於序列分析.PCR 產物也可不經純化直接用於測序,但是這種測序產生的結果較差,建議測序之前應進行PCR產物的純化.各種標準的質粒制備方法所純化出的質粒均可作為測序模板使用.用標准方法制備的M13噬菌體、粘粒、λDNA都適合用作測序模板用.但要注意的是反應體系中不應有與引物互補的非目的基因序列,否則將會導致測序實驗的失敗.
2、 測序引物：測序引物是指合成的與測序模板鏈特異性互補的寡核苷酸序列.可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶對引物的5『端進行標記,反應體系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在最佳的比例,以得到高比活性的標記引物；也可用α-32P-dATP標記新合成的DNA鏈.引物的濃度不宜高,否則容易形成引物二聚體,或產生非特異性的擴增引物.
3、 酶：各種缺乏3『—5『端外切活性的耐熱DNA聚合酶都可以用於循環測序,其中TaqDNA聚合酶在DNA測序中最為常用.雖然應用PCR循環測序法能夠簡單、快速的進行基因序列的測定,但仍未能適應大規模DNA序列測定的需要,而PCR循環測序法、熒游標記和自動測序儀的聯合使用成為大規模基因組測序的主要技術.該技術是採用熒游標記引物或雙脫氧核苷三磷酸,反應產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳後,經特定的DNA序列分析儀和分析系統處理待測的DNA序列.它的應用減輕了DNA序列測定的工作量,提高了測序的效率.

㈦ 已知基因序列，mrna序列，怎樣用blast分析內含子和外顯子

1、首先輸入基因的完整學名,找到與基因相關的cDNA序列.在這一cRNA序列的解說信息里,就已經有各外扒孝滑顯子的分節.
2、將該cDNA輸入Blast進行序列比對,就可以找到其每一個外顯子所對應的染色體位置,這些信息就顯示了所有的外顯子.處於外顯子兩端的序列就是內含子.
3、如你需要完整的基春臘因序列,需要在blast中選擇others這個資料庫,然後查找相關的慎衡Bac質粒中含有你完整基因的文件,在其中找到你所需的信息.

㈧ 基因序列差異分析

1。做Align（你的2個，加上別人報道的）
2。從起和肆虧始密碼開始，看相應位子的氨基酸有無雹彎改變
3。注意有無重大改變，比如等電性，酸鹼性等等。從而推出結合電子喚神的能力，也就是氧化能力。

㈨ 第二代DNA測序技術的操作流程

操作流程如下：

1、測序文庫的構建

首先准備基因組，然後將DNA隨機片段化成幾百鹼基或更短的小片段，並在兩頭加上特定的接頭。如果是轉錄組測序，則文庫的構建要相對麻煩些，RNA片段化之後需反轉成cDNA，然後加上接頭，或者先將RNA反轉成cDNA，然後再片段化並加上接頭。

2、錨定橋接

Solexa測序的反應在叫做flow cell的玻璃管中進行，flow cell又被細分成8個Lane，每個Lane的內表面有無數的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA 片段變性成單鏈後與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構，以供後續的預擴增使用。

3、預擴增

添加未標記的dNTP 和普通Taq 酶進行固相橋式PCR 擴增，單鏈橋型待測片段被擴增成為雙鏈橋型片段。通過變性，釋放出互補的單鏈，錨定到附近的固相表面。通過不斷循環，將會在Flow cell 的固相表面上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。

4、單鹼基延伸測序

在測序的flow cell中加入四種熒游標記的dNTP 、DNA聚合酶以及接頭引物進行擴增，在每一個測序簇延伸互補鏈時，每加入一個被熒游標記的dNTP就能釋放出相對應的熒光，測序儀通過捕獲熒光信號，並通過計算機軟體將光信號轉化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。

5、數據分析

這一步嚴格來講不能算作測序操作流程的一部分，但是只有通過這一步前面的工作才顯得有意義。測序得到的原始數據是長度只有幾十個鹼基的序列，要通過生物信息學工具將這些短的序列組裝成長的Contigs甚至是整個基因組的框架，或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上告凳戚，粗孝並進一步分析得到有生物學意義的結果。

(9)基因序列分析處理方法擴展閱讀

第二代測序技術的核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列，現有的技術平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。

Illumina/Solexa Genome Analyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。在Sanger等測序方法的基礎上，通過技術創新，用不同顏色的熒游標記四種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋襪陵放出不同的熒光，根據捕捉的熒光信號並經過特定的計算機軟體處理，從而獲得待測DNA的序列信息。

㈩ 如何分析基因序列

1、雙序列比對需要BLAST，NCBI上有，也可以在網路搜索本地版的下載下來。

2、多序列比對需要cluxtal X軟體， 要把所有基因序列fasta格式放在一起，需要輸入所有序列的fasta格式，然後進行多序列聯配。