蛋白質分析方法的異同

① 常用來測定蛋白質含量的方法有哪些，優缺點是什麼

①凱氏定氮法
原理：蛋白質平均含氮量為16%。當樣品與濃硫酸共熱，蛋白氮轉化為銨鹽，在強鹼性條件下將氨蒸出，用加有指示劑的硼酸吸收，最後用標准酸滴定硼酸，通過標准酸的用量即可求出蛋白質中的含氮量和蛋白質含量。
②雙縮脲法
原理：尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲，在鹼性溶液中雙縮脲可與Cu2+形成穩定的紫紅色絡合物。蛋白質中的肽鍵實際上就是醯胺鍵，故多肽、蛋白質等都有雙縮脲（biuret）反應，產生藍色或紫色復合物。比色定蛋白質含量。
缺點：靈敏度低，樣品必須可溶，在大量糖類共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 (數mg)，且會受樣品中 硫酸銨 及 Tris 的干擾，但 准確度 較高，不受蛋白質的種類影響。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當於雙縮脲試劑（鹼性銅試劑），試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。
在鹼性條件下，蛋白質中的巰基和酚基等可將Cu2+還原成Cu+， Cu+能定量地與Folin－酚試劑反應生成藍色物質，600nm比色測定蛋白質含量。
靈敏度較高(約 0.1 mg)，但較麻煩，也會受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。 步驟中各項試劑的混合，要特別注意均勻澈底，否則會有大誤差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收進行測定。
280nm-260nm的吸收差法：若樣品液中有少量核酸共存按下式計算：
蛋白質濃度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260為角標）
⑤色素結合法（Bradford 法）
直接測定法：利用蛋白質與色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）結合物的光吸收用分光光度法進行測定。
考馬斯亮蘭（CBG）染色法測定蛋白質含量。CBG 有點像指示劑，會在不同的酸鹼度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍色。當 CBG接到蛋白質上去的時候，因為蛋白質會提供 CBG一個較為中性的環境，因此會變成藍色。當樣本中的蛋白質越多，吸到蛋白質上的CBG也多，藍色也會增強。因此，藍色的呈色強度，是與樣本中的蛋白質量成正比。
間接測定法：蛋白質與某些酸性或鹼性色素分子結合形成不溶性的鹽沉澱。用分光光度計測定未結合的色素，以每克樣品結合色素的量來表示蛋白質含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4』-二羧-2,2』-二喹啉）法與Lowry法相似，主要差別在鹼性溶液中，蛋白質使Cu2+轉變Cu+後，進一步以BCA 取代Folin試劑與Cu+結合產生深紫色，在波長562 nm有強的吸收。
它的優點在於鹼性溶液中BCA 比Folin試劑穩定，因此BCA與鹼性銅離子溶液結合的呈色反應只需一步驟即完成。靈敏度Lowry法相似。
本方法對於陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度，較不受干擾，但會受還原糖 及EDTA的干擾。
⑦膠體金測定法
膠體金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶膠，呈洋紅色，具有高電子密度，並能與多種生物大分子結合。
膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體遇蛋白質轉變為藍色，顏色的改變與蛋白質有定量關系，可用於蛋白質的定量測定。
⑧其他方法
有些蛋白質含有特殊的 非蛋白質基團，如 過氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團，可測 403 nm 波長的吸光來定量之。 含特殊金屬的酶 (如鎘)，則可追蹤該金屬。

② 蛋白質分離方法有哪些,它們的特點各是什麼

1.根據分子大小不同進行分離純化
蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白
質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離.根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等.透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法.透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離.超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程.這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開.它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽.由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小.所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果
離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法.當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開.例如,在從大米渣中提取蛋白質的實驗中,加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後,再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離[3].使蛋白質在具有密度梯度的介質中離心的方法稱為密度梯度(區帶)離心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根據所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度.密度梯度離心曾用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產品純度高但產量偏低.蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白.凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最有效的方法之一.凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構,而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動並最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子後流出柱外.目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠等.在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1].凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質[7].
2.根據溶解度不同進行分離純化
影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等.但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的.常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等.
等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法.每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最
低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解.因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質.王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%.李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來.等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取.李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8.他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73·78%.另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11].利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12].
蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析.應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多.在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%[10].鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產.由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性.為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%.利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13].
有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質.例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14].由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性.因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決.對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液.冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白.冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15].
萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質.雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取.此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高.對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎.目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中.採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16].
反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的.反膠團是當表面活性劑
在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體.這種方法的優點是萃取過程中蛋
白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護.程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質.
3.根據電荷不同進行分離純化
根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類.
在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這
種現象稱為電泳.聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質.它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少.等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定.利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的.在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶.孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用.結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大.
離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法.離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成.帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂.離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化.當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同.陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來.反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來.李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純.另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7].
4. 利用對配體的特異親和力進行分離純化
親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法.它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高.應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件.近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20].親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21].范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達到62·5%.該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定.

③ 常用來測定蛋白質含量的方法有哪些優缺點是什麼

1、凱氏定氮法

凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然後在鹼性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來並為過量的硼酸液吸收，再以標准鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。

由於蛋白質含氮量比較恆定，可由其氮量計算蛋白質含量，故此法是經典的蛋白質定量方法。

優點：可用於所有食品的蛋白質分析中；操作相對比較簡單；實驗費用較低；結果准確，是一種測定蛋白質的經典方法；用改進方法（微量凱氏定氮法）可測定樣品中微量的蛋白質。

缺點：凱氏定氮法只是一個氧化還原反應,把低價氮氧化並轉為氨鹽來測定,而不能把高價氮還原為氮鹽的形式,所以不可以測出物質中所有價態的氮含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是一個用於鑒定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑是一個鹼性的含銅試液，呈藍色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配製。

當底物中含有肽鍵時（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應蛋白質單位1-10mg。

優點：測定速度較快，干擾物質少，不同蛋白質產生的顏色深淺相近。

缺點：①靈敏度差； ② 三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會干擾該反應。

3、酚試劑法

取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

優點：靈敏度高，對水溶性蛋白質含量的測定很有效。

缺點：①費時，要精確控制操作時間；②酚法試劑的配製比較繁瑣。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

優點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定後能回收。 

缺點：①測定蛋白質含量的准確度較差，專一性差； ②干擾物質多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。

5、考馬斯亮藍法

考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合後，其對可見光的最大吸收峰從 465nm 變為 595nm。

在考馬斯亮藍 G-250 過量且濃度恆定的情況下，當溶液中的蛋白質濃度不同時，就會有不同量的考馬斯亮藍 G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉變有一定的數量關系。

一般情況，當溶液中的蛋白質濃度增加時，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用考馬斯亮藍 G-250 顯色法來測定溶液中蛋白質的含量。

優點：靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡合劑的影響，適合大量樣品的測定。

缺點：由於各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用於不同蛋白質測定時有較大的偏差。

④ 蛋白質分離方法有哪些它們的特點各是什麼

蛋白質分離鑒定的常用方法：
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沉澱法
沉澱法也稱溶解度法。其純化生命大分子物質的基本原理是根據各種物質的結構差異性來改變溶液的某些性森並質，進而導致有效成分的溶解度發生變化。
1、鹽析法
鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出。
2、有機溶劑沉澱法
有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。
3、蛋白質沉澱劑
蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用，常見的有鹼性蛋白質、凝集素和重金屬等。
4、聚乙二醇空滾沉澱作用
聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用。
5、選擇性沉澱法
根據各種蛋白質在不同物理化學因子作用下穩定性不同的特點，用適當的選擇性沉澱法，即可使雜蛋白變性沉澱，而欲分離的有效成分則存在於溶液中，從而達到純化有效成分的目的。

吸附層析
1、吸附柱層析
吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動此虧跡相構成柱的一種層析方法。
2、薄層層析
薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。
3、聚醯胺薄膜層析
聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。

離子交換層析
離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統中進行的。離子交換劑是由基質、電荷基團和反離子構成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，或藉助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。

凝膠過濾
凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠具有網狀結構，小分子物質能進入其內部，而大分子物質卻被排除在外部。當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。

⑤ 標准曲線法與標准管法測蛋白質含量有何異同

標准管法更容易區分出蛋白質的差豎纖高低。

標准曲線法簡介：

標准曲線法，也稱外標法或直接比較法，是一種簡便、快速的定量方法。與分光光度分析中的標准曲線法相似，首先用欲測組分的標准樣品繪制標准曲線。

用標准樣品配製成不同濃度的標准系列，在與待測組分相同的色譜條件下，等體積准確進樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標准曲線，此標准曲線應是通過原點的直線。若標准曲線不通過原點，則說明存在虛仿系統誤差。標准曲線纖或的斜率即為絕對校正因子。

⑥ 蛋白質的分離方法有哪些它們各依據蛋白質的什麼性質或特點

（一）水溶液提取法
稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑,通常用量是原材料體積的1-5倍,提取時需要均勻的攪拌,以利於蛋白質的溶解.提取的溫度要視有效成份性質而定.一方面,多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大,因此,溫度高利於溶解,縮短提取時間.但另一方面,溫度升高會使蛋白質變性失活,因此,基於這一點考慮提取蛋白質和酶時一般採用低溫（5度以下）操作.為了避免蛋白質提以過程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸,碘乙酸等）.
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇.
1、pH值
蛋白質,酶是具有等電點的兩性電解質,提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH
范圍內.用稀酸或稀鹼提取時,應防止過酸或過鹼而引起蛋白質可解離基團發生變化,從而導致蛋白質構象的不可逆變化,一般來說,鹼性蛋白質用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白質用偏鹼性的提取液.
2、鹽濃度
稀濃度可促進蛋白質的溶,稱為鹽溶作用.同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合,具有保護蛋白質不易變性的優點,因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽,一般以0.15摩爾.升濃度為宜.緩沖液常採用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液.
（二）有機溶劑提取法
一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶,不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀鹼中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑,它們具的一定的親水性,還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液.但必須在低溫下操作.丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越,一是因為丁醇親脂性強,特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性,在溶解度范圍內（度為10%,40度為6.6%）不會引起酶的變性失活.另外,丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣,也適用於動植物及微生物材料.
二、蛋白質的分離純化
蛋白質的分離純化方法很多,主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質的溶解度增加,此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時,蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出,這種現象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質溶液中,高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力,可奪取蛋白質分子的水化層,使之「失水」,於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出.鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好.由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱.
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外,一般可在室溫中進行.一般溫度低蛋白質溶介度降低.但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低,更容易鹽析.（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低.（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時,欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）.因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質含量在2.5-3.0%.
蛋白質鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等.
其中應用最多的硫酸銨,它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M,即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M,即676克/升）,在這一溶解度范圍內,許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質變性.硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間,當用其他pH值進行鹽析時,需用硫酸或氨水調節.
蛋白質在用鹽析沉澱分離後,需要將蛋白質中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙）,用緩沖液進行透析,並不斷的更換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進行.此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短.
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質的等電點有差別,可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結合用.
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數蛋白質溶解度降低並析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質較易變性,應在低溫下進行.
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開.
超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質分子通過半透膜,而蛋白質留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質.
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一.柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex
ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）.
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同,可將其分開.
1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下,因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開.值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質作為載體,電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度,當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時,到達各自等電點的pH位置就停止,此法可用於分析和制備各種蛋白質.
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT
FACE="宋體"
LANG="ZH-CN">纖維素）,當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上,隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來.（詳見層析技術章）
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity
chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法,它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來,而且純度很高.這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合.其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在,每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質,因此蛋白質的分離（Separation）,提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分,至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來,因此往往採取幾種方法聯合使用.
細胞的破碎
1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液,放置於筒內約1/3體積,蓋緊筒蓋,將調速器先撥至最慢處,開動開關後,逐步加速至所需速度.此法適用於動物內臟組織、植物肉質種子等.
2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中,再套入研桿來回研磨,上下移動,即可將細胞研碎,此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高,適用於量少和動物臟器組織.
3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液,使細胞急劇震盪破裂,此法多適用於微生物材料,用大腸桿菌制備各種酶,常選用50-100毫克菌體/毫升濃度,在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾,此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱,應採取相應降溫措施.對超聲波敏感和核酸應慎用.
4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍,室溫融解,反復幾次,由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹,使細胞結構破碎.
5、化學處理法：有些動物細胞,例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞,細菌細胞壁較厚,可採用溶菌酶處理效果更好.
無論用哪一種方法破碎組織細胞,都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中,使大分子生物降解,導致天然物質量的減少,加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺醯氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,還可通過選擇pH、溫度或離子強度等,使這些條件都要適合於目的物質的提取.
濃縮、乾燥及保存
一、樣品的濃縮
生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀,為了保存和鑒定的目的,往往需要進行濃縮.常用的濃縮方法的：
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低,減壓的真空度愈高,液體沸點降得愈低,蒸發愈快,此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮.
2、空氣流動蒸發濃縮
空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液,表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室,用電扇對准吹風,使透過膜外的溶劑不沁蒸發,而達到濃縮目的,此法濃縮速度慢,不適於大量溶液的濃縮.
3、冰凍法
生物大分子在低溫結成冰,鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中,操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體,然後緩慢地融解,利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的.如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時,不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面,蛋白質和酶則集中於下層溶液中,移去上層冰塊,可得蛋白質和酶的濃縮液.
4、吸收法
通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮.所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應,對生物大分子不吸附,易與溶液分開.常用的吸收劑有聚乙二醇,聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等,使用聚乙二醇吸收劑時,先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡,外加聚乙二醇復蓋置於4度下,袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積.
5、超濾法
超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法,不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時,溶劑和小分子透過,大分子受阻保留,這是近年來發展起來的新方法,最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽,並具有成本低,操作方便,條件溫和,能較好地保持生物大分子的活性,回收率高等優點.應用超濾法關鍵在於膜的選擇,不同類型和規格的膜,水的流速,分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同,必須根據工作需要來選用.另外,超濾裝置形式,溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響.Diaflo
超濾膜的分子量截留值：
膜名稱分子量截留值孔的大的平均直徑
XM－300300,000140
XM－200100,00055
XM－5050,00030
PM－30 30,00022
UM－2020,00018
PM－1010,00015
UM－21,00012
UM05500 10
用上面的超濾膜製成空心的纖維管,將很多根這樣的管攏成一束,管的兩端與低離子強度的緩沖液相連,使緩沖液不斷地在管中流動.然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中.當緩沖液流過纖維管時,則小分子很易透過膜而擴散,大分子則不能.這就是纖維過濾秀析法,由於透析面積增大,因而使透析時間縮短10倍.
二、乾燥
生物大分子制備得到產品,為防止變質,易於保存,常需要乾燥處理,最常用的方法是冷凍乾燥和真空乾燥.真空乾燥適用於不耐高溫,易於氧化物質的乾燥和保存,整個裝置包括乾燥器、冷凝器及真空乾燥原理外,同時增加了溫度因素.在相同壓力下,水蒸汽壓隨溫度下降而下降,故在低溫低壓下,冰很易升華為氣體.操作時一般先將待乾燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體,然後在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去.此法干後的產品具有疏鬆、溶解度好、保持天然結構等優點,適用於各類生物大分子的乾燥保存.
三、貯存
生物大分子的穩定性與保存方法的很大關系.乾燥的製品一般比較穩定,在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化,貯藏要求簡單,只要將乾燥的樣品置於乾燥器內（內裝有乾燥劑）密封,保持0－4度冰箱即可,液態貯藏時應注意以下幾點.
1、樣品不能太稀,必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏,樣品太稀易使生物大分子變性.
2、一般需加入防腐劑和穩定劑,常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等.蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等,如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性.此外,鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用.核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標准緩沖液中.
3、貯藏溫度要求低,大多數在0度左右冰箱保存,有的則要求更低,應視不同物質而定.

⑦ 蛋白質分離方法有哪些，它們的特點各是什麼

蛋白質是大分子，相對於大多數的無機物和有機物而言，蛋白質的分離方法：

一、根據分子大小來分離蛋白質分子。

蛋白質分子屬於大分子，它與一些小分子，可以通過透析和超過濾的方法進行分離。

蛋白質分子不能通過半透膜，而小分子可以通過半透膜的原理，進行透析。常用的半透膜是玻璃紙或稱賽璐玢紙、火棉紙和其它改型纖維素材料。

二、根據溶解度的差別來分離蛋白質分子。

蛋白質的鹽溶和鹽析方法。

鹽溶：在蛋白質水溶液中，加入少量的中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等，會增加蛋白質分子表面的電荷，增強蛋白質分子與水分子的作用，從而使蛋白質在水溶液中的溶解度增大。

鹽析：向蛋白質溶液中加入無機鹽類而使某種物質溶解度降低，而出現溶液分層的現象，從而分離蛋白質。

除此之外，分離蛋白質分子的方法還有許多，例如：電泳、離子交換層析、疏水作用層析等。