基因差異性分析檢驗方法

『壹』 基因檢測方法有哪些

基因是遺傳的基本單元，攜帶有遺傳信息的DNA或RNA序列，通過復制，把遺傳信息傳遞給下一代，指導蛋白質的合成來表達自己所攜帶的遺傳信息，從而控制生物個體的性狀表達。基因檢測是通過血液、其他體液、或細胞對DNA進行檢測的技術，是取被檢測者外周靜脈血或其他組織細胞，擴增其基因信息後，通過特定設備對被檢測者細胞中的DNA分子信息作檢測，分析它所含有的基因類型和基因缺陷及其表達功能是否正常的一種方法，從而使人們能了解自己的基因信息，明確病因或預知身體患某種疾病的風險。
基因檢測可以診斷疾病，也可以用於疾病風險的預測。疾病診斷是用基因檢測技術檢測引起遺傳性疾病的突變基因。應用最廣泛的基因檢測是新生兒遺傳性疾病的檢測、遺傳疾病的診斷和某些常見病的輔助診斷。
一般有三種基因檢測方法：生化檢測、染色體分析和DNA分析。
1.生化檢測
生化檢測是通過化學手段，檢測血液、尿液、羊水或羊膜細胞樣本，檢查相關蛋白質或物質是否存在，確定是否存在基因缺陷。用於診斷某種基因缺陷，這種缺陷是因某種維持身體正常功能的蛋白質不均衡導致的，通常是檢測測試蛋白質含量。還可用於診斷苯丙酮尿症等。
2.染色體分析
染色體分析直接檢測染色體數目及結構的異常，而不是檢查某條染色體上某個基因的突變或異常。通常用來診斷胎兒的異常。
常見的染色體異常是多一條染色體，檢測用的細胞來自血液樣本，若是胎兒，則通過羊膜穿刺或絨毛膜絨毛取樣獲得細胞。將之染色，讓染色體凸顯出來，然後用高倍顯微鏡觀察是否有異常。
3.DNA分析
DNA分析主要用於識別單個基因異常引發的遺傳性疾病，如亨廷頓病等。DNA分析的細胞來自血液或胎兒細胞。
基因檢測可以分為以下五類：
1.基因篩檢
主要是針對特定團體或全體人群進行檢測。大多數通過產前或新生兒的基因檢測以達到篩檢的目的。
2.生殖性基因檢測
在進行體外人工授精階段可運用，篩檢出胚胎是否帶有基因變異，避免胎兒患有遺傳性疾病。
3.診斷性檢測
多數用來協助臨床用葯指導。
4.基因攜帶檢測
基因攜帶者如果與某些特殊基因相結合，可能會導致下一代患基因疾病，通過基因攜帶者的檢測可篩檢出此種可能，作為基因攜帶者婚前檢查、生育時的參考。
5.症狀出現前的檢測
檢測目的是了解健康良好者是否帶有某種突變基因，而此基因與特定疾病的發生有密切的聯系。
臨床意義
1.用於疾病的診斷
如對結核桿菌感染的診斷，以前主要依靠痰、糞便或血液培養，整個檢驗流程需要在兩周以上，採用基因診斷的方法，不僅敏感性大大提高，而且在短時間內就能得到結果。
2.了解自身是否有家族性疾病的致病基因，預測患病風險
資料證實10%～15%的癌症與遺傳有關，糖尿病、心腦血管疾病等多種疾病都與遺傳因素有關。如具有癌症或多基因遺傳病（如老年痴呆、高血壓、糖尿病等）的人可找出致病的遺傳基因，就能夠有針對性地調整生活方式，預防或者延緩疾病的發生。
3.正確選擇葯物，避免濫用葯物和葯物不良反應
由於個體遺傳基因上的差異，不同的人對外來物質產生的反應也會有所不同，因此部分患者使用正常劑量的葯物時，可能會出現葯物過敏、紅腫發疹的現象。根據基因檢測的結果，可制定特定的治療方案，從而科學地指導使用葯物，避免葯物毒副反應。

『貳』 2-△△ct如何進行差異性檢驗

可以採用輪圓以下步驟：
1、確認實驗目的和研究問題：確定需要比較的實驗組和對照組，以及目標基因和參考基因等關鍵信息。
2、進行實驗操作和數據收集：按照qPCR實驗流程進行樣品處理、RNA提取、cDNA合成、熒光定量PCR反應臘橡塌等操作，並記錄每個樣品的Ct值和反應曲線數據。
3、計算ΔCt和ΔΔCt：根據實驗數據，計算每個樣品的ΔCt值和ΔΔCt值，即實驗組與對照組的Ct值差異和ΔCt值之間的差異。
4、進行差異性分析：根據ΔΔCt值，使如賀用統計學方法進行差異性分析，比較實驗組和對照組在目標基因表達水平上的差異是否顯著。常見的統計學方法包括t檢驗、方差分析（ANOVA）、非參數檢驗等。

『叄』 💉🈯[生信基礎知識]幾種常用的差異表達基因識別方法FC,T檢驗,SAM

目前常用的幾款差異表達進識別方法有：FC、T檢驗、SAM等

FC(Fold Change) 演算法是最早用於識別 兩種 不同的實驗條件下基因表達水平存在差異的演算法，其演算法的原理是計算基因在兩類樣本中平均表達水平的倍數值，若該值達到預先設定的閾值(一般設置為2，在以2為底的對數表達比中為大於1或小於-1)，則判定基因為差異表達（DE，different expression）基因，計算公式如下，其中，mean(X(i))與mean（Y(i)）代表基因 i 在兩類樣本中的平均表達值：

在很多實際應用中，常常有人把FC值做log2轉換，log2fc 值相較於fc的有點在於：log2fc的值有正負值之分，很容易看出2個group之間的上下調關系>
關於limma包差異分析結果的logFC解釋

t檢驗(t-test) ，常用來識別兩類樣本中DE基因的演算法。其主要原理為：對每一個基因計算一個t統計量來衡量兩類樣本中基因表達的差異，然後根據t分布計算顯著性p值來衡量這種差異的顯著性。計算公式如下，其中，分子代表基因i在兩類樣本中的平均表達差值，分母代表基因i在所有樣本中的標准誤：

由於t檢驗要求數據呈現正太分布，所以公式中基因的表達值為測量值經過標准化後的值，反應的是兩類樣本間基因表達的倍數變化，也存在FC方法同樣的偏向性。此外，對基礎表達量低的基因來說，一個微小變異程度（標准誤）可能導致一個大的絕對t統計值,從而被識別為DE基因，即使在兩類條件下這個基因的平均表達水平的差異很小。低表達的基因比高表達的基因更容易產生大的t統計量。已有研究指出，數據的信噪比會隨著基因表達量的增高而降低，這就意味著，低表達的基因更容易受到雜訊的影響而產生誤差。因此，t檢驗同樣傾向於識別表達水平低的基因作為DE基因。

SAM(Significance analysis of microarrays) 演算法用於微陣列基因表達譜數據識別DE基因 。SAM演算法與t檢驗相似，但為了使具有較小標准誤的基因不會被誤判為DE基因，SAM在t統計量的分母中增加了校正值，提高了t檢驗的穩定性。計算公式如下，其中S0 為樣本殘差標准誤的校正值：

上還有一些關於差異表達的文章，你可以也看看
【r<-生信|實戰】用方差分析差異表達基因
基因晶元（Affymetrix）分析3：獲取差異表達基因
差異表達基因
差異表達分析圖標結果釋義

1.趙發林, 閆曉光, 李康. 幾種差異基因分析方法及篩選效果的比較[J]. 中國衛生統計, 2008, 25(4):354-356.
2.黃海燕 基於可重復性評價識別與癌相關的高表達基因

『肆』 怎麼判斷差異表達的基因

判斷差異表達的基因常用的分析方法有三類，第一類稱之為倍數分析，計算每一個基因在兩個條件下的
ratio
值，若高殲橋大於給定閾值，則為表達差異顯著的基因;第二類方法採用統計分析中的
t
檢驗和方差分析戚猛，計算表達差異的置信度，來分析差異是否具有統計改脊顯著性;第三類是建模的方法，通過確定兩個條件下的模型參數是否相同來判斷表達差異的顯著性，例如貝葉斯方法。

『伍』 差異分析

基因的差異表達，即發現一組在正常樣本和患病樣本中表達不同的基因。

最簡單的是閾值法，用倍數分析基因表達水平差異，即計算基因在兩個條件下表達水平的比值（癌症和正常），確定比值的閾值，將絕對值大於此閾值的基因判斷為差異基因。

最常用的T-test、ANOVA(方差分析)或者稱為F檢驗。

T-test 檢驗是差異基因表達檢測中常用的統計方法，通過合並樣本間可變的數據，來評價差異表達，用於判斷某一基因在兩個樣本中是否有差異表達。由於晶元實驗成本較高，樣本量較少，從而對總體方差的估計不很准確，T檢驗的檢驗效能降低。

SAM演算法就是通過控制FDR值糾正多重假設檢驗中的假陽性率。SAM 方法檢驗差異表達，通過對分母增加一個常量 T 檢驗過程減小了假陽性發生的概率。根據文獻記載，相比較其他演算法，SAM演算法更為穩定，篩選出的結果也更為准確。SAM方法以q-value< 0.05作為篩選差異表達基因的標准，從公式上來看，p-value和q-value較為相似，而差異篩選是一個典型的多重假設檢驗過程。對於多重假設檢驗，單次檢驗中差異顯著基因的假陽性率(p-value較小)可能會較大，而 q-value 和 FDR值較常見的BH校正方法 得到的FDR值而言，改進了其對假陽性估計的保守性。

火山圖可反映總體基因的表達情況， 橫坐標代表log2（Fold Change）,縱坐標表示-log10（P值），每個點代表一個基因，顏色用以區分基因是否差異表達， 圖中橙色的點代表差異表達基因，藍色的點代表沒有差異表達的基因。

聚類圖可以衡量 樣本或基因之間表達的相似性 。 如上圖所示的聚類圖中， 橫坐標代表樣本聚類 ，一列代表一個樣本，聚類基於樣本間基因表達的相似性，樣本間基因表達越接近，靠的越近，以此類推。 縱坐標代表基因聚類 ，一行代表一個基因，聚類基於基因在樣本中表達的相似性，基因在樣本中表達越接近，靠的越近，以此類推。 色階代表基因表達豐度 ，越紅代表上調得越明顯，越綠代表下調得越明顯。

REF：
https://www.jianshu.com/p/b55276e46f0c

https://blog.csdn.net/u012325865/article/details/87344725

http://college.gcbi.com.cn/archives/1616

https://www.cnblogs.com/leezx/p/7132099.html

『陸』 基因差異表達分析方法

問題一：怎麼判斷差異表達的基因 判斷差異表達的基因：

不同基因控制合成的蛋白質不同,蛋白質不同表現的生物性狀就不同，從而表達出了差異.

問題二：怎麼判斷差異表達的基因 真核生物中，從個體的生長、發育、衰老、死亡，到組織的得化、調亡以及細胞對各種生物、理化因子的應答，本質上都涉及基因的選擇性表達。高等生物大約有30000個不同的基因，但在生物體內任意8細胞中只有10%的基因的以表達，而這些基因的表達按特定的時間和空間順序有序地進行著，這種表達的方式即為基因的差異表達。其包括新出現的基因的表達與表達量有差異的基因的表達。生物體表現出的各種特性，主要是由於基因的差異表達引起的。
由於基因的差異表達的變化是調控細胞生命活動過程的核心機制，通過比較同一類細胞在不同生理條件下或在不同生長發育階段的基因表達差異，可為分析生命活動過程提供重要信息。研究基因差異表達的主要技術有差別雜交（differential hybridization）、扣除（消減）雜交（subtractive hybridization of cDNA，SHD）、mRNA差異顯示（mRNA differential display， DD）、抑制消減雜交法（suppression subtractive hybridization，SSH）、代表性差異分析（represential display *** ysis，RDA）、交互扣除RNA差別顯示技術（reciprocal subtraction differential RNA display）、基因表達系列分析（serial *** ysis of gene expression，SAGE）、電子消減（electronic subtraction）和DNA微列陣分析（DNA microarray）等。
一、差別雜交與扣除雜交
差別雜交（differential hybridization）又叫差別篩選（differential screening），適用於分離經特殊處理而被誘發表達的mRNA的cDNA克隆。為了增加這種方法的有效性，後來又發展出了扣除雜交（subtractive hybridization）或扣除cDNA克隆（subtractive cDNA cloning），它是通過構建扣除文庫（subtractive library）得以實現的。
（一）差別雜交
從本質上講，差別雜交也是屬於核酸雜交的范疇。它特別適用於分離在特定組織中表達的基因、在細胞周期特定階段表達的基因、受生長因子調節的基因、以及在特定發育階段表達的或是參與發育調節的基因，同時亦可有效地用來分離經特殊處理而被誘發表達的基因。目前，差別雜交篩選法在克隆基因的分離工作中有著相當廣泛的用途。
差別雜交的技術基礎十分簡單，它不需要任何有關的目的基因的核苷酸序列信息，而重要的是耍擁有兩種不同的細胞群體：在一個細胞群體中目的基因正常表達，在另一個細胞群體中目的基因不表達。在這種情況下便可制備到兩種不同的mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA類型的總mRNA群體，其二是不含有目的基因mRNA類型的總mRNA群體。因此，可以通過這兩種總mRNA（或是它們的cDNA拷貝）為探針的平行雜交，對由表達目的基因的細胞總mRNA構建的克隆庫進行篩選。當使用存在目的基因的mRNA探針時，所有包含著重組體的菌落都呈陽性反應，在X光底片上呈現黑色斑點，而使用不存在目的基因的mRNA探針時，除了含有目的基因的菌落外，其餘的所有菌落都呈陽性反應，在X光底片上呈現黑色斑點。比較這兩種底片並對照原平板，便可以挑選出含目的基因的菌落，供作進一步研究使用。
差別雜交篩選技術已被成功地用於分析爪蟾和粘菌的發育問題。這兩個應用例子表明，處於不同發育狀態或階段的......>>

問題三：請教關於韋恩圖分析差異表達基因的問題 差異表達基因分析是根據表型協變數（分類變數）鑒定組間差異表達，它屬於監督性分類的一種。在鑒定差異表達基因以前，一般需要對表達值實施非特異性過濾（在機器學習框架下屬於非監督性分類），因為適當的非特異性過濾可以提高差異表達基因的檢出率、甚至是功效。R分析差異表達基因的library有很多，但目前運用最廣泛的Bioconctor包是limma。
鑒定差異表達基因是表達譜晶元分析pipeline中必須的分析步驟。差異表達基因分析是根據表型協變數（分類變數）鑒定組間差異表達，它屬於監督性分類的一種。在鑒定差異表達基因以前，一般需要對表達值實施非特異性過濾（在機器學習框架下屬於非監督性分類），因為適當的非特異性過濾可以提高差異表達基因的檢出率、甚至是功效。R分析差異表達基因的library有很多，但目前運用最廣泛的Bioconctor包是limma。
本專題示例依然來自GEO資料庫中檢索號為GSE11787 的Affymetrix晶元的數據，數據介紹參閱專題一。
>library(limma)
>design colnames(design) fit contrast.matrix fit fit2 fit2 resultssummary(results)
>vennCounts(results)
>vennDiagram(results)
比較遺憾的是，目前limma自帶的venn作圖函數不能做超過3維的高維venn圖，只能畫出3個圓圈的venn圖，即只能同時對三個coef進行venn作圖。上面的venn圖只有一個coef，太簡單了。下面是一個由本實驗室晶元數據得出的三個coef的venn圖例：
>heatDiagram(results,fit2$coef)
紅色為control中（與LPS相比）的高表達基因，綠色為control中（與LPS相比）的低表......>>

問題四：有做基因差異表達分析的么 有做基因差異表達分析的
利用基因晶元研究乾旱脅迫下玉米基因表達
玉米是全球第一大作物、中國第二大作物，而乾旱是影響其產量的重要限制因素。山東大學生命科學院張舉仁教授的課題組利用基因晶元技術研究了開花期玉米頂葉乾旱脅迫下基因的表達。開花期是玉米需水臨界期，對乾旱脅迫反應最敏感，此時逢乾旱會使產量下降幅度最大。張教授的課題組以開花期玉米為材料，分別對其進行短期和長期的乾旱脅迫，採用全基因組晶元研究了頂葉中基因的表達情況。分析的結果表明，有197個基因在短期脅迫下差異表達（53%上調），而在長期脅迫下，則有1009個基因差異表達（32%上調）。分離得到的差異表達基因中約有一半的基因功能未知，其他基因按功能則可分為：代謝相關；細胞信號轉導；轉錄相關；蛋白質合成；細胞防禦；細胞運輸；亞細胞定位等幾大類。分析實驗表明，在短期脅迫下上調表達的基因中，約有1/3的已知功能基因屬於信號轉導功能的分類范疇，參與細胞內不同的信號轉導途徑，這表明信號轉導相關基因在玉米對乾旱的早期反應中起重要作用。而在長期乾旱條件下，頂葉中大量的代謝相關基因差異表達。
吸煙者肺細胞的基因表達模式有助於肺癌的早期診斷
在全世界癌症患者的死亡率中，肺癌的死亡率位居前列。肺癌高死亡率的主要原因之一是缺乏早期診斷工具。研究人員在3月出版的《自然―醫學》中報道：吸煙者肺細胞的基因表達模式也許有助於肺癌的早期診斷。
眾所周知，吸煙是肺癌的風險因子，因此吸煙者被認為是肺癌的高風險人群。吸煙者的正常上皮細胞的基因表達模型是否可用於肺癌存在狀態的一種生物標志呢？AvrumSpira和同事進行了這一研究。在預測患者是否會向癌症發展時，他們研究的生物標志的准確率達到90%。當與其他歷史數據結合在一起，准確率可增加到95%。

問題五：怎麼判斷差異表達的基因 細胞分化就是基因表達差異,同一個體各個細胞內的基因是相同的,但它們的形態結構和功能不同,就是基因選擇性表達的結果,造成基因差異

問題六：如何從轉錄組數據找出差異表達基因 轉錄本是一個基因序列通過一種剪切後所得的能RNA.以前說轉錄本都是說表達蛋白的.現在LncRNA的研究多了,也說是一個轉錄本了.還有沒有參考基因組序列的,一般是不可能去GO功能注釋的.因為去功能注釋的時候要有一個背景.

問題七：如何分析差異表達基因的ma-plot圖 差異表達基因分析是根據表型協變數（分類變數）鑒定組間差異表達，它屬於監督性分類的一種。在鑒定差異表達基因以前，一般需要對表達值實施非特異性過濾（在機器學習框架下屬於非監督性分類），因為適當的非特異性過濾可以提高差異表達基因的檢出率、甚至是功效。R分析差異表達基因的library有很多，但目前運用最廣泛的Bioconctor包是limma。
鑒定差異表達基因是表達譜晶元分析pipeline中必須的分析步驟。差異表達基因分析是根據表型協變數（分類變數）鑒定組間差異表達，它屬於監督性分類的一種。在鑒定差異表達基因以前，一般需要對表達值實施非特異性過濾（在機器學習框架下屬於非監督性分類），因為適當的非特異性過濾可以提高差異表達基因的檢出率、甚至是功效。R分析差異表達基因的library有很多，但目前運用最廣泛的Bioconctor包是limma。

問題八：求助基因差異表達結果分析 是不是誤差造成的，可以做一次重復看一下差異是否真的是不明顯。也或許在你說的那個濃度，你所檢測的基因表達不敏感，是一個臨界濃度？ 我只是推測的。僅供參考。

『柒』 檢測基因表達水平差異的方法有哪些

基因的表達是dna-rna-蛋白,期間有轉錄水平調控、轉錄後調控、翻譯後調控等多種調控機制影響該基因的表達.

所以蛋白水平高低的原因就可能是多方面的.蛋白表達多,可能是mrna多,也可能mrna變化不大,而是翻譯多了；蛋白表達少,原因亦然.

從2個水平檢測一個基因的表達,可以更全面地了解該基因在該組織某個時期或某種條件下的變化受到什麼水平的調控.

所謂基因表達,就是從dna到mrna再到蛋白的一個過程,基因表達水平一般是通過該基因轉錄的mrna的多少來衡量的.

每個基因轉錄產生的mrna的量,是受到時空等多種因素調控的,個體在不同的生長發育階段,或者不同的組織水平,基因轉錄出mrna的量都是不一樣的.

例如,當某種植物長期生長在高鹽的環境里,該植物體內與抗鹽相關的基因的表達量就會增加,以適應這種高鹽環境,是植物能夠生存下來,這時植物抗鹽相關的基因表達水平就相對高

檢測基因表達的方法：

轉錄水平檢測：rt-pcr，real-time pcr，northern blot

翻譯水平檢測：western blot

還有直接檢測，如報告基因、融合熒光蛋白等。

rt-pcr是反轉錄pcr，是半定量方式。real-time pcr可以精確定量。 二者不同。後者為了區別於rt-pcr，一般不縮寫。

各位觀眾老爺們大家好!我是吆五，打算從今以後不定期分享一些生物類的專業知識。

一方面供自己學習積累，另一方面也希望對大家有所幫助。

生物是很枯燥的呢

『捌』 篩選差異基因的方法

SAM方法由Tusher、Tibshirani、Chu於2001 年率先提出,是一類用於微陣列基因表達譜數據篩選差異表達基因的統計分析方法。SAM方法適用於不同設計和資料類型的微陣列數據差異表達基因的篩選。SAM方法一般採用permutation 演算法估計假發現率( false discoveryrate , FDR) ,達到控制多重檢驗錯誤率的目的。Storey(2001)針對基因表達譜數據統計分析中的多重檢驗問題,提出了一種新的第Ⅰ類錯誤測度陽性假發現率(positive falsediscovery rate, pFDR) ,並就該測度的合理性進行了論證。Storey (2002)改進了控制重檢驗錯誤率的方法,提出了一種直接方法,即先憑借經驗固定拒絕域,然後估計pFDR,若某基因的pFDR小於檢驗水準,則認為該基因為差異表達基因。多重檢驗為控制總Ⅰ類錯誤率( family-wise error rate,FWER)或FDR,可通過多種方法計算校正的P值; pFDR也有類似定義, Storey將其定義為q值。對於一個檢驗統計量T = t的q值定義為:
q - value ( t) = inf{Γα: t∈Γα}pFDR (Γα )
其中,Γα為拒絕域。由上式看出: q值為該假設剛好被拒絕所犯的最小第Ⅰ類錯誤。假定對m 個相同假設H1 , H2 , …, Hm 進行檢驗, T1 , T2 , T3 , …, Tm 為檢驗統計量,且Ti 是獨立同分布,拒絕域為Γ,那麼檢驗統計量T = t的q值可表示為:
q - value ( t) = inf{Γα: t∈Γα}pr(H = 0 | T∈Γα ) 。
而P值的定義為:
p - value ( t) = inf{Γα: t∈Γα}pr( T∈Γα |H = 0)
可見q值與P 值很相似。在獨立同分布的條件下, q值就是一個Bayesian版的P 值,稱為後驗Bayesian P值。SAM方法以q值< 0.05作為篩選差異表達基因的標准。 Hochberg法是控制FWER的Step-up方法。Step-up方法基於順序P值,將原始P值按照大小排序P(m )≥P(m 21)≥…≥P(1),從最大的(最不顯著的) P值向最小的(最顯著的) P 值尋找域值^k, 拒絕所有的P(1),P(2), …, P(^k)對應的原假設,使得多次檢驗所犯第Ⅰ類錯誤的概率小於檢驗水準α。假設如前,Hochberg法演算法如下:
第一步：計算m 次假設檢驗對應的P值。
第二步：按照原始P值大小排序得到: P(1)≤P(2)≤…≤P(m ), 相對應的檢驗原假設為H0 (1), H0 (2) , …,H0 (m) 。
第三步：令^k =max{ k:P( k) ≤α/ (m- k + 1) },從k=m 開始,然後k =m - 1, 直到第一個滿足P( k)≤α/(m - k + 1)的k,記為^k,拒絕所有的P(1), P(2), …, P(^k)對搏彎應的原假設。如果沒有滿足條件的k,則不能拒絕所有的原假設。
Hochberg法校正後P值為: .P( i) =mink = i, …, m{min( (m- k + 1) P( k), 1) }。 用FWER作為第Ⅰ類錯誤測度過於保守,為此Benjamini和Hochberg( 1995)提出了一種新的錯誤測度FDR。在檢驗統計量相互獨立且有連續分布,即原始P值相互獨立,且服從均勻分布U [0, 1 ]條件下,Benjamini和Hochberg(1995)提出襲銷了一種將FDR控制在水平m0α/m的方法(以下簡稱為BH法) ,從而也可將FDR控制在水平α。BH法如下:
第一步:計算m 個假設檢驗對應的P值。
第二步:按拍銀游照原始P值大小排序得到: P(1)≤P(2)≤…≤ P(m ), 對應的檢驗原假設為H0 (1) , H0 (2) , …,
H0 (m) 。
第三步:從P(m )開始,估計^k =max{ k:P( k) ≤kα/m}。
第四步:如存在^k,拒絕所有的P(1), P(2), …, P(^k)對應的原假設。如果沒有滿足條件的k,則不能拒絕所有的原假設。
BH方法校正的P值為.P( i) =mink = i, …, m{min(mP( k) /k,1) }。
Benjamini和Yekutieli( 2001)發現在檢驗統計量之間存在相依結構時,即檢驗統計量在相應於原假設的統計量集合上具有PRDS(positiveregression depend-encyon single variable) ,BH方法仍可控制FDR在水平m0α/m。該發現具有重要的實際應用價值,因為在實際問題中,統計量間往往存在相依結構。
Bonferroni校正法、Sidak 校正法、Hochberg法、BH法,均以校正的P值.Pi <0.05作為篩選差異表達基因的標准。

『玖』 如何利用SAM找差異性表達基因

今天就先來聊聊如何看差異表達基因數據，火山圖，聚類圖又怎麼看。1差異基因篩選方法那差異基因是如何篩選出來的呢？差異基因的篩選方法有很多，包括倍數法、T檢驗、F檢驗及SAM等。下面簡單介紹一下GCBI平台上用的倍數法和SAM法。倍數法適用於沒有生物學重復的樣本，其計算基因在兩個條件下表達水平的比值，確定比值的閾值，將絕對值大於此閾值的基因判斷為差異基因。SAM演算法適用於有生物學重復的樣本，通過對分母增加一個常量T檢驗過程減小了假陽性發生的概率。文獻中報道，相較於其他演算法，SAM演算法更為穩定，篩選出的結果也更為准確。2差異基因數據解讀經過合適的差異基因方法篩選出的差異基因，結果一般分為兩部分，數據+圖形。數據結果展示如下圖所示（兩分組）眾多參數中，重點看三個。p-value或q-value沒有做生物學重復請跳過這一步。p-value或q-value是統計學檢驗變數，代表差異顯著性，一般p-value或q-value小於0.05代表具有顯著性差異，但可根據具體情況適當調整。因為p-value或q-value衡量地是某個基因假陽性的概率，如果p-value或q-value越低，那麼挑選該基因出現假陽性的概率就越低，可驗證性就越高。兩者具體的計算方法具體如下：那p-value、q-value同時存在時看哪個呢？SAM法只有q-value。當兩者同時存在時，可根據具體情況具體分析。差異篩選是一個典型的多重假設檢驗過程，對於多重假設檢驗，單次檢驗中差異顯著基因的假陽性率(p-value較小)可能會較大，而q-value和FDR值較常見的BH校正方法得到的FDR值而言，改進了其對假陽性估計的保守性。即q-value相比於p-value更加嚴格，當差異基因結果較少時，可以退而求其次看p-value。FoldChangeFoldChange表示實驗組比上對照組的差異表達倍數，一般表達相差2倍以上是有意義的，放寬要求1.5倍或者1.2倍也可以接受。看錶達倍數的同時還需結合基因表達豐度，信號值太低的基因會在後續的驗證實驗中檢測不到。3差異基因圖表解讀在差異結果的圖形展示結果中，主要是火山圖和聚類圖。火山圖火山圖只針對兩分組且有生物學重復的情況。如何看火山圖呢？火山圖可反映總體基因的表達情況，橫坐標代表log2（FoldChange）,縱坐標表示-log10（P值），每個點代表一個基因，顏色用以區分基因是否差異表達，圖中橙色的點代表差異表達基因，藍色的點代表沒有差異表達的基因。聚類圖聚類圖可以衡量樣本或基因之間表達的相似性。如上圖所示的聚類圖中，橫坐標代表樣本聚類，一列代表一個樣本，聚類基於樣本間基因表達的相似性，樣本間基因表達越接近，靠的越近，以此類推。縱坐標代表基因聚類，一行代表一個基因，聚類基於基因在樣本中表達的相似性，基因在樣本中表達越接近，靠的越近，以此類推。色階代表基因表達豐度，越紅代表上調得越明顯，越綠代表下調得越明顯。如何做聚類圖請戳往期推送做個聚類圖只需1分鍾差異基因有了，如何挑選潛在基因進行實驗驗證呢？關鍵還在於感興趣點在哪了。粗略的看，可以先看KEGG或者GO功能分類，看差異基因具體富集在哪些通路或功能。比如關注的是細胞內脂肪酸合成關鍵酶，可以重點看脂肪酸合成和碳流相關通路。具體如何看KEGG或者GO功能分類，請聽下回分解。

『拾』 差異表達基因分析：差異倍數(fold change), 差異的顯著性(P-value)

Differential gene expression analysis：差異表達基因分析

Differentially expressed gene (DEG)：差異表達基因

差異表達分析是目前比較常用的識別疾病相關miRNA以及基因的方法，目前也有很多差異表達分析的方法，但比較簡單也比較常用的是Fold change方法。

它的優點是計算簡單直觀，缺點是沒有考慮到差異表達的統計顯著性；通常以2倍差異為閾值，判斷基因是否差異表達。Fold change的計算公式如下：

即用疾病樣本的表達均值除以正常樣本的表達均值。

差異表達分析的目的： 識別兩個條件下表達差異顯著的基因，即一個基因在兩個條件中的表達水平，在排除各種偏差後，其差異具有統計學意義。我們利用一種比較常見的T檢驗（T-test）方法來尋找差異表達的miRNA。T檢驗的主要原理為：對每一個miRNA計算一個T統計量來衡量疾病與正常情況下miRNA表達的差異，然後根據t分布計算顯著性p值來衡量這種差異的顯著性，T統計量計算公式如下：

差異倍數(fold change)

fold change翻譯過來就是倍數變化，假設A基因表達值為1，B表達值為3，那麼B的表達就是A的3倍。一般我們都用count、TPM或FPKM來衡量基因表達水平，所以基因表達值肯定是非負數，那麼fold change的取值就是(0, +∞).

為什麼我們經常看到差異基因里負數代表下調、正數代表上調？因為我們用了log2 fold change。

當expr(A) < expr(B)時，B對A的fold change就大於1，log2 fold change就大於0（見下圖），B相對A就是上調；

當expr(A) > expr(B)時，B對A的fold change就小於1，log2 fold change就小於0。

通常為了防止取log2時產生NA，我們會給表達值加1（或者一個極小的數），也就是log2(B+1) - log2(A+1). 【需要一點對數函數的基礎知識】

為什麼不直接用表達之差，差值接有正負啊？

假設A表達為1，B表達為8，C表達為64；直接用差值，B相對A就上調了7，C就相對B上調了56；用log2 fold change，B相對A就上調了3，C相對B也只上調了3. 

通過測序觀察我們發現，不同基因在細胞里的表達差異非常巨大，所以直接用差顯然不合適， 用log2 fold change更能表示相對的變化趨勢。

雖然大家都在用log2 fold change，但顯然也是有缺點的：

一、到底是5到10的變化大，還是100到120的變化大？

二、5到10可能是由於技術誤差導致的。所以當基因總的表達值很低時，log2 fold change的可信度就低了，尤其是在接近0的時候。

A disadvantage and serious risk of using fold change in this setting is that it is biased[7] and may misclassify differentially expressed genes with large differences (B − A) but small ratios (B/A), leading to poor identification of changes at high expression levels. Furthermore, when the denominator is close to zero, the ratio is not stable, and the fold change value can be disproportionately affected by measurement noise.

差異的顯著性(P-value) 

這就是統計學的范疇了，顯著性就是根據假設檢驗算出來的。

假設檢驗首先必須要有假設，我們假設A和B的表達沒有差異（H0，零假設），然後基於此假設，通過t test（以RT-PCR為例）算出我們觀測到的A和B出現的概率，就得到了P-value， 如果P-value<0.05，那麼說明小概率事件出現了，我們應該拒絕零假設，即A和B的表達不一樣，即有顯著差異。

顯著性只能說明我們的數據之間具有統計學上的顯著性，要看上調下調必須回去看差異倍數。

對於得到的顯著性p值，我們需要進行多重檢驗校正（FDR），比較常用的是BH方法（Benjamini and Hochberg, 1995）。

這里只說了最基本的原理，真正的DESeq2等工具裡面的演算法肯定要復雜得多。

這張圖對q-value（校正了的p-value）取了負log，相當於越顯著，負log就越大，所以在火山圖里，越外層的岩漿就越顯著，差異也就越大。

只需要看懂DEG結果的可以就此止步，想深入了解的可以繼續。

下面可以繼續討論的問題有：

1、RNA-seq基本分析流程/2、

2、DEG分析的常用演算法/3、

3、常見DEG工具的方法介紹和相互比較

前言

做生物生理生化生信數據分析時，最常聽到的肯定是「差異(表達)基因分析」了，從最開始的RT-PCR，到基因晶元microarray，再到RNA-seq，最後到現在的single cell RNA-seq，統統都在圍繞著差異表達基因做文章。

（開個腦洞：再下一步應該會測細胞內特定空間內特定基因的動態表達水平了）

表達量 ：我們假設基因轉錄表達形成的mRNA的數量反映了基因的活性，也會影響下游蛋白和代謝物的變化。我們關注的是 基因的表達 ，不是結構，也是不是isoform。

為什麼差異基因分析這么流行？

一是中心法則得到了確立，基因表達是核心的一個環節，決定了下游的蛋白組和代謝組；

二是建庫測序的普及，獲取基因的表達水平變得容易。

在生物體內，基因的表達時刻都在動態變化，不一定服從均勻分布，在不同時間、發育程度、組織和環境刺激下，基因的表達肯定會發生變化。

差異基因分析主要應用在：

發育過程中關鍵基因的表達變化 - 發育研究

突變材料里什麼核心基因的表達發生了變化 - 調控研究

細胞在受到葯物處理後哪些基因的表達發生了變化 - 葯物研發

目前我們對基因和轉錄組的了解到什麼程度了？

基本的建庫方法？建庫直接決定了我們能測到什麼序列，也決定了我們能做什麼分析！

基因表達的normalization方法有哪些？

第一類錯誤、第二類錯誤是什麼？

多重檢驗的校正？FDR？

10x流程解釋

The mean UMI counts per cell of this gene in cluster i

The log2 fold-change of this gene's expression in cluster i relative to other clusters 

The p-value denoting significance of this gene's expression in cluster i relative to other clusters, adjusted to account for the number of hypotheses (i.e. genes) being tested.

The differential expression analysis seeks to find, for each cluster, genes that are more highly expressed in that cluster relative to the rest of the sample. Here a differential expression test was performed between each cluster and the rest of the sample for each gene.

The Log2 fold-change (L2FC) is an estimate of the log2 ratio of expression in a cluster to that in all other cells. A value of 1.0 indicates 2-fold greater expression in the cluster of interest.

The p-value is a measure of the statistical significance of the expression difference and is based on a negative binomial test. The p-value reported here has been adjusted for multiple testing via the Benjamini-Hochberg procere.

In this table you can click on a column to sort by that value. Also, in this table genes were filtered by (Mean UMI counts > 1.0) and the top N genes by L2FC for each cluster were retained. Genes with L2FC < 0 or adjusted p-value >= 0.10 were grayed out. The number of top genes shown per cluster, N, is set to limit the number of table entries shown to 10000; N=10000/K^2 where K is the number of clusters. N can range from 1 to 50. For the full table, please refer to the "differential_expression.csv" files proced by the pipeline.

不同單細胞DEG鑒定工具的比較

Comparative analysis of differential gene expression analysis tools for single-cell RNA sequencing data

For data with a high level of multimodality, methods that consider the behavior of each indivial gene, such as DESeq2, EMDomics, Monocle2, DEsingle, and SigEMD, show better TPRs. 這些工具敏感性高，就是說不會漏掉很多真的DEG，但是會包含很多假的DEG。

If the level of multimodality is low, however, SCDE, MAST, and edgeR can provide higher precision. 這些工具精準性很高，意味著得到的DEG里假的很少，所以會漏掉很多真的DEG，不會引入假的DEG。

time-course DEG analysis

Comparative analysis of differential gene expression tools for RNA sequencing time course data 

參考：

Question: How to calculate "fold changes" in gene expression?

Exact Negative Binomial Test with edgeR

Differential gene expression analysis