什麼樣的方法叫分子生物學方法

① 試述細菌種屬鑒定的常用分子生物學方法。

(1)DNA鹼基組成的測定：細菌間DNA分子同源程度可以用細菌DNA分子的G+C或A+T摩爾百分比來反映。親源關系越近的細菌，G+Cmol%越相近。G+Cmol%含量不同的細菌，為不同種細菌；含量相同的可能為不同種的細菌。不同菌屬問G+Cmol%范圍在25%～75%之間。細菌的G+Cmol%相當穩定，不受培養條件、菌齡和其他外界因素影響。最常用的方法是熱變性法，其次是高效液相色譜法和浮力密度法。
(2)DNA-DNA雜交：DNA雜交可得出DNA之間核苷酸順序的互補程度，從而推斷不同細菌基因組間的同源性。目前最常用的是復性速率法，同一菌的復性率為100%；80%～90%的同源為同一種內同一亞種的細菌；60%～70%同源性為同一種內不同亞種的細菌；20%～60%同源則是同一屬中的不同菌種。這種方法還可對新菌種或表型性狀差別很小而難以肯定的菌株做出較可靠的判定，並可修正其他方法的分類和鑒定錯誤。
(3)165rRNA同源性分析：①rRNA-DNA雜交。變性rRNA與變性DNA混合時，rRNA與其互補的DNA鏈形成雜交雙鏈，rRNA分子與異源DNA雜交時，也能在其同源區形成互補雙鏈，這種雜交雙鏈的穩定性與其同源性成正相關，適於細菌屬及屬上水平的分類研究。現最常用的是硝酸纖維膜結合法。②165rRNA序列測定。rRNA分子具有高度保守性，在所有的細胞生物中都存在，在長期的進化中，16SrRNA的總鹼基數有所不同，保守的部分使不同序列很容易相互對齊進行比較。
(4)165-235rRNA序列測定：在165和235rRNA的間隔區，各菌種的長度是不一樣的，利用包含165和235rRNA部分序列的引物對間隔區進行擴增，分析其長度多態，或結合RFLP技術進行分析來鑒定菌種。
此外限制性內切酶長度多態性分析(RFLP)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)、隨機引物擴增法(RAPD)等技術常用於菌株間的差異比較。

② 分子生物學技術的分類

目前，常用的分子生物學技術有如下幾種 ： PCR- 單鏈構象多態性分析(PCR- single strand conformation analysis,PCR- SSCP) 是近年來在基因突變檢測中運用最廣泛的方法之一。PCR- SSCP 技術憑借突變可引起單鏈DNA三級構象改變,通過觀察單鏈DNA在非變性聚丙烯醯胺凝膠中的遷移率漂移來判斷突變。樣品經PCR 擴增後，其產物經變性後可以產生2 條單鏈，如果存在基因突變，哪怕是一個鹼基的異常，單鏈的構象也會發生變化，正常與突變的DNA單鏈在聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE) 中螞返並，可以顯現出不同的帶型，從而確定野生型和突變型，PCR- SSCP 分析的主要優點是簡易且敏感性較高。但是該技術不能確定突變的部位和性質。PCR- SSCP 突變檢測敏感性隨PCR 產物長度的增加而降低，一般用於檢測較小外顯子的突變。有時由於單個核苷酸變化所引起的構象改變很小，用PAGE 電泳就可能無法檢出，在PCR 產物或待測DNA 小於200 bp 時，PCR- SSCP 分析能夠檢測出70%~ 95%的突變。如果以毛細管電泳代替PAGE，則可大為提高突變檢測的效率。
Wallace1997 年提出將PCR- SSCP 和異源DNA雙鏈分析（heteroplex analysis,HA) 相結合，稱之為SSCP/ HA，部分PCR 產物經變性進行SSCP 分析以了解是否具有突變，其餘PCR 產物直接用於電泳，以檢出含有突變的異源DNA雙鏈，電泳凝膠經銀染，單鏈DNA所形成的帶為橘黃或棕色，而雙鏈DNA則表現為灰黑色。該綜合手段可以單悶跡鏈構型多態性和異源雙鏈構型分析兩個不同的層次檢出突變，是一種經濟、迅速的突變檢測手段，但無法提供突變位置的信息。
PCR- SSCP 有許多改進技術，如RNA單鏈構象多態性法（PCR- rSSCP）、雙脫氧測序單鏈片段構象多態分析（PCR- ddF）、限制酶指紋技術(PCR- REF) 等。PCR- rSSCP 法依據RNA構象對單個鹼基替代更敏感的原理，在PCR 引物上加上某類啟動子，通過轉錄的RNA構象體的電泳遷移差異進行突變鑒別。PCR- ddF 法把PCR 產物轉錄，將轉錄物用反轉錄酶進行Sanger 雙脫氧終止測世備序反應，通過觀察非變性膠上經解鏈處理所產生的單鏈漂移、突變後終止片段的獲得與缺失來判斷突變。PCR- REF 法將RFLP 和SSCP 技術優勢組合，將PCR 擴增的待測片段用5~ 6 種限制酶依次消化，混合並進行末端標記，最後經變性處理並在非變性凝膠上電泳分離，從而獲得來自片段長度和片段構象的雙重突變信息。 變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 利用由鹼基序列所決定的DNA片段溶解度或變性度的差異，達到分離野生型與突變型DNA片段的目的，該手段解析度達一個鹼基。當DNA 雙鏈沿變性劑濃度梯度增加的聚丙烯醯胺凝膠遷移時，DNA分子中解鏈溫度（Tm) 低的部分逐漸變性解鏈。一般總是錯配鹼基部分的異源雙鏈Tm最低，最容易解鏈，其次是富含AT 鹼基對的部位，富含GC鹼基對的部位Tm值較高所以解鏈較難。因此，正常DNA雙鏈和異源雙鏈在梯度變性膠中電泳時，異源雙鏈總是先解鏈。將PCR 產生的雙鏈DNA在濃度遞增的尿素和甲醯胺變性聚丙烯醯胺凝膠上電泳，當某一DNA片段遷移到變性劑濃度與其最低Tm相當的位置時，該片段低溫解鏈部分的雙鏈打開，部分解鏈導致DNA遷移速度明顯下降，觀察樣品的遷移率變化即可判斷是否存在變異。DGGE 敏感性高，即便異源雙鏈中僅含一個錯配鹼基，在電泳時也可分辨其遷移率的改變。DGGE 方法的單鹼基突變檢出率在DNA片段長度600 bp 以內可以達到95%。
DGGE 的成功有賴於雙鏈DNA內部低溫解鏈部分變性後遷移率的改變。但在相當於最高Tm的變性劑濃度的位置，相應的DNA片段可能全部解鏈，使試驗無法檢出存在於高Tm DNA片段中的鹼基替換。為了解決此問題，可以在一個PCR 引物的5 ' 端設計一段富含GC的尾巴，從而使PCR 擴增產物的一端富含GC 鹼基對，保證了絕大多數DNA片段不會發生完全解鏈，在最高變性劑濃度區域仍然可以分辨出部分解鏈的異源雙鏈，這一改進使DGGE 的突變檢出率接近100%，但DGGE 只能檢測突變是否存在而不能確定突變的位置。
DGGE 方法需要設計特定片段最佳的PCR引物以及最佳變性條件，這一過程比較復雜，梯度變性膠的制備需要的設備較昂貴，所以在常規實驗室不易實施。 等位基因特異性擴增法（allele- specific amplificarion,ASA) 是基於PCR技術的一種單核苷酸突變檢測法，是分析已知鹼基替代或微小片段缺失和插入型突變的常規技術。在PCR 的引物設計中，根據已知突變位點性質在引物3 ' 端或中間設計一錯配鹼基，使之僅能與突變型或野生型基因互補而只擴增突變型或野生型基因。
ASA技術只需一步PCR反應，甚至無需電泳和標記技術。因其快速，重復性強，耗資少，無同位素污染以及高效性等特點，將成為有前途的適應於人群大規模突變篩查的方法。應用該方法最好避免錯配鹼基為G: T，這種錯配可能引發擴增反應。 化學裂解錯配鹼基法（chemical cleavage mismatch,CCM) 通過化學修飾並切割異源DNA雙鏈中錯配鹼基，達到檢測點突變的目的。其原理是末端標記的DNA片段暴露於可以識別並修飾異源雙鏈中錯配鹼基的化學試劑中（如錯配的胞嘧啶可被羥胺修飾，錯配的胸腺嘧啶可被四氧化鋨修飾），被修飾的位點隨即可被雜氮環已烷等化學物質裂解。DNA修飾裂解後，電泳觀察DNA片段長度即可知道突變是否存在。該技術較其他突變檢測系統有更多的優越性，可以掃描1~ 2 kb 的大片段DNA並在隨後的順序分析中定位突變位點，其效率可達100%。該手段通常首先對目標DNA和野生型DNA進行PCR 擴增，然後對野生型DNA擴增片段進行末端標記，標記片段作為探針與目標序列復性形成異源雙鏈，用四氧化鋨（OsO4） 或羥胺（hydroxylamine) 修飾並用哌啶（piperidine) 切割，聚丙烯醯胺電泳分離不同長度的片段。近年來，有人採用碳化二亞胺作為錯配修飾劑，進一步提高了該方法的敏感性。CCM方法最初採用同位素DNA片段，用熒游標記代替同位素後，稱之為熒光化學裂解錯配鹼基法（FCCM），該方法依然比較敏感並且安全，可檢出95%~ 100%的錯配。化學裂解錯配鹼基法的不足之處在於工作量大，需要使用有害化學物質作為試驗用試劑。

③ 分子生物學實驗方法

實驗1總DNA提取

生物總DNA的提取是分子生物學實驗的一個重要內容。由於不同的生物材料細胞壁的結構和組成不同，而細胞壁結構的破壞是提取總DNA的關鍵步驟。同時細胞內的物質也根據生物種類的不同而有差異，因此不同生物採用的提取方法也不同，一般要根據具體的情況來設計實驗方法。本實驗介紹採用CTAB法提取植物總DNA的技術。

[實驗目的]

學習和掌握學習CTAB法提取植物總DNA的基本原理和實驗技術。學習和掌握紫外光吸收法鑒定DNA的純度和濃度。

[實驗原理]

植物葉片經液氮研磨，可使細胞壁破裂，加入去污劑（如CTAB），可使核蛋白體解析，然後使蛋白和多糖雜質沉澱，DNA進入水相，再用酚、氯仿抽提純化。本實驗採用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB是一種非離子去污劑，能溶解膜蛋白與脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的處理下，結合65℃水浴使細胞裂解、蛋白質變性、DNA被釋放出來。CTAB與核酸形成復合物，此復合物在高鹽（>0.7mM）濃度下可溶，並穩定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸復合物就因溶解度降低而沉澱，而大部分的蛋白質及多糖等仍溶解於溶液中。經過氯仿/異戊醇(24:1)抽提去除蛋白質、多糖、色素等來純化DNA，最後經異丙醇或乙醇等沉澱劑將DNA沉澱分離出來。

由於核酸、蛋白質、多糖在特定的紫外波長都有特徵吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。純的DNA樣品A260/280≈1.8，純的RNA樣品A260/280≈2.0，並且1μg/mlDNA溶液A260=0.020。

[實驗器材]

1、高壓滅菌鍋2、冰箱3、恆溫水浴鍋4、高速冷凍離心機5、紫外分光光度計6、剪刀7、陶瓷研缽和杵子8、磨口錐形瓶（50ml）9、滴管10、細玻棒11、小燒杯（50ml）12、離心管（50ml）13、植物材料

[實驗試劑]

1、3×CTABbuffer（pH8.0）

100mMTris

25mMEDTA

1.5MNaCl

3%CTAB

2%β-巰基乙醇

2、TE緩沖液（pH8.0）

10mmol/LTris·HCl

1mmol/LEDTA

3、氯仿-異戊醇混合液（24：1，V/V）

4、95％乙醇

5、液氮

[實驗步驟]

1、稱取2g新鮮的植物葉片，用蒸餾水沖洗葉面，濾紙吸干水分。

2、將葉片剪成1cm長，置預冷的研缽中，倒入液氮，盡快研磨成粉末。

3、待液氮蒸發完後，加入15mL預熱（60℃）的CTAB提取緩沖液，轉入一磨口錐形瓶中，

置於65℃水浴保溫0.5h，不時地輕輕搖動混勻。

4、加等體積的氯仿/異戊醇，蓋上瓶塞，溫和搖動，使成乳狀液。

5、將錐形瓶中的液體倒入50ml離心管中，在4℃下8000rpm離心10min。

6、離心管中出現3層，用滴管小心地將上層清液吸入另一干凈的離心管中，棄去中間層的細胞碎片和變性蛋白以及下層的氯仿。（根據需要，上清液可用氯仿/異戊醇反復提取多次。）

7、收集上層清液，並將其倒入小燒杯。沿燒杯壁慢慢加入2倍體積預冷的95％乙醇。邊加邊用細玻棒沿同一方向攪動，可看到纖維狀的沉澱（主要為DNA）迅速纏繞在玻棒上。

8、小心取下這些纖維狀沉澱，加1～2mL70%乙醇沖洗沉澱，輕搖幾分鍾，除去乙醇，即為DNA粗製品。

9、將粗製品溶於TE緩沖液。

10、在分光光度計上測定該溶液在260nm/280nm紫外光波長下的光密度值。

[注意事項]

1、液氮研磨時，小心操作，以免凍傷。

2、所有操作均需溫和，避免劇烈震盪。

[思考題]

CTAB、EDTA、巰基乙醇的作用分別是什麼？

液氮研磨的原理是什麼？

實驗二質粒DNA的提取

質粒DNA是分子生物學實驗中廣泛應用的載體分子。質粒是細菌獨立於染色體外的遺傳物質，是環狀的`雙鏈DNA分子。由於質粒比較小，並且能進行獨立的自我復制，常常被改造為克隆和表達的載體分子。

[實驗目的]

通過本實驗掌握鹼裂解法提取質粒的基本原理，掌握鹼裂解小量提取質粒的實驗技術。

[實驗原理]

鹼裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們。在pH值介於12.0~12.5這個狹窄的范圍內，線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉合環狀質粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結合在一起。當加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復pH至中性時，共價閉合環狀的質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而准確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那麼迅速

而准確，它們纏繞形成網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA，蛋白質-SDS復合物等一起沉澱下來而被除去。

[實驗器材]

1、恆溫培養箱

2、恆溫搖床

3、台式離心機

4、高壓滅菌鍋

5、Tip頭、Eppendorg管

6、含有目的質粒的E.coli菌株

[實驗試劑]

1、溶液I

50mmol/L葡萄糖

5mmol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl

10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

2、溶液II

0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等體積混合

3、溶液III

5mol/L乙酸鉀60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL

4、TE緩沖液

10mmol/LTris·HCl

1mmol/LEDTA(pH8.0)

5、70%乙醇（放-20℃冰箱中，用後即放回）

6、EcoRI及其緩沖液

7、HindIII及其緩沖液

[實驗步驟]

1、將含有目的質粒的E.coli菌株接種於LB液體培養基中，37℃振盪培養過夜。

2、取1ml培養物倒入Eppendorf管中，12000r/min離心30sec。

3、吸去培養液，使細胞沉澱盡可能乾燥。

4、將細菌沉澱懸浮於100μL冰預冷的溶液I中，劇烈振盪。

5、加200μL溶液II（新鮮配製），蓋緊管皿，快速顛倒5次，混勻內容物，將Eppendorf管放在冰上。

6、加入150μL溶液III（冰上預冷），蓋緊管口，顛倒數次使混勻，冰上放置5min。7、12000r/min，離心5min，將上清液轉至另一Eppendorf管中。

8、向上清液加入等體積的飽和酚，混勻。

9、12000r/min，離心5min，將上清液轉至另一Eppendorf管中。

10、向上清液加入2倍體積乙醇，混勻後，室溫放置5~10min。12000r/min離心5min。倒去上清液，把Eppendorf管倒扣在吸水紙上，吸干液體。

11、1ml70%乙醇洗滌質粒DNA沉澱，振盪並離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中乾燥。12、20μLTE緩沖液，使DNA完全溶解，-20℃保存。

[注意事項]

操作時，避免劇烈震盪。

[思考題]

1、實驗操作中，飽和酚的作用是什麼？

2、SDS和NaOH的作用是什麼？

[參考文獻]

《精編分子生物學實驗指南》（第四版）

[美]FM奧斯伯，RE金斯頓等主編科學出版社2005

實驗三總RNA提取

【目的和要求】

1．掌握樣品中總RNA的提取的原理和方法。

2．熟悉RNA純度及濃度檢測方法。

3．了解RNA提取過程中的注意事項。

【實驗原理】

RNA是基因表達的中間產物，存在於細胞質與核中。對RNA進行操作在分子生物學中佔有重要地位。獲得高純度和完整的RNA是很多分子生物學實驗所必需的，如Northern雜交、cDNA合成及體外翻譯等實驗的成敗，在很大程度上取決於RNA的質量。由於細胞內的大部分RNA是以核蛋白復合體的形式存在，所以在提取RNA時要利用高濃度的蛋白質變性劑，迅速破壞細胞結構，使核蛋白與RNA分離，釋放出RNA。再通過酚、氯仿等有機溶劑處理、離心，使RNA與其他細胞組分分離，得到純化的總RNA。在提取的過程中要抑制內源和外源的RNase活性，保護RNA分子不被降解。因此提取必須在無RNase的環境中進行。可使用RNase抑制劑，如DEPC是RNase的強抑制劑，常用來抑制外源RNase活性。提取緩沖液中一般含SDS、酚、氯仿、胍鹽等蛋白質變性劑，也能抑制RNase活性，並有助於除去非核酸成分。

【教學內容】

1．總RNA提取的基本原理和常用方法介紹

2．進行動物組織或血液樣品總RNA提取。

3．對提取的RNA的進行純度和濃度檢測。

【實驗器材和試劑】

超凈工作台、高速冷凍離心機、電泳儀、紫外分光光度計、凝膠成像系統、振盪器、移液器、吸頭、Ep管、玻璃勻漿器、試管。

玻璃器皿洗凈後置180℃烘烤8h；不耐高溫的器皿（如塑料製品）應用0.1%DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤乾燥，120℃高壓20min，再70～80℃烘烤乾燥方可使用。

細胞裂解液：異硫氰酸胍4mol/L；檸檬酸鈉（pH7.0）25mmol/L；十二烷基肌氨酸鈉0.5%；β-巰基乙醇0.1mol/L（稱取檸檬酸鈉0.64g，十二烷基肌氨酸鈉0.415g，吸取β-巰基乙醇0.7ml，用無Rnase的蒸餾水溶解，定容至50ml。然後取以上配製的溶液(CBS液)33ml，異硫氰酸胍25g,混合，完全溶解後4℃保存備用）

TRIzolRNA抽提試劑、2mol醋酸鈉、0.1%DEPC、平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）、氯仿、無水乙醇、異丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配製）、RNase-free的水。

【實驗方法】

（一）異硫氰酸胍法（PLT）

1．取新鮮動物組織0.1～0.2g置於組織勻漿器中，加入預冷的細胞裂解液1ml,在冰浴

中迅速勻漿15～30s，以充分研碎組織。然後將細胞懸浮液吸入另一試管中。

2．加入2mol醋酸鈉（pH4.0）120μl，充分混勻。

3．加入1.2ml酚：氯仿：異戊醇，充分混勻搖振10s，冰浴15min。

4．將混合物轉移至1.5mlEp管中，4℃，離心10000r/min,20min.

5．移取上層水相至另一Ep管中，加入等體積的異丙醇，靜置-20℃，30min沉澱RNA.

6．4℃，離心12000r/min，15min.

7．棄上清液，加入70%乙醇400μl,洗滌RNA沉澱物；如果RNA沉澱物被懸浮，則4℃離心10000r/min，10min。

8．棄上清液，自然乾燥，但應避免沉澱完全乾燥，否則RNA難以溶解。

9．加入100μl無RNase水重懸RNA，或加1ml無水乙醇和1/10體積3mol醋酸鈉（pH4.0），-70℃保存。

（二）TrizolReagent/總RNA提取試劑

TRIzol是從細胞和組織中提取總RNA的即用型試劑，在樣品裂解或勻漿過程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿後，溶液分為水相和有機相，RNA在水相中。取出水相，用異丙醇可沉澱回收RNA。下面介紹由上海美季生物技術有限公司總RNA提取試劑推薦的操作步驟：

1.勻漿處理（Homogenization）

（1）組織中提取總RNA

①植物組織：植物葉片直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物葉片加入1mlTRIzol。

②動物組織：按10-30mg組織加入1mlTRIzol，用電動勻漿器或者一次性研磨杵充分勻漿。

（2）培養細胞中提取總RNA

①貼壁細胞：無須胰酶消化，可直接用TRIzol進行裂解，每10平方厘米培養面積加1mlTRIzol。

②懸浮細胞：可直接離心收集、裂解，每1mlTRIzol可裂解5×106動物或酵母細胞，或107細菌細胞。

（3）血液中提取總RNA

直接取新鮮的血液，加入3倍體積紅細胞裂解液，混勻後室溫放置10分鍾，10,000rpm離心1分鍾。徹底吸棄上清，收集白細胞沉澱。每100-200μl血液收集的白細胞沉澱加入1mlTRIzol。

2．分層（PhaseSeparation）

（1）樣品加入TRIzol後，室溫放置5min，使樣品充分裂解。

註：如不進行下一步操作，樣品可放入-70℃長期保存。

④ 分子生物學是指什麼

分子生物學是指在分子水平上研究生命現象的科學，從生物大分子(核酸、蛋白質)的結構、功能和生物合成等方面來闡明各種生命現象的本質。研究內容包括各種生命過程，如光合作用、發育的分子機制、神經活動的機理、癌的發生等。

生物大分子，特別是蛋白質和核酸結構功能的研究，是分子生物學的基礎。現代化學和物理學理論、技術和方法的應用推動了生物大分子結構功能的研究，分子生物學和生物化學及生物物理學關系十分密切，它們之間的主要區別在於：

（1）生物化學和生物物理學是用化學的和物理學的方法研究在分子水平，細胞水平，整體水平乃至群體水平等不同層次上的生物學問題。而分子生物學則著重在分子（包括多分子體系）水平上研究生命活動的普遍姿跡規律；

（2）在分子水平上，分子生物學著重研究的是大分子，主要是蛋白質，核酸，脂質體系以及部分多糖及其復合體系。而一些小基冊游分子物質在生物體內的轉化則屬生物化學的范圍；

（3）分子生物學研究的主要目的是在分子水平上闡明整個生物界所共同具有的基本特徵，即生命現象的本質；而研究某一特定生物體或某一種生物體搏銷內的某一特定器官的物理、化學現象或變化，則屬於生物物理學或生物化學的范疇。

⑤ 什麼是「分子生物學」什麼是「基因工程」

什麼是分子生物學？

生物學的研究可以說長期以來都是科研的重點，惟其所涉及的方方面面與人類生活緊密相連。本世紀5O年代以前的生物學研究，雖然有些已進人了微觀領域，但總的來說，主要是研究生物個體組織、器官、細胞或是亞細胞器這些東西之間的相互關系。50年代中期，隨著沃森和克里克揭示出DNA分子的空間結構，生物學才真正開始了其揭開分子水平生命秘密的研究歷程。到70年代，重組DNA技術的發展搭伍又給人們提供了研究DNA的強有力的手段，於是分子生物學就逐漸形成了。顧名思義，分子生物學就是研究生物大分子之間相互關系和作用的一門學科，而生物大分子主要是指基因和蛋白質兩大類；分子生物學以遺傳學、生物化學、細胞生物學等學科為基礎。從分子水平上對生物體的多種生命現象進行研究；分子生物學在理論和實踐中的發展也為基因工程的出現和發展打下了良好的基礎，因此可以說基因工程就是分子生物學的工程應用。現在基因工程所展現出的強大生命力和巨大的經濟發展潛力完全得益於分子生物學的迅猛發展，而且有證據表明，基因工程的進一步發展仍然要依賴於分子生物學研究的發展。
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什麼是基因工程？

隨著 DNA的內部結構和遺傳機制的秘密一點一點呈現在人們眼前，特別是當人們了解到遺傳密碼是由 RNA轉錄表達的以後，生物學家不再僅僅滿足於探索、提示生物遺傳的秘密，爛咐而是開始躍躍欲試，設想在分子的水平上去干預生物的遺傳特性。

如果將一種生物的 DNA中的某個遺傳密碼片斷連接到另外一種生物的DNA鏈上去，將DNA重新組織一下，就可以按照人類的願望，設計出新的遺傳物質並創造出新的生物類型，這與過去培育生物繁殖後代的傳統做法完全不同。

這種做法就像技術科學的工程設計，按照人類的需要把這種生物的這個「基因」與那種生物的那個「基因」重新「施工」，「組裝」成新的基因組合，創造出新的生物。這種完全按照人的意願，由重新組裝基因到新生物產生的生物科學技術，就稱為「基因工程」，或者說是「遺傳工程」。

基因工程是生物工程的一個重要分支，它和細胞工程、酶工程、蛋白質工程飢枝純和微生物工程共同組成了生物工程。

⑥ 請問下微生物測定方法平板計數法與分子生物學方法的區別

平板計數是一種可茄蠢培養活細菌計數的方法，基礎有兩個，1是平板可培養出目的菌株，2是適當的稀釋，可以分出清晰的菌落個數。如果培養的的是混合菌，那就要通過平板上不同的菌落特徵去辨別了。 分子方法主要是通過real-time pcr（q-pcr）即實時定量pcr來實現，及根據目的菌的某個基因設計特異性引物尺納芹，以樣本為模板進行pcr，根據產物達到一定量時所用的循陵畢環數多少推算出模板量（細菌數），它可以用標准曲線的方法較為准確的估計出菌數，並且，可以通過特異性引物來界定定量菌的種屬。一般現在用taq-man探針法進行q-pcr可以取得較為准確的結果。 參考網址on http://doc.bio1000.com/show-3438.html

⑦ 什麼是「分子生物學」什麼是「基因工程」

分子醫學是新興學科,它在分子水平上拿雀薯研究人類疾病的發生、發展、診斷和治療，從本質上掌握疾病的消者規律極其根本性的防治策略。標準的分子生物學技術在遺傳學診斷和新的治療方法中也起著越來越大的作用。
基因工程是人類歲培根據一定的目的和設計,對DNA分子進行體外加工操作,再引入受體生物,以改變後者的某些遺傳性狀,從而培育生物新類型或治療遺傳疾病的一種現代的、嶄新的、分子水平的生物工程技術。

⑧ 神經環路研究的分子生物學方法

從毫秒級的分子反應到以年為單位的群體心理學研究，腦相關科學在時間和空間兩個坐標上都有很大的跨度。

神經環路（circuit）是指大腦中由神經元相互連接形成的、傳遞某種特定信息的通路。最簡單的神經環路就是大家熟悉的膝跳反射環路：錘擊膝蓋下方後，感覺信息從肌梭中產生，經過感覺神經元進入脊髓；接著運動信息由motor neuron傳出脊髓一直到肌肉，控制股四頭肌收縮和二頭肌舒張。中樞神經系統的神經環路往往比膝跳反射復雜得多，不僅涉及多個腦區，更具有復雜的連接結構。

不論一個反射有多麼復雜，它都由三部分組成：輸入（感覺信息），中間處理和輸出（行為）。簡單如膝跳反射環路，其輸入是對膝蓋附近的敲擊，而輸出是肌肉的收縮引起的踢腿行為；復雜如果蠅的求偶行為，其輸入是特定的環境、時間、雌果蠅的存在等，而輸出是跟隨、唱歌、聞嗅等一系列追求雌果蠅的行為。輸入和輸出往往是容易控制和觀察的，而神經系統就像一個黑匣子，我們只知道其輸入和輸出，卻對其工作的機制一無所知。

為了探明神經環路的真相，生物學積累了大量的方法，用以解決下列問題：某神經環路由哪些成分組成？每個組分的功能是什麼？這些功能是如何實現的？

要分析神經環路的組分以及它們的功能，也就是從大腦中所有一千億個神經元中，區分出與某特定功能有關的那些。這就需要我們把神經元的某些特徵與神經系統的某些功能對應起來。神經元有什麼特徵？形態並不足以區分不同的環路（盡管有時外貌特徵是有用的，比如中腦黑質的多巴胺能神經元顏色較深）。一般而言，最具有解析度的特徵有兩種：①基因表達的時空特徵，畢竟這是個體中任何細胞之間產生區別的根本原因；②動作電位發放和突觸傳遞的時空特徵，這是神經系統發揮功能的基礎。對於基因表達的特性，我們可以使用分子生物學/遺傳學的手段探測；而對於動作電位的發放，我們有電生理的方法探測。

接下來，有了特徵，我們用什麼方法將它們和神經系統的仔脊薯特定功能對應起來呢？為了更形象地解釋，我們用果蠅的求偶行為作為例子。一種思路是，①在果蠅求偶的過程中觀察其大腦，看看哪些神經元依次進行了活動，從而可以簡單地認為這些神經元與求偶相關。這種思路的問題是，如何在活的果蠅中，以高時空解析度，記錄下大腦中每個神經元的活動——這顯然是不現實的，但我們可以用各種技巧去接近這個目標，稍後敘述。另一種思路是，②抑制或者增強某些神經元的功能，然後觀察果蠅的求偶行為受到了什麼樣的影響——是增強了（像發情期的泰迪一樣對空氣交配）還是減弱了（對性感的雌果蠅不屑一顧）。這種方法不需要進行實時記錄，只需要輕松地觀察行為即可；它的問題在於，如何抑制或者增強特定的一部分神經元的功能。

讓我們從第二種思路說起。當我們拔掉網卡，電腦就不能上網了，於是我們認為網卡的功能是連接網路。同樣野森地，對大腦也可以用同樣的方法研究。二十世紀中葉一位代號H.M.的病人被手術切除了海馬，從此很難再形成新的（陳述性）記憶，這極大幫助了科學界對記憶相關環路的理解。然而手術的解析度是有限的，而且只能切除空間上相近的一部分腦組織。現代生物學既可以利用分子生物學/遺傳學方法來永久改變神經元活動（從出生到死亡），也可以利用化學控制、溫度控制和光控制來實時操作神經元（數秒至數小時）。

永久地改變神經元活動的方法主要是遺傳操作，即減少某些內源性基因的表達和增強某些內源性（或者增加某些外源性）基因的表達。抑制基因表達既可以通過正向遺傳學篩選，也可以用反向遺傳學的方法，比如同源重組介導的knock out，以及RNAi介導的knock down。增加外源性基因可以通過轉基因或者knock in的方法，而過表達內源性基因可以在目標基因上游增加增強子/啟動子調控元件。

對神經元的操作有時候需要在特定的時空區段內進行。雙表達系統，如Cre/LoxP、Gal4/UAS等提供了模塊化的、組織念者特異性的遺傳操作手段，從而提高了操作的空間解析度。病毒注射、光遺傳學、化學遺傳學等方法提供了暫時改變特定區域基因表達特性的的手段，從而提高了操作的時間解析度。

接下來再說第一種思路。如何在活體中觀察神經元的活動？活動的神經元與不活動的神經元區別在哪？活躍的神經元中有密集的動作電位，大量離子通道的開放和跨膜離子流。電生理技術記錄前者，而鈣成像技術（GECI，genetically encoded calcium indicators）（最常用GCaMP）記錄後者。GEVI記錄膜電位的變化，相較GECI有更高的時間解析度，但熒光強度不足。上述成像技術的另一個問題是，活體厚厚的腦組織對顯微鏡是巨大的挑戰。目前最先進的雙光子技術也只能穿透500mm左右的組織並保持解析度。另外，fMRI記錄活躍神經元附近加速的血流，盡管其空間解析度很低，但作為一種非侵入式的方法在人腦研究中有重要意義。

通過上述兩種思路，我們往往會得出形如這樣的結果：「A區域和B區域（的xxx神經元）可能與X行為有關，C區域也對該行為有一些影響……」。可是這些區域究竟是如何連接的？區域的邊界在哪裡？每個區域中究竟有哪些種類的神經元？這些問題在上述兩種實驗中很難得到完整的解答。這時候就需要解剖學的方法，來對腦進行靜態的觀察。

如何將特定的細胞標記出來，從而可以將它們和周圍細胞區分開來？染色是生物中常用的一種方法。將GFP轉進小鼠中，可以標注某些特定細胞類型。MARCM（mosaic analysis with repressible cell marker）技術可以使一簇同種細胞中大部分細胞的熒光色素失活，只留下小部分具有熒光，從而更清晰地觀察單個細胞的形態。Photo-convertible/switchable GFP可以用光誘導特異性標注某一個神經元；CaMPARI（calcium-molated photoactivable ratiometric integrator）能特異性標注出活動的神經元，為活體動態記錄提供了工具。

除了觀察單個細胞的形態，我們還希望了解神經元之間連接的情況。GRASP技術和Functional Mapping能檢驗兩個神經元之間有無連接關系，而基於化學物質或病毒的跨膜tracer則可以找出某個神經元的上游或下游神經元。

上述就是神經環路研究的常用分子生物學方法了。

Bassett, D., Sporns, O. Network neuroscience.  Nat Neurosci   20,  353–364 (2017) doi:10.1038/nn.4502