已知基因序列用什麼方法獲得

『壹』 在已知目的基因的序列時，有哪些方法得到目的基因（具

在已知目的基因的序列時，有哪些方法得到目的基因（具
PCR技術擴增
從基因文庫中獲取目的基因
通過DNA合成儀用化學方法人工合成

『貳』 已知部分基因序列,如何獲得全長基因

基因是遺傳物質基本的功能單位，分離和克隆目的基因是研究基因結構、揭示基因功能及表達的基礎，因此，克隆某個功能基因是生物工程及分子生物學研究的一個重點。經典克隆未知基因的方法比如通過篩選文庫等有個共同的弊病, 即實驗操作繁瑣, 周期較長、工作量繁重,且不易得到全長序列。又由於在不同植物中目的基因mRNA豐度不同，所以獲得目的基因的難易程度又不一樣，特別是對於豐度比較低的目的基因即使使用不用的方法也不一定能獲得成功。近年來隨著PCR技術的快速發展和成熟.已經有多種方法可以獲得基因的全長序列, 比如經典的RACE技術，染色體步移法和同源克隆法等，本文主要綜述幾種重要的克隆方法的原理和老笑困運用，並且比較分析這幾種方法的優缺點，為你的實驗節約時間和成本。
1. RACE技術
1985年由美國PE-Cetus公司的科學家Mulis等[1]發明的PCR技術使生命科學得到了飛躍性的發展。1988年Frohman等[2] 在PCR技術的基礎上發明了一項新技術, 即cDNA末端快速擴增技術( rapid amplification of cDNA ends, RACE), 其實質是長距PCR( long distance, PCR)。通過PCR由已知的部分cDNA 序列, 獲得5′端和3′端完整的cDNA, 該方法也被稱為錨定PCR ( anchored PCR) [3] 和單邊PCR( one-sidePCR) [4]。RACE技術又分為3』RACE和5』端RACE。3′RACE 的原理是利用mRNA 的3′端天然的poly(A) 尾巴作為一個引物結合位點進行PCR, 以Oligo( dT) 和一個接頭組成的接頭引物( adaptor primer, AP)反轉錄mRNA得到加接頭的第一鏈cDNA。然後用一個正向的基因特異性引物( gene-specific primer, GSP) 和一個升緩含有接頭序列的引物分別與已知序列區和poly(A) 尾區退火, 經PCR擴增位於侍念已知序列區域和poly( A) 尾區之間的未知序列，若為了防止非特異性條帶的產生, 可採用巢式引物( nested primer) 進行第二輪擴增, 即巢式PCR( nested PCR) [5，6]。5』RACE跟3』RACE原理基本一樣，但是相對於3』RACE來說難度較大。
5'-RACE受到諸多因素的影響而常常不能獲取全長，因此研究者都著手改進它。這些措施主要是通過逆轉錄酶、5'接頭引物等的改變來實現的，因此出現了包括基於「模板跳轉反轉錄」的SMART RACE技術( switching mechanism at 5′ end of RNA transcript) [7] , 基於5′脫帽和RNA酶連接技術的RLM-RACE技術(RNA ligase mediated RACE)[8], 利用RNA連接酶為cDNA第一鏈接上寡聚核苷酸接頭的SLC RACE技術(single strand ligation to single-stranded cDNA)[9] , 以及以內部環化的cDNA第一鏈為模板進行擴增的自連接或環化RACE技術(self-ligation RACE or circular RACE)[10]，和通過末端脫氧核苷酸轉移酶( TdT)加尾後引入錨定引物的錨定RACE技術( anchored RACE)[11]。
1.1基於『模板跳轉』的SMART RACE技術
SMART-RACE技術的最大特點是5′ RACE過程中的「模板跳轉」現象,即當反轉錄進行到mRNA模板的5′末端時,反轉錄酶表現出末端轉移酶活性,在第一鏈cDNA的3′端加上3-5 個殘基(主要是dC) ,隨後第一鏈cDNA與3′端含幾個dG的寡核苷酸引物退火,使反轉錄反應發生跳移,以引物中寡核苷酸為模板繼續進行,最終反轉錄所得產物必然包含完整的mRNA5′末端序列及引物序列,可直接用於RACE-PCR獲得完整地5′ cDNA末端。由於上述過程無需接頭連接,而且直接以第一鏈cDNA作為模板進行RACE-PCR ,因此更加簡便、快捷。另外,SMART -RACE還採用了降落PCR、抑制PCR、LD - PCR 等先進擴增技術,提高了PCR擴增的敏感性和真實性,降低了非特異的產物背景,因此該技術已被廣泛應用於cDNA末端快速擴增,尤其是5』端的克隆。
1.2末端脫氧核苷酸轉移酶( TdT)加尾技術
傳統的5′RACE反應是以TdT對第一鏈cDNA進行同聚物加尾來引發第二鏈cDNA的合成[12] ,這種方法經常會導致RACE反應失敗或產生一些副產品。其主要原因是同聚物加尾反應難以控制,TdT 加尾時不能區分cDNA是否是全長,非全長cDNA分子被加尾後將在隨後的PCR反應中得到優先擴增,從而產生大量的非特異性產物背景，並且TDT的加尾效率比較低[13]。目前許多研究這對其進行了改進。
夏瑞等[11]提出了一種改良的TDT加尾克隆基因5』端的方法。其首先用1個15 bp左右的特異反轉錄引物代替通用反轉錄引物Olig( dT) n對模板cDNA進行初步篩選,使合成的cDNA更靠近目的基因的5′端。其次, 兩個上游引物採取巢式策略取代一般的poly( dG)n或poly ( dC)n，從而控制第二輪PCR的退火溫度, 保證擴增的特異性。並且在PCR過程中採用了如錨定PCR、巢式PCR、降落PCR等方法增加擴展產物的特異性。這些新的改進使得到目的條帶的概論增加，並且反轉錄引物不需要磷酸化, 從而大大節約實驗成本。
2.染色體步移法
染色體步行(chromosome walking)是指由生物基因組或基因組文庫中的已知序列出發逐步探知其旁鄰的未知序列或與已知序列呈線性關系的目的序列核苷酸組成的方法和過程14]。對於基因組測序已經完成的少數物種(水稻、擬南芥等)來說，可以輕松地從資料庫中找到已知序列的側翼序列。但是這畢竟只是研究少數模式植物時的情況，對於自然界中種類繁多的其植物而言，在不知道它們的基因組DNA序列以前，想要知道一個已知區域兩側的DNA序列，只能採用染色體步移技術。因而，染色體步移技術在現代分子生物學研究中佔有舉足輕重的地位，是結構基因組研究以及功能基因組研究的基礎。
目前,分離側翼序列的染色體步移方法主要有兩種,一是結合基因組文庫為主要手段的染色體步移技術,構建基因組文庫進行染色體步移盡管步驟比較繁瑣,但是適於長距離步移,可以獲得代表某一特定染色體的較長連續區段的重疊基因組克隆群。隨著亞克隆文庫條件構建條件的優化及測序技術的進步,這種方法也將更加快捷,准確。另一個是基於PCR擴增為主要手段的染色體步移技術。基於PCR擴增為主要手段的染色體步移技術步移距離相對較短,但是操作比較簡單,尤其適合於已知一段核苷酸序列的情況下進行的染色體步移。反向PCR、外源接頭介導PCR和熱不對稱交錯PCR(TAIl-PCR)等就是建立在PCR技術基礎上的染色體步行技術，為擴增已知序列旁側的未知DNA片段提供了捷徑．這些方法的建立可以不必經過煩瑣的建庫和篩選過程而獲得全長基因序列．
2.1連接介導PCR
連接介導聚合酶鏈反應是以連接反應為基礎的單側PCR技術，首先通過基因組DNA酶切，在酶切後的DNA片段的一端連接上一個公共連接子，而後用這個連接子為引物與另一個基因特異引物進行擴增，得到了包含連接子在內的基因序列。連接介導PCR又分為連接載體的PCR、連接單鏈接頭的PCR和連接雙鏈接頭PCR。此方法原理簡單,操作方便。
2.1.1連接載體的PCR
連接載體的PCR是利用已知基因組DNA序列設計的特異引物和載體通用引物進行擴增獲得目的片段的一項PCR技術。操作方法是首先用內切酶酶切基因組DNA和載體質粒DNA，得到小片段DNA和線形字體序列，然後用T4連接酶把載體序列與DNA小片段相連接，以連接產物為模板，以一個基因特異引物和載體引物進行擴展，通過克隆測序得到未知的側翼序列。
2.1.2連接單鏈接頭的PCR
連接單鏈接頭的PCR又叫鍋柄PCR，是連接單鏈接頭PCR的典型代表,因其以一個類似鍋柄結構的DNA分子為模板而得名[18]。其基本原理是：將基因組總DNA 用能產生5' 端突出末端的內切酶切割；接著連上一條單鏈的寡核苷酸，其具有兩個特點，其一是5'端和限制性片段的突出末端互補，其二是除此以外的序列必須和已知序列中一段完全同源；在PCR 的復性階段，外源接頭就會和其鏈內同源序列配對而成一個末端部分封閉的分子內環狀結構，在TaqDNA 聚合酶的作用下，沿著3' 端將單鏈部分完全補平後而形成一個鍋柄結構，因此這種方法也被稱為鍋柄PCR。由於其末端是一個反向重復序列，故最後只需一條引物即可完成對目標區段的擴增。
2.1.3連接雙鏈接頭PCR
雙鏈接頭法也稱為adapter介導的PCR法[ 19，20]。其主要過程為首先用能夠產生粘性末端的限制性內切酶消化基因組DNA,然後將末端配對的接頭和限制性片段連接,以其作模板,用接頭引物和已知序列特異引物進行PCR擴增,即可獲得包含側翼序列的目標片段。顯然，這類方法存在一個問題：即如何抑制接頭到接頭的非目標擴增。因此許多研究者由對其進行了改進，出現了抑制PCR，多功能接頭PCR和T接頭PCR[21]。
2.2熱不對稱交錯PCR(TAIl-PCR)
熱不對稱性PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)就是建立在PCR技術基礎上的染色體步移技術，為擴增已知序列旁側的未知DNA 片段提供了捷徑。該技術由Liu和Whitter於1995年首先研究並報道[22]。以基因組DNA為模板，使用高退火溫度的長特異引物和短的低退火溫度的簡並引物，通過特殊的熱不對稱(高嚴謹性PCR和低嚴謹性PCR交替)循環程序，有效擴增特異產物。該技術具有簡單快速、特異性高、分離出的DNA 序列可以用於圖位克隆、遺傳圖譜繪制和直接測序等優點，近年來，被分子生物學研究者廣泛應用，成為分子生物學研究中非常實用的基因側翼序列克隆技術，同時在植物基因克隆方面也取得了很大進展。
TAIL-PCR技術的基本原理是利用目標序列旁的已知序列設計3個嵌套的特異性引物(special prime ,簡稱sp1 ,sp2 ,sp3 ,約20 bp) ,用它們分別和1個具有低Tm值的短的(14 bp) 隨機簡並引物(Arbitrary degenerate prime 簡稱AD)相組合,以基因組DNA作為模板,根據引物的長短和特異性的差異設計不對稱的溫度循環,通過分級反應來擴增特異引物。
TAIL-PCR包括3輪PCR反應。第1輪PCR反應包括5次高嚴謹性反應、1次低嚴謹性反應、10次較低嚴謹性反應和12次熱不對稱的超級循環。首先5次高嚴謹性的反應，使長的高退火溫度的特異引物SPl與已知的序列退火並延伸，目標序列擴增成直線性型上升，由AD引物結合產生的非特異性產物的濃度則較低。而後進行1次低退火溫度的反應，目的是使簡並引物結合到較多的目標序列上，接下來10次較低嚴謹性的反應可以使兩種引物均能與模板退火，從而使原來由高嚴謹性循環所產生的單鏈靶DNA復製成雙鏈DNA，為下一輪線性擴增模板做准備。最後是進行12次熱不對稱的TAIL循環(超級循環即高特異性和低特異性循環交替)，目的片段得以指數性地擴增，擴增的量大大超過了非目標片段。經過上述一系列的反應得到了不同濃度的3種類型產物：TAIL-PCR中間會出現3 種類型的產物。類型1是特異引物和任意引物之間擴增的產物（即目標產物；類型2是單獨由特異引物擴增的產物；類型3是單獨由任意引物引發的產物。該方法由3步連續的PCR擴增過程構成。經過第一階段的PCR擴增後，類型2產物的分子數目在3種產物中最多，類型1產物稍低。在第二階段的擴增中，類型1產物的分子數逐漸升至最高，類型2分子數目基本保持不變，而類型3的分子數目仍然保持很低。在第三階段結束後，基本上只有類型1產物，即目的產物。
TAIL-PCR的技術難點，首先是引物設計，和一般的PCR反應相比，TAIL-PCR反應對引物的要求較高，引物的設計很是重要。特異性引物和簡並引物的選擇直接影響擴增的效果。特異引物設計：3個嵌套的特異性引物長度一般在20~30 bp之間，Tm 值一般設為58~68℃。SP1、SP2 和SP3之間最好相距100 bp以上以便在電泳時更容易區分3輪PCR產物。簡並引物是按照物種普遍存在的蛋白質的保守氨基酸序列設計的，相對較短，長度一般是14 bp左右，Tm值介於30~48℃之間。AD引物是否最佳與它的簡並度、引物長度和核苷酸序列組成有很大關系。
目前一些研究這又對TAIL-PCR進行了該進，比如省去了10個中等嚴謹度的PCR循環，3次PCR循環中的變性時間由5 s延長到了30 s,更有利於DNA徹底解鏈，第3次循環增加了熱不對稱交織PCR,更有利於特異目的片段的富集，把較低特異性反應的溫度從44℃降到29℃等，以利於更好的擴增目的片段。
3 .RACE技術與染色體步移方的比較
3.1 SMART-RACE與末端脫氧核苷酸轉移酶( TdT)加尾技術的比較
SMART-RACE技術是目前一種比較成熟的技術，它能夠最大限度地提高在反轉錄反應中獲取全長cDNA的可能，成功率高，可以節約時間並且操作程序簡單，但是於價格過於昂貴, 試驗成本增加, 而且對RNA質量要求很高。TdT加尾擴增法的優化改良, 成功率和穩定性都得到較大的提高，改良的TdT末端加尾擴增法綜合了多項PCR擴增方法如錨定PCR、巢式PCR、降落PCR等, 原理簡單易懂, 操作性強，能夠滿足一般基因克隆的要求。
3.2連接介導PCR與TAIL-PCR的比較
連接介導PCR原理簡單，但其需要DNA內酶切酶切，而內酶切又比較昂貴，增加實驗的成本。並且酶切的好壞，接頭處理方法是否得當而影響接頭與DNA小片段的連接效率，從而導致失敗。TAIL-PCR不需要進行DNA酶切而直接用DNA做模板進行擴增，僅僅只需要三輪PCR擴增，就可以得到目的條帶。簡單、特異性高、高靈敏度、快速、不涉及連接反應這就是TAIL-PCR的優點，但是TAIL-PCR也有缺點，主要是TAIL-PCR 反應需要較多的引物組合。此外,由於AD引物存在有限的結合位點,對於個別的側翼序列,即使使用不同的簡並引物也難以擴增到陽性結果。目前已經有學者提出用RAPD的引物替代AD引物的觀點，由於RAPD引物數量很多，所以可以解決AD引物存在有限的結合位點的不足。
4.總結
RACE是一種快速、有效的克隆基因全長cDNA的有效方法。基因的3』端通過RACE技術非常容易得到，但是5』端卻比較難，即使用比較昂貴的5』端RACE試劑盒也不一定能得結果。而基於PCR擴增的染色體步移法，卻有得天獨厚的優勢，它不僅僅能用於基因全長的獲得而且還可以得到基因5』端的啟動子序列。模板僅僅只要基因組DNA就行，原理簡單易懂，操作方法也簡單易行，並且非常的廉價，適用於不同水平和不同層次的研究者。筆者通過TAIL-PCR技術成功得到了芒果LFY基因的全長及其啟動子序列。

『叄』 已知一個基因的序列及其所屬物種,如何通過試驗方法獲得該基因的表達產物

可以利用基因工程獲得該基因的表達產物。
具體挺麻煩昌碰隱的哦 並且要視具體情況
首先 要搞到這個基因的編碼序列，從atg起始密碼子到終止密碼子，方法如下：
你說的「已知一個基因的序列及其所屬物種」指的是是基因組序列還是cDNA序列？ 如果是基因序列，也得想辦法弄到cDNA序列
通過基因序列進行軟體分析，預測外顯子和內含子。 同時在cdna文庫中進行搜索。確定部分cdna序列後，要做5-race 3-race克隆 確定cdna的全場序列，然後進行orf分析，確定此基因表達的蛋白。當然也必須要結合其他物種尤其模式物種的信息，通過同源對比確定這個基因的產物。 大致是如此，其實很多模式物種的基因信息庫已經建立，咱們要做耐廳的只是查詢就夠了

第二步 將編碼序列克隆到表達載體上： 原核表達載體 或真核表達載體 最好帶標簽的（例如his6，gst 目的為了檢測和純化）

第三步 載體轉化宿主，進行目的基因的表達。通過標簽進行純化
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以上是通過基因工程技術外源表達的方法
如果想獲得內源蛋白
如下
獲得該蛋白的抗體（通過基吵胡因工程產物，免疫動物制備）
利用抗體抗原親和性 把目的蛋白從樣品里拽下來

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提醒，以上方法現在隨比較常用， 可不是絕對唯一的哦
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1L說的是基因工程外源表達的方法 不要找原始文獻啦 因為是比較成熟的技術，找找電子書更好

『肆』 在已知序列信息的情況下獲取目的基因的最方便方法是

DNA聚合酶鏈式反應

將這些片段分別載入運梁晌載體，然後通過運載體分別轉入不同的受體細胞，讓供體細胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分別在受體細胞中大扒絕量復制（在遺傳學中叫做擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法吧帶有目的基因橡此鋒的DNA片段分離出來。如許多抗蟲，抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。

『伍』 已知細菌中的一個特定基因的序列,現在需要獲得這一基因,你會採用什麼方法為什麼

我會1.針對特定基因設計擴增引沒皮亂物。2.提握好取細菌基因組。3.以基因組為模板，利用設計好的引物進行特定基因的擴增。枯檔這樣就可以獲得這個基因了。
如果手上沒有這個細菌的話，就把特定基因序列送到公司進行基因合成。

『陸』 簡述目的基因獲取的方法

目的基因的獲取方法主要有以下2類
（1）已知基因的獲得 PCR分離法和化學合成法等
（2）未知基因的獲得 直接分離法和基因文庫分離法等
直接分離法
1、限制性內切酶法
用限制性內切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷
應用對象 適合於從簡單的基因組中分離目的基因 如質粒或病毒的大小隻有幾千鹼基 大的也超不過幾十萬鹼基 編碼基因比較少 獲得也比較簡單
（1）對已定序列的DNA分子 只需要用已知識別序列的限制內切酶進行一次或幾次切割 分離純化所需要的DNA片斷 與適當載體連接
（2）對已知定位的目的基因 只要根據目的基因兩側的已知的酶切識別位點 一次就可以獲得
（3）即使含目的基因的DNA分子未定序或定位 也只須通過酶切分析 隨後再通過部分酶切 構建一個簡單的基因文庫 從鉤出目的基因