『壹』 求細胞凋亡的一些系統的檢測方法，最好全！謝了！
Annexin V-EGFP細胞凋亡檢測試劑盒
產品說明：
凋亡是一種程序性的細胞死亡，與細胞的壞死有生化和形態等方面的不同。磷酯醯 絲氨酸(phosphatidylserine, PS)是細胞膜的一種組成成分，在正常細胞主要分布在細胞膜內側；細胞發生凋亡的早期，PS會外翻到細胞表面，即細胞膜外側。Annexin V 對PS有高度的親和力，可以選擇性結合和標記PS 。本試劑盒採用重組人Annexin V-EGFP融合蛋白，來檢測細胞凋亡時出現在細胞膜表面的PS，標識出凋亡細胞。由於壞死細胞和凋亡晚期細胞，其膜內側的PS也可以被Annexin V結合，通常用另一種活細胞非透過性熒光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)進行雙重染色，以區別凋亡早期細胞與壞死細胞和凋亡晚期的細胞。用Annexin V-EGFP和PI染色後，正常的活細胞不被Annexin V-EGFP和PI著色；凋亡早期的細胞僅被Annexin V-EGFP著色，PI 染色呈陰性；壞死細胞和凋亡晚期的細胞可以同時被Annexin V-EGFP和PI著色。用流式細胞儀或熒光顯微鏡直接觀察PS外翻這一細胞凋亡的重要特徵，是一種快速簡便的細胞凋亡經典檢方法。
操作方法：
染色液的配製：
1) 取適量4x Annexin V結合液，用雙蒸水稀釋至1xAnnexin V結合液。後續工作均使用1x Annexin V結合液。
2) 將20 μl Annexin V-EGFP加入1 ml Annexin V結合緩沖液中，即配成10次測試的 Annexin V染色液。
3) 將5 μl PI加入5 ml Annexin V結合緩沖液中，即配成10次測試的PI染色液。
熒光顯微照相操作方法：
1) 培養細胞用所需方法處理以誘導凋亡。應同時設置陰性對照。
2) 對貼壁生長細胞，離心收取培養液內的懸浮細胞，並用胰酶消化貼壁細胞，合並兩部分細胞懸液；對懸浮生長細胞，直接收集細胞。用冰冷PBS洗滌細胞後， 1000g離心5 min，棄上清，加入100 μl Annexin V染色液輕輕重懸細胞。室溫(20-25℃)放置，孵育10~15 min。再加入PI染色液0.5 ml混勻。室溫孵育5 min
3) 完成孵育後，1000g離心5 min，棄上清，輕輕重懸細胞於50~100μl Annexin V結合緩沖液中；取25-50μl細胞懸液滴到一張顯微載玻片上，再蓋上一張蓋玻片。
4) 熒光顯微鏡下，用藍光激發，觀察和拍攝細胞紅色發射圖像。結合Annexin V-EGFP 的凋亡細胞的質膜將顯示綠色光圈；膜結構不完整的壞死細胞和晚期凋亡細胞在整個核區被PI染成紅色而質膜為Annexin V-EGFP陽性呈現為綠色光圈。
5) 培養於48孔板或96孔板內的貼壁細胞，也可進行原位染色。在凋亡誘導結束後，用冰冷PBS輕輕洗滌細胞，完全去除PBS，加入100 μl Annexin V染色液，室溫孵育 10~15 min；吸除染色液，加入PI染色液0.5 ml混勻。室溫孵育5 min。立即在倒置熒光顯微鏡下觀察。
流式細胞分析操作方法：
1) 培養細胞用所需方法處理以誘導凋亡。應同時設置陰性對照。
2) 對貼壁生長細胞，用胰酶消化制備成單細胞懸液；對懸浮生長細胞，直接收集細胞。用冰冷PBS洗滌細胞後，取5~10萬重懸的細胞，1000g離心5 min，棄上清，加入100 μl Annexin V染色液輕輕重懸細胞。室溫(20-25℃)放置，孵育10~15 min。
3) 再加入PI染色液0.5 ml混勻。室溫孵育5 min。
4) 完成孵育後，立即進行流式細胞分析。採用488 nm雙波長激發，測定~510 nm和>575 nm的發射，細胞應可分成三個亞群：活細胞僅有很低的熒光強度，凋亡細胞有較強的綠色熒光，壞死細胞（包括極晚期凋亡細胞）有綠色和紅色熒光雙重染色。
注意事項：
1) 該試劑盒只能檢測活細胞，而不能用於切片、擦刮、固定或浸潤細胞樣品的檢 測。如需對活細胞固定進行其它檢測，可在本試劑盒標記完成後，用Annexin V結合緩沖液清洗細胞，再固定進行後續操作。
2) 細胞凋亡是一種持續變化的動態過程，選擇合適的誘導時間對觀察凋亡比較重要。
3) Annexin V和PI染色的活細胞應盡快檢測。
4) 微生物污染的細胞樣品或試劑可導致錯誤的觀察結果。
『貳』 流式細胞儀亞二倍體凋亡峰怎麼分析
1) PS（磷脂醯絲氨酸）在細胞外膜上的檢測：PS從細胞膜內側轉移到外側在細胞受到凋亡誘導後不久發生，可能作為免疫系統的識別標志。AnnexinV，一個鈣依賴性的磷脂結合蛋白，能專一性的結合暴露在膜外側的PS，再通過簡單的顯色或發光系統進行檢測。由於這是一種凋亡早期的活細胞檢測（懸浮細胞和貼壁細胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來標記凋亡的發展階段。
美國著名生物試劑公司CLONTECH和Invitrogen公司分別開發了多種標記的Annexin
V產品，簡便快速，10分鍾就可完成檢測。其中帶熒游標記的Annexin V-EGFP（Enhanced Green Fluorescent
Protein）及Annexin V-FITC，靈敏度高，可作為FACS（流式細胞分選）方法篩選凋亡細胞的基礎。由於融合蛋白Annexin
V-EGFP，EGFP與PS 的結合比例為1：1，還可進行定量檢測。除此之外，還提供生物素偶聯的Annexin
V，可通過常用的酶聯顯色反應來檢測。另外，MACS公司將磁珠包被Annexin V，可採用磁分選方法篩選凋亡細胞。
2)細胞內氧化還原狀態改變的檢測：
這反應了細胞凋亡研究中相對較新的趨勢，研究什麼樣的氧化還原環境引起下游事件的發生。CLONTECH公司的ApoAlertTM
GlutathioneDetection
Kit通過熒光染料monochlorobimane（MCB）體外檢測凋亡細胞細胞質中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細胞內氧化還原狀態的變化。正常狀態下，谷光苷肽（glutathione：GSH）作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細胞中，細胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉移系統。當細胞內GSH的排除非常活躍時，細胞液就由還原環境轉為氧化環境，這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C（三羧酸循環中的重要組分）從線粒體內轉移到細胞液中，啟動凋亡效應器caspase的級聯反應。
由於 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關，此項檢測除了對研究細胞凋亡的起始非常有用外，還可用於心臟病、中風等疾病治療的研究。但有些細胞如：HeLa 和3T3細胞凋亡時沒有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測。
3)細胞色素C的定位檢測
細胞色素C作為一種信號物質，在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下，它存在於線粒體內膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞液，結合Apaf-1
（apoptoticprotease activating
factor-1）後啟動caspase級聯反應：細胞色素C/Apaf-1復合物激活caspase-9，後者再激活caspase-3和其它下游caspase。細胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在線粒體內膜上的膜蛋白，凋亡發生時，它保留在線粒體內，因而它是線粒體富集部分的一個非常有用的標志。
ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心，可從凋亡和非凋亡細胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分，再進一步通過Western雜交用細胞色素C抗體和COX4抗體標示細胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發生。
4) 線粒體膜電位變化的檢測：
在凋亡研究的早期，從形態學觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機制研究的深入，發現線粒體凋亡也是細胞凋亡的重要組成部分，發生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導後線粒體轉膜電位會發生變化，導致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個陽離子性的染色劑，對此改變非常敏感，呈現出不同的熒光染色。正常細胞中，它在線粒體中形成聚集體，發出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在於細胞液中，發出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。CLONTECH公司的ApoAlert
Mitochondrial Membrane Sensor
Kit就採用這種原理來檢測線粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區分細胞凋亡或其他原因導致的線粒體膜電位的變化。
細胞凋亡晚期中，核酸內切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200 bp
的DNA片段。對於這一現象的檢測通常有以下兩種方法：
1) TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）
通過DNA末端轉移酶將帶標記的
dNTP
（多為dUTP）間接（通過地高辛）或直接接到DNA片段的3』-OH端，再通過酶聯顯色或熒光檢測定量分析結果。美國Intergen公司提供多種標記方法，直接熒游標記，地高辛介導熒游標記或過氧化物酶聯顯色，可做細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養物等多種樣本的檢測。其中，直接標記步驟少，操作簡便。而間接標記有信號放大的作用，檢測靈敏度高。
2) LM-PCR Ladder （連接介導的PCR檢測）
當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR
Ladder Assay Kit通過LM-PCR（ligation-mediated
PCR），連上特異性接頭，專一性地擴增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產生的核小體的梯度片段。此外，LM-PCR
檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。
上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特徵，但細胞受到其它損傷（如機械損傷，紫外線等）也會產生這一現象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。
3) Telemerase Detection （端粒酶檢測）
這是相對來說推出較早，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身RNA為模板逆轉錄合成端粒區重復序列，使細胞獲得「永生化」。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鍾，表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發現，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。Invitrogen公司的TRAP-eze
Telemerase Detection
Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分別與底物及端粒重復序列配對的引物。如果待測樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個數的6鹼基（GGTTAG）端粒重復序列，通過PCR反應，產物電泳檢測就可觀察到相差六個鹼基的DNA
Ladder現象（參見圖4）。此外，Intergen公司還提供用酶聯免疫法（ELISA）檢測的試劑盒.
同樣，這種檢測方法也不專對細胞凋亡，檢測結果也不純反應細胞凋亡的發生。 根據凋亡細胞固有的形態特徵，人們已經設計了許多不同的細胞凋亡形態學檢測方法。
1．光學顯微鏡和倒置顯微鏡
1． 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。
貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。
2． 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。
2．熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。
常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三種染料與DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T鹼基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。
Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。
DAPI為半通透性，用於常規固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。
結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。
3．透射電子顯微鏡觀察
結果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象（cavitations）的空泡結構；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。
細胞凋亡在胚胎發育、造血、免疫系統的成熟以及維護正常組織和器官的細胞恆定與生長平衡，乃至機體衰老方面都起著重要作用。因此，有關凋亡的研究在臨床和基礎等各個領域已經廣泛開展,凋亡細胞的檢測方法顯得非常重要。流式細胞儀(
Flow cytometry ,FCM)
將流體噴射技術、激光光學技術、電子技術和計算機技術等集於一體,較其它方法有不可比擬的優越性，既可定性又可定量,且具有簡單、快速和敏感性高的特點,可進行多參數和活體細胞分析。在APO
的研究得到較為廣泛的應用，開辟了新途徑。
1 光散射法
在FCM
系統中，被檢細胞在液流中通過儀器測量區時,經激光照射,細胞向空間360°立體角的所有方向散射光線,其中前向散射光( FSC)
的強度與細胞大小有關,而側向散射光(SSC)
的強度與質膜和細胞內部的折射率有關。細胞凋亡時,細胞固縮,體積變小,核碎裂形成,細胞內顆粒往往增多,故凋亡細胞FSC 降低而SSC
增高。細胞壞死由於胞體腫脹,細胞核亦碎裂分解故FSC 和SCC 均增高。正常細胞FSC 高而SSC
低。根據光散射特性檢測凋亡細胞最主要的優點是可以將光散射特性與細胞表面免疫熒光分析結合起來,用以區別辯認經這些特殊處理發生選擇凋亡的淋巴細胞亞型,也可用於活細胞分類。值得注意的是,根據FSC
和SSC
判斷凋亡細胞的可靠性受被測細胞形態上的均一性和核細胞漿比率影響很大,因此在某些淋巴細胞凋亡中,用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好而在腫瘤細胞凋亡中其可靠性較差。
2 細胞DNA 含量的測定
細胞凋亡時,核酸內切酶激活,導致DNA
斷裂,這是凋亡的特徵性表現,也為FCM 鑒別凋亡細胞奠定了基礎。而檢測細胞凋亡DNA 斷裂的方法中,最常用、最簡便的就是細胞DNA
含量分析。當細胞用乙醇、TrtionX—100 處理後細胞膜上出現漏洞,小片段DNA 從細胞內釋放出來,使其DNA
含量低於正常細胞的二倍體。用碘化丙啶( PI) 染色後分析,可在二倍體C0/ G1 ,峰前出現「亞二倍體」峰,即細胞凋亡峰(APO峰)
,根據APO 峰可測出凋亡細胞百分率,該法簡單易行,可大批定量檢測凋亡標本,亦可同時分析細胞的細胞周期位置。另外,應用FCM 方法通過對DNA
和RNA 的聯合檢測可以鑒別出G0 期細胞,因此,可分析細胞凋亡與G1 或G0 細胸的關系。DNA
降解的程度取決於凋亡的階段、細胞的類型和凋亡誘發因子的特性。染色過程中DNA 的逸出量變化也影響FCM
檢測結果。據研究,將高濃度的磷酸鹽———枸椽酸鹽緩沖液加入漂洗液中,可增高降解DNA 的逸出量,從而提高鑒別凋亡細胞與正常細胞的能力。
DNA
含量測定在檢測細胞凋亡中的局限性在於其特異性和敏感性均不高。特異性不高是因為APO 峰代表了一組細胞群體,包括凋亡細胞、機械損傷細胞、低DNA
含量的細胞或不同染色體結構的細胞,在上述情況下,DNA
與熒光染料的結合量均小。另外,非固定的細胞在低滲溶液中被溶解時,可導致大量的核碎片出現,此時APO
峰的細胞數目只代表了核碎片的數目,並不代表凋亡細胞數目。敏感性較差的原因是細胞凋亡早期只有DNA 斷裂點出現,但尚未出現DNA
片段的大量丟失,所以該法不能檢出早期凋亡細胞和發生於S 期或G2/ M 期的凋亡細胞,因為其實際含量不低於二倍體細胞所含的DNA
,因此該法進行凋亡細胞分析時應結合其它形態或生化方法,以期更准確地分析細胞的凋亡狀態。
3 Y 啶橙染色法( Acridine Orange ,AO)
AO
可將細胞或細胞核中的雙鏈DNA 和變性DNA 染成不同顏色的熒光。AO 插入雙鏈DNA
中時,發綠色熒光;AO也可與單鏈或通過變性而產生的DNA 單鏈發生作用,這時發出紅色熒光,因此,通過FCM
檢測不同的熒光,可判斷凋亡的發生。在測定被標准化後,綠色和紅色熒光強度的量與總DNA 含量成比例,紅色熒光與總體細胞(紅色加綠色)
熒光的比率表示細胞中變性DNA 的比例,因此,這種方法可用於評價DNA 對原位變性的敏感性。有時候,凋亡細胞DNA 降解不明顯,依賴於DNA
降解來檢測細胞凋亡的方法如細胞DNA含量測定、DNA 末端標記等就難以檢測到細胞凋亡變化。AO法檢測凋亡的原理不依賴於DNA
片斷的產生,因此其最主要的優點是可應用於寡核小體片段與凋亡不相平衡等情況,但AO 染色法不能有效區分有絲分裂細胞和凋亡細胞。
4 若丹明( Rh123) 染色法
細胞生活狀態下,胞膜上的鈉-
鉀泵、鈣泵等的作用,使細胞膜內外維持著不同離子的濃度梯度,包括Na + , K+ ,Cl - ,Ca2 + 等,形成細胞膜電位。FCM
可以檢測親脂性離子熒光染料在胞膜內外的分布,來測量膜電位的高低,以評價細胞的活力。Rh123
是一種親脂性陽離子熒光染料,對細胞膜具有通透性,線粒體膜尤敏感。細胞存活狀態時,若丹明123
通過細胞膜,積聚於線粒體發出綠色熒光。在細胞凋亡時,線粒體膜的轉運能力下降,電負性降低,故細胞線粒體積聚Rh123
的能力也喪失,熒光強度降低,據此檢測細胞的凋亡變化。但應指出,在凋亡的早期階段,由於胞膜尚完整,大多數細胞器和細胞功能相對較好,因此,Rh123
法對於早期凋亡細胞和活細胞的鑒別比較困難。
5 原位末端標記技術
細胞凋亡時,DNA 斷裂早於形態學改變及DNA
含量減少,原位末端標記( ISEL) 是將滲入到凋亡細胞中的外源性核苷酸在酶和DNA
的催化下與凋亡細胞因內源性核酸酶的激活而產生的單股或雙股斷裂相結合,較前述方面具更高靈敏性。通常有兩種方法: ①DNA 聚合酶I 或klenow
大片段介導的單位缺口平移( INST) ; ②末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記( TUNEL) 。
INST
是利用DNA 多聚酶將核苷酸整合到凋亡細胞內斷裂的DNA 處的3』末端,同時水解5』末端,以修復DNA
,若使用已標記的核苷酸即可顯示出有斷裂DNA 的細胞。1993 年,Gorczyca 等提出了末端脫氧核糖核酸轉移酶( TdT)
標記法采檢測凋亡細胞的DNA 斷裂,此種方法已得到廣泛應用。由於內源性核酸內切酶激活,細胞自身的染色質或DNA 被切割,並產生與DNA
斷點數目相同的3』2 羥基末端, TdT 可以將生物素化的dUTP 標記至3』2 羥基末端,通過卵白素2FITC 系統,使DNA
的斷點部位發生特異熒光而簽別出凋亡細胞,TdT 末端標記法是鑒別凋亡細胞比較特異的一種方法。腦組織中的凋亡細胞很少,因此基因組DNA
片斷需要更靈敏的檢測技術。將TUNEL 法與FCM 結合起來可以提高檢測凋亡細胞中DNA
片斷的靈敏度。經凋亡誘導因子處理一定時間後的細胞,原位末端標記的凋亡比Hoechst33342 染色顯示的要多,提示TUNEL
可檢測出尚未出現明顯凋亡形態學特徵但已發生DNA 裂解的核,從而使檢測的靈敏度提高。對比研究表明, TUNEL 的敏感性遠遠高於ISNT
,尤其在APO早期TUNEL 法陽性率較高,可能是APO 發生時DNA 多數為雙鏈同時斷裂,單鏈少見的原因。後者是依賴DNA
多聚酶介導的修復反應,故ISNT 的陽性率相對較低。TUNEL 還可結合細胞同期的分析,可同時了解凋亡細胞DNA
斷裂和細胞周期分布之間的關系,近來已成為鑒別和定量凋亡細胞的最常用方法之一。但由於斷裂DNA
的標記過程比較復雜,涉及多種因素,所以末端標記的陰性結果並不一定代表DNA鏈的完整,應排除方法上的問題,如TdT
酶活力的喪失等諸多影響因素。因此應用TdT 末端標記法鑒別凋亡細胞必須同時設陽性及陰性對照組,以便得到可靠結果。
6 Annexin V/ PI 法
1992 年Fadok 報道在APO 早期位於細胞膜內側的磷脂醯絲氨酸(phosphatidylserin
,PS) 遷移至細胞外側,這一現象出現在核染色質變性與核體積縮小之前。AnnexinV
是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白,和磷脂有高親合力,尤其與帶負電荷的磷脂如PS 具極強的結合力,利用其特性可以檢測細胞凋亡。但壞死細胞PS
亦暴露於外表使Annexin V 結合陽性,因此使用Annexin V 這一參數不能區分壞死或凋亡,必須同時採用PI
這一參數將壞死細膽區分開來。FCM 通過Annexin V —FITC 標志暴露於細胞膜上的PS 結合PI 進入損傷細胞膜標記降解DNA
分析凋亡與壞死細胞。在檢測時有4個亞群包括機械性損傷細胞(Annexin - / P1 + ) 、正常細胞(An2nexin - / PI - )
、凋亡細胞(Annexin + / PI - ) 和繼發性壞死細胞(Annexin + / PI + ) 被區分。Boersma
等應用Ampexin V2FITE染色法檢測細胞毒葯物處理後的中國倉鼠細胞凋亡變化,FCM
檢測發現熒光信號強弱不同的兩種細胞亞群。進一步形態學等證實弱熒光細胞亞群代表早期凋亡細胞,強熒光亞群代表晚期凋亡細胞,可見其是檢測和定量凋亡細胞的一種較為可靠的方法。細胞凋亡時膜上PS
外露早於DNA 斷裂發生,因此該法檢測早期凋亡更為靈敏,且該法不需要固定細胞,避免了PI 法因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL
法因固定出現的DNA 片段丟失,因此更加省時,結果亦更可靠,是目前最為理想的凋亡定量檢測方法。
7 其他
7.1 ssDNA
單抗法把抗單鏈DNA(ssDNA) 單克隆抗體用於細胞凋亡的檢測,是一種偶然發現,因為在應用ssDNA 單抗(熒光法)
檢測細胞毒性葯物誘導DNA 損傷中,觀察到凋亡的白血病細胞(MOL T24) 有較強的熒光,後來經過適當的改進,證明ssDNA
單抗可以特異地識別凋亡細胞。與TUNEL法相比,ssDNA 具有更強的靈敏性。TUNEL
法檢測的凋亡細胞可能只是單抗法檢測的凋亡細胞中的一個亞類。ssDNA法檢測APO 一般用免疫熒光法。但也可和FCM
結合應用。單抗法使用簡便、成本低、應用廣泛。ssDNA
單抗可以區別壞死和凋亡、甚至能檢測前期凋亡,凋亡後壞亡和一些特殊的凋亡形式(如無片段化的細胞凋亡) 。因此, ssDNA
單抗法可望成為一種新的特異靈敏檢測細胞凋亡的方法。
7.2
細胞凋亡的相關蛋白分析研究發現,有不少基因參加凋亡調控,這些基因產物可參與促進或抑制APO
的發生、發展,因此檢測凋亡調節基因蛋白對研究APO 及其調控有重要作用。迄今為止,已可對大量細胞凋亡調節基因的蛋白產物分析,如P53
蛋白、caspases、C2myc、Fas 抗原、TNF、bcl22 家族蛋白、cyclin、ras 等。FCM
用熒游標記的各種調控蛋白單抗染色,收集不同波長的熒光信號,檢測細胞膜表面或細胞內熒光分子數量,可以了解每個細胞的變化,而且所需樣品少,方法簡便、快捷、准確。
8 展望
近幾年來,隨著FCM
技術的不斷發展和APO 研究的逐漸深入,FCM 在細胞凋亡研究中日益廣泛。應用FCM
定量檢測凋亡細胞簡便、快速、客觀,並可進行多參數檢測,因此,可同時對APO
及其相關的癌基因表達、細胞周期分布等諸多因素進行相關分析,可以比較深入地了解凋亡的調節機制。盡管應用FCM
進行細胞凋亡研究的方法較多,但FCM檢測凋亡細胞的方法一般基於細胞凋亡過程中形態、生化等某一方面的特性,因而難於了解凋亡過程中發生的各種變化的相互關系,也使該類方法缺乏特異性,所以,聯合應用多種針對不同特性的FCM
檢測方法,才能更為有效地鑒別凋亡細胞。同時,FCM
研究結果尚需同時結合形態學觀察或生物化學方法,才能更加深入地了解凋亡細胞的生物學特性。隨著生物技術的發展及人們對APO
本質認識的深入,相信在不久的將來,定會有更為特異和敏感的方法問世,有助於細胞凋亡取得突破性進展。
『叄』 最常用的細胞凋亡檢測方法是什麼
細胞死亡的方式主要有兩種，包括 細胞壞死（necrosis）和細胞凋亡（apoptosis） 。細胞壞死是早已被認識到的細胞死亡方式，而細胞凋亡是近年來逐漸被認識且越來越受到重視的細胞死亡方式。兩種死亡方式最重要的區別是細胞壞死會釋放出細胞內溶物， 引起炎性反應 ，而細胞凋亡不會暴露細胞內溶物，一般被吞噬細胞吞噬清除， 不引起炎性反應 。
細胞凋亡，也稱 細胞程序性死亡，是指在一定的生理或者病理條件下，細胞主動的、高度有序的、自己結束其生命的過程 。細胞凋亡是生物體中一種普遍存在的現象，胚胎形成、個體發育、衰老和損傷細胞的清除等都與細胞凋亡密切相關。細胞凋亡在免疫學中也非常重要，如T細胞在胸腺內發育的過程，經過陰性選擇和陽性選擇後，95%的胸腺細胞發生凋亡，只有5%的胸腺細胞發育為成熟T細胞進入外周。
檢測細胞凋亡的方法很多，如電子顯微鏡或者光學顯微鏡下的形態學觀察、細胞DNA提取物的DNA梯狀帶電泳實驗等。而流式細胞術是非常重要的檢測細胞凋亡的方法，不僅可以定性，也可以定量。流式細胞術檢測細胞凋亡的方法也有很多，其中最重要是annexinV/PI雙染色法。其他的還有SYTO/PI雙染色法、細胞DNA含量分析法、線粒體損傷檢測法、活化的caspase-3檢測法、FLICA標記法、甲醯胺誘導ssDNA單抗檢測法、TUNEL法等。今天主要介紹一下annexinV/PI雙染色法。
Annexin V/PI雙染色法
正常細胞膜的磷脂分布是不對稱的，活細胞中 磷脂醯絲氨酸(phosphatidylserine,PS） 位於 細胞膜的內表面 ，細胞凋亡時，細胞膜發生變化， PS從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表 面。 annexinV是一種對PS有高度親和力的、鈣依賴性的磷脂結合蛋白 ，annexinV可以特異性地識別凋亡細胞表面的PS，而 活細胞的PS位於細胞膜的內表面 ，無法與annexinV特異性結合。所以可以用FITC偶聯的annexinV鑒別凋亡細胞和活細胞。
壞死細胞的PS也會從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表面，annexinV也能識別壞死細胞表面的PS，所以 annexinV無法區分壞死細胞和凋亡細胞 。而 PI染料能夠與細胞內的DNA結合 ， 區分壞死細胞和活細胞 。凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整，PI染料無法自由通過細胞膜進入細胞內與DNA結合，所以 PI染料無法標記凋亡細胞和活細胞 ，而PI染料卻能夠通過壞死細胞的細胞膜與細胞內的DNA結合，壞死細胞內PI染料被488nm激光激發後會發射紅熒光，被FL2或FL3通道接收。所以 annexinV和PI同時使用，就可以區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞 ，這就是annexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡的原理。
標記方法與常規標記熒光抗體的方能一樣：加入適量的FITCannexinV和PI，4℃靜置30min即可。注意 標記PI的方法與PI染色檢測細胞內DNA含量的方法不同，不需提前固定細胞 ，因為本方法標記PI是為了檢測細胞膜的通透性從而鑒別細胞是活細胞還是死細胞，而用PI檢測DNA含量時必須先破壞活細胞的細胞膜的完整性使PI進入細胞內與DNA結合。
下圖是用annexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡得到的一張散點圖。圖中大致可以分為三大細胞群：右上象限的細胞表型為annexinV+PI+，代表的是壞死細胞；右下象限的細胞表型為annexinV＋PI-，代表的是凋亡細胞；左下象限的細胞表型為annexinV-PI-，代表的是活細胞。通過annexin V/PI雙染色法可以非常明確地區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，並且可以定量分析各自所佔的比例。
例：
下圖引自［1］，作者用annexinV/PI雙染色法檢測肺癌細胞系「H1299」和「A549」細胞凋亡，證明肺癌細胞表面的TLR4受體與LPS結合後，能夠增強其抵抗TNFα和TRAIL誘導的凋亡。
從圖中可以看出，TRAIL誘導後，H1299肺癌細胞系的凋亡比例從3.36%上升到13.7%，被TNF-α/CHX誘導後，凋亡比例上升到16.9%；如果在誘導前加入LPS，活化H1299表面TLR4信號，被TRAIL誘導後凋亡比例只有3.8%，被TNF-α/CHX誘導後凋亡比例只有3.93%,說明H1299表面TLR4信號的活化能夠促進其抵抗凋亡。另一個肺癌細胞系A549的結果也相似，LPS活化TLR4信號後，TRAIL誘導凋亡比例從16%下降到3.09%，而TNF-α/CHX誘導凋亡比例從17%下降到11.8%。
［1］Weigang He, Qiuyan Liu, Li Wang, et al. 2007. TLR4 signaling promotes immune escape ofhuman lung cancer cells by incing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.Molecular Immunology, 44:2850-2859.
『肆』 如何用流式檢測細胞凋亡
前言
細胞凋亡通常稱為細胞程序性死亡，是由基因控制的主動性細胞死亡過程。越來越多數據發現，細胞凋亡與多種疾病密切相關，如癌細胞具有連續增殖、抵抗細胞凋亡能力，利用流式細胞儀分析細胞凋亡可為腫瘤診斷，療效評價和預後預測提供了重要的參考指標。然而很多實驗的同學們，常會碰到上機檢測時細胞死亡太多卻檢測不出凋亡，多次重復結果不一致等現象，本文就一起看看如何把細胞凋亡的數據變的更加漂亮，准確！
首先，明確一下細胞凋亡和壞死的區別
細胞凋亡(apoptosis) 是一件主動性細胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控，是細胞為更好地適應環境而主動爭取的一種死亡過程。 具體表現為： 出芽形成凋亡小體、核小體間DNA的切割，凋亡小體被吞噬和消化等幾個連續過程等[1]（如下圖所示）。
圖1：細胞凋亡的發生過程[1]
細胞壞死（necrosis） 則是一件被動的過程，是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程，即病理條件下，自體損傷的一種現象。 具體表現為： 細胞脹大，胞膜破裂，細胞內容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，會引起局部嚴重的炎症反應（如下圖所示）。
圖2：細胞壞死的發生過程[1]
一、流式檢測細胞凋亡的原理
Annexin V和PI雙染法是流式檢測細胞凋亡的經典方法 ，它是基於凋亡的早期細胞膜上的磷脂醯絲氨酸（phosphotidylserine, PS）從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面這一原理來實現的（如下圖3）。
圖3：凋亡早期 PS從細胞膜的內側外翻
該方法簡便、快速、准確區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，具體原理如下：
因此，將Annexin V與PI聯合使用時，便可用來鑒別活細胞，凋亡細胞及死亡細胞。
二、實驗操作步驟
三、數據分析
Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒是用FITC標記的Annexin V作為探針，FITC最大激發波長為488 nm，最大發射波長525 nm，FITC的綠色熒光在FL1通道檢測；PI-DNA復合物的最大激發波長為535 nm，最大發射波長為615 nm，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。通過軟體分析，繪制雙色散點圖，FITC為橫坐標，PI為縱坐標。
如下圖所示：細胞可以分為4個象限：
圖4：4個象限的細胞分布圖
舉例：如常用於研究葯物或者基因等對細胞凋亡的影響。 通過比較Control組和葯物組，發現化合物可以誘導前列腺癌細胞系PC-3M的細胞凋亡，處理組（20μM）的晚期凋亡細胞比例與Control組（0μM）相比，從1.79%上升到11.39%。進而還可根據每個象限的數據計算出活細胞、凋亡細胞和壞死細胞百分率。
圖5. 葯物濃度梯度依賴性的誘導PC-3M細胞凋亡[2]
四、常見問題解答
1. 如何避免出現假陽性結果？
2. 為什麼必須收集細胞上清？
因為凋亡的細胞可能會脫壁，懸浮於培養基，所以必須收集上清再離心取沉澱，合並胰酶消化下來的細胞，不然檢測出來的凋亡比例可能會減少。
3. 為什麼在染色後1h內就要上機檢測？
由於細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色後1小時之內進行分析；PI受時間的影響很大，因標記了PI後會加大細胞毒性，特別是檢測早期凋亡時，如果時間延長除了會導致在流式細胞儀上的細胞分群差距加大外，誤差會明顯加大，所以建議在一個小時內檢測。
4. 其他注意事項
參考文獻：
[1]Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007;35:495-516.
[2]Qin M, Peng S, Liu N, et al. LG308, a Novel Synthetic Compound with Antimicrotubule Activity in Prostate Cancer Cells, Exerts Effective Antitumor Activity.[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2015,355(3): 473-483.