用哪些方法研究酶的活性中心

1. 酶活力測定的方式方法有哪些

測定酶活力，可用物理法，化學法或酶分析法等方法。常用的方法有：第一，在適當的條件下，把酶和底物混合，測定生成一定量產物所需的時間，此即終點法。第二，將酶和底物混合後隔一定時間，間斷地或連續地測定反應的連續變化，如吸收度的增加或減少。
第三，將酶與底物混合後，讓其反應一定時間，然後停止反應，定量測定底物減少或產物生成的量。後兩種方法稱為動力學法或反應速率法：按取樣及檢測的方式可稱為取樣測定法或連續測定法。
（1）定時法：（兩點法）

通過測定酶反應開始後某一時間段內（t1到t2）產物或底物濃度的總變化量來求取酶反應初速度的方法。其中t1往往取反應開始的時間。

酶與底物在一定溫度下作用一段固定的時間，通過加入強酸、強鹼、蛋白醫學教育網整理沉澱劑等，使反應完全停止（也叫中止反應法）。加入試劑進入化學反應呈色測出底物和產物的變化。

該法最基本的一點是停止反應後才測定底物或物的變化。

優點：簡單易行，對試劑要求不高。

缺點：難保證測定結果的真實性。

難以確定反應時間段酶促反應是否處於線性期。隨著保溫時間的延續，酶變性失活加速。

（2）連續監測法：

又稱為動力學法或速率法、連續反應法。

在酶反應過程中，用儀器監測某一反應產物或底物濃度隨時間的變化所發生的改變，通過計算求出酶反應初速度。

連續監測法根據連續測得的數據，可選擇線性期的底物或產物變化速率用於計算酶活力。

因此連續監測法測定酶活性比定時法更准確。

實際工作中，採用工具酶的酶偶聯法已經成為醫學教育網整理應用最廣、最頻繁測酶活性濃度的方法。

（3）平衡法：

通過測定酶反應開始至反應達到平衡時產物或底物濃度總變化量來求出酶活力的方法，又叫終點法。

2. 酶活性分析的常用方法

一、量氣法

在封閉的反應系統中如有氣體變化，通過測量變化後的氣體體積或壓力很容易計算出氣體變化量，這是量氣法的基本原理。曾在檢驗科廣泛應用的Van-slyke測二氧化碳結合力的方法就是量氣法的一個典型例子。Warburg進一步加以發展，設計出專用於測定酶活性的華勃呼吸儀。這種儀器特別適用於測定那些在反應中產生或消耗氣體的酶，例如氧化酶反應涉及到O2的消耗，脫羧酶會產生CO2。但也不僅限於這些酶，科學家採用與CO2氣體保持平衡過的重碳酸鹽體系，可用來測定各種產生H+的酶反應，如各種還原酶，可使NADH變為NAD和H+，而H+會促使反應體系中重碳酸鹽變為CO2氣體。

二、比色法與分光光度法

在20世紀上半個世紀華勃儀得到研究實驗室廣泛的應用，並在酶學上得到豐碩的成果。但此法操作煩瑣，技術要求高而且靈敏度低。臨床常規中很少使用。多使用簡單易行的比色法測酶活性。在上半個世紀建立了一些適用於常規工作的測酶活性濃度的方法，如測定澱粉酶的Somogyi法，鹼性磷酸酶的Bodansky法、King法等等。這些方法都是在酶和底物作用一段時間後停止酶反應，加入各種化學試劑與產物或基質反應呈色，用比色計在可見光處比色，同時將被測物質作標准管或標准曲線，比較後計算出在此段時間內產物生成量或底物消耗量，從而求得反應速率v。

比色法從50年代起逐步被分光光度法所取代。這是因為分光光度法有以下幾個顯著優點：一是測定范圍不只局限在可見光，還可擴展到紫外和紅外部分。這就為擴大測定酶范圍提供了可能性。二是提供了尋找一類不需停止酶反應就可直接測定產物生成量或底物消耗量方法的可能性。例某一酶催化下列反應A－＞B＋C，A、B、C三種物質用分光光度法的吸收光譜如圖17-1所示。

圖17-1 A、B、C三種物質的吸收曲線

可以看到C在560nm處有一吸收峰，而A和B在此處無吸光度變化因此無需停止酶反應，只要在560nm處測定吸光度變化就很容易計算出C的變化速度，而且C物質比A、B二物質有更高的吸收峰，即靈敏度最高。

這類方法中最成功的是Warburg在50年代利用NAD（P）H和NAD（P）吸收光譜差異建立的測酶活性濃度方法。NAD（P）H在340nm處有一吸收峰，而NAD（P）在此波段卻毫無吸光性。因此建立了一類和原來比色法截然不同方法。不需停止酶反應，在340nm根據吸光度變化，就可觀察到酶反應變化全過程。

第三個優點是不需要如比色法那樣，作標准管或標准曲線，因為分光光度計使用近似單色光的光源，在此條件下，某一特定物質的吸光度為常數，即人們所熟悉的摩爾吸光度（molar absorbance）。根據此值從吸光度△A/△T不難計算出酶催化反應速度v。

分光光度計的這些簡便、准確等特點使它在近年來已逐步取代比色法而成為目前最流行的方法。其缺點是需要精確帶恆溫裝置的分光光度計，在經濟不發達地區尚難推廣。

分光光度法的技術多樣化。設計得當可用於各種酶的測定。表17-2是一些可用於分光光度法的氧化還原物質特性。

除了前述的NAD(P)H系統可用於脫氫酶測定外，可利用黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）來測定各種含這二個輔基的酶。它們的氧化型在450nm有一很強吸收峰，而還原型的吸光度很低，同樣細胞色素還原型在可見光有一個非常明顯和很窄的吸收峰，都使人們很容易用分光光度法研究這些酶的作用。上述物質主要用於氧化還原酶的測定。

科學家還設計出一系列人工合成酶的底物，用於其它酶的分光光度法測定。例如合成了很多對硝基酚的衍生物，用於各種水解酶的測定。鹼性磷酸酶底物磷酸對硝基酚就是一個成功例子。又如測芳香基硫酸酯酶，可使用人工合成的硫酸對硝基酚為底物，其分解產物的吸收峰由原來的278nm變為318nm，Webb成功地在330nm進行此酶監測

表17-2 一些氧化還原物質的特性

物質 波長（nm） 克分子吸光度
還原型 氧化型
NAD，NADP 340 6300 0
FMN 450 12200
FAD 450 11300
細胞色素C 550 29500 8300
亞甲藍（等消光點） 610 0 41000
二氫酚吲哚酚 600 0 21000
吩嗪甲酯硫酸 388 1500 22000
抗壞血酸 265 15100
連二亞硫酸鹽 314 8000 0
氰化鐵（亞鐵） 420 0 1020

分光光度法的上述原理還可以用於其它酶的測定，如烯醇化酶、延胡索酸水解酶的底物由於含不飽和鍵，在330nm處有很強吸收峰，而酶作用產物無此不飽和鍵。則不難在330nm處對這些酶進行直接測定。

此後在分光光度法的發展過程中又導入了酶偶聯技術。使得分光光度法幾乎能測定所有的酶。因此臨床實驗室工作者如不能很好掌握分光光度法的技術，不了解各種影響因素，要作好酶的測定是很困難的。

三、熒光法和同位素法

分光光度法有一個缺點，即靈敏度較低。有些標本中酶濃度很低時往往測不出來。此時可考慮改用熒光法，可將測定靈敏度提高2-3個數量級。如科學家合成了一系列甲基傘形酮的衍生物，可取代對硝基酚衍生物做為一些水解酶的底物，由於水解產物甲基傘形酮有強烈熒光，大大提高測定的靈敏度，就是分光光度法中最常用的NAD(P)H反應系統，也可改用熒光法，在340nm紫外線激發下NAD(P)H產生強烈的藍色熒光，而NAD(P)不被激發。此外，還可使用在熒光法基礎上發展起來的時間分辨熒光法，例如北京醫院就曾利用此種靈敏度極高方法測定很難用其它方法檢測的腦脊液中微量的烯醇化酶。熒光法不易掌握，對所用的試劑、容器和儀器都要求很高，否則易產生非特異熒光干擾測定，或者引起熒光的淬滅使測定不準，故此種方法多用於研究實驗室，少用於常規實驗室。為提高靈敏度，還可使用同位素標記的底物進行酶測定，例如，有人以C12標記的乙醯膽鹼為底物測定膽鹼酯酶，在酶作用後以離子交換法分離出含C14的乙酸。同位素方法由於對人體有害，操作麻煩，目前已很少使用。

四、其它方法

離子選擇電極法，旋光法等有時用於測定特定的酶，當酶反應牽涉到有酸鹼變化時，很容易用pH儀直接觀察酶反應過程中H+的變化。直接用pH儀測酶反應有兩個缺點：一是隨pH變化，會偏離酶作用的最適pH值，不可避免地引起酶反應速度變慢。其二是如測定的標本不是純酶時標本中其他蛋白及其它有緩衡能力的物質將會影響所測pH變化的程度。此時如改用電位滴定儀則更為適合。此儀器可在酶反應過程中不斷向反應體系中加入酸或鹼以維持反應體系pH的恆定，而加入的酸鹼量只與體系中H+變化量相關，和反應體系中緩衡能力無關。

同樣如酶反應中有O2變化，可使用氧電極來監測酶反應過程，這可用來測定葡萄糖氧化酶活性，Chappell還成功地將此技術用於測線粒體的氧化能力。還曾有人嘗試用二氧化碳和氨電極測酶，由於這些電極反應時間較慢，不利於檢測酶反應速度。有些酶的反應物為光學異構體，則可根據旋光度變化來追蹤酶反應。某些反應物如羥基酸本身雖無旋光性，但與鉬結合後產生很高的旋光性。根據此特性建立了測定延胡索酸水合酶的方法。還有個別酶的測定使用了極譜法、高效液相色譜法等。總之，實驗室工作者完全可以根據實驗室現有儀器和技術，創造性地建立一些新的測活性濃度的方法。

3. 酶活力的常用測定方法

常用的測定方法有取樣法和連續法。

1、取樣法

在酶反應開始後不同的時間，從反應系統中取出一定量的反應液，並用適當方法停止其反應，再根據產物和底物在化學性質上的差別進行分析，求得單位時間內酶促反應的變化量。

2、連續法

基於底物和產物在物理化學性質上的不同，在反應過程中對反應系統添加酶的變性劑以終止反應，常用的連續測定法是光吸收測定法，即根據產物和底物在某一波長或波段上有明顯的特徵吸收差別而建立起來的連續觀測方法，幾乎所有的氧化還原酶都可用此法測定。

此外如熒光法、旋光法、電化學法也是常用的連續測定方法。對不易直接測定的反應，可使用酶偶聯分析法，即用過量、專一的「偶聯工具酶」，使被測反應繼續進行到某一可直接測定的階段。近年來，酶活性的測定工作正向兩個方向發展，超微量酶活的靈敏測定，實現測定過程的自動化控制。

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酶活力的大小可以用在一定條件下，它所催化的某一化學反應的轉化速率來表示，即酶催化的轉化速率越快，酶的活力就越高；反之，速率越慢，酶的活力就越低。所以，測定酶的活力就是測定酶促轉化速率。酶轉化速率可以用單位時間內單位體積中底物的減少量或產物的增加量來表示。

酶活力的測定既可以通過定量測定酶反應的產物或底物數量隨反應時間的變化，也可以通過定量測定酶反應底物中某一性質的變化，如黏度變化來測定。通常是在酶的最適PH 值和離子強度以及指定的溫度下測定酶活力。

4. 採用什麼方法可以定量測定酶活性

肯定是分光光度法噻~~~
根據酪氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，所以蛋白質溶液在280nm有一個吸收紫外吸收高峰！~在一定濃度范圍內，蛋白質溶液在最大吸收波長處的吸光度與其濃度成正比~~~然後有專門的蛋白質量和酶活力的換算公式，但是這種方法的准確性不是很好，試驗中存在很多影響因素！！！！這種方法用於很多酶和蛋白質的測定，還可以用於某些dna和rna的定量測定哦~~~
熒光法一般用於體內酶促反應的酶和抗體的測定，通過酶等和底物的反應，把底物用熒光物標記起來，反應後在紫外線的激發下觀察熒光的強弱，從而判斷酶活力的大小，不過用於定性的測定為多~~~
酸鹼滴定似乎沒注意過，好像看到過測定脂肪酶的活性吧~~~通過用酸鹼滴定法測定水解液的酸價，依靠指示劑的變化判斷，而且有酸鹼滴定操作肯定很麻煩~~~~
測壓發法也沒聽到說過，不知道是怎麼回事~~~
碘量法肯定用於澱粉酶的測定嘛~~~~~澱粉酶能水解澱粉，不會和碘反應產生藍色的噻~~
然後還有什麼質譜分析，hplc（高效液相色譜）等等，反正還有很多高科技的測定方法的~~~
最常用的就是分光光度法啦~~~~