Ⅰ 蘋果酸乳酸發酵
蘋果酸乳酸發酵
蘋果酸乳酸發酵，很多不是很懂酒的人是不太清楚蘋果酸乳是什麼東西，其實它是會運用與在葡萄酒上的一種發酵物，它在葡萄酒中產生的作用是非常大的，以下是關於蘋果酸乳酸發酵。
蘋果酸-乳酸發酵（Malolactic fermentation，MLF）指在乳酸菌作用下將L-蘋果酸脫羧基形成 L-乳酸的過程，是葡萄酒生產難以控制的二次發酵過程，主要由酒類酒球菌引起。
在葡萄酒的釀造過程中，蘋果酸-乳酸發酵不僅可降低生葡萄酒的酸澀和粗糙感，使之柔和、圓潤，而且還提高了葡萄酒的感官質量和生物穩定性，所以，許多優質紅葡萄酒甚至一些佐餐紅葡萄酒都要進行蘋果酸乳酸發酵。
北方地區氣候寒冷，蘋果酸度較高，釀造出的蘋果酒口感較酸澀，需要進行蘋果酸乳酸發酵來改善其風味。相反，南方地區蘋果酸度較低，有些釀酒師並不提倡進行蘋果酸乳酸發酵，所以更多的釀酒師考慮的是蘋果酸乳酸發酵對葡萄酒、蘋果酒風味的貢獻。
MLF所需微生物
乳酸菌LAB在自然界廣泛存在，可存在於葡萄的果實和葉梗的表面。LAB為原核微生物，革蘭氏染色陽性細菌，其生長繁殖需要從生物氧化中獲得能量，當某化合物氧化時便失去電子，為平衡代謝某化合物接受電子而被還原。在蘋果酸乳酸轉化中，蘋果酸是電子供體，而乳酸是電子的受體。LAB也能用丙酮酸作為電子受體，並產生乳酸。
MLF對葡萄酒品質的影響
降酸作用
MLF將氫離子固定在乳酸上可以使滴定酸度下降0.01g到0.03 g酒石酸酸度/L，pH增加0.3，這一點非常重要，因為如果葡萄酒pH低於3.5，LAB的代謝活性可以升高pH水平，從而使葡萄酒的酸度降低，改善葡萄酒的口感。
提高細菌穩定性
MLF可以提高葡萄酒中細菌的穩定性，MLF發生時由於營養物質的消耗或細菌素的產生其他微生物的生長受到抑制。MLF發生的時間也很重要，如果發生在葡萄酒裝瓶之前，就可預防其在瓶中的生長。LAB在瓶中的生長或可引起葡萄酒渾濁、CO2產生，產生多糖導致酒體變黏，或pH提高促使其他腐敗微生物的生長等。
風味的改善
葡萄酒經LAB發酵之後，不僅產生乳酸，也產生其他代謝產物，對葡萄酒的風味產生影響。 在有限通風條件下，酒類酒球菌傾向於產生乳酸和乙醇，欲產生更多乳酸則要求更多的通風。
然而，其他LAB在此條件下可能產生醋酸，醋酸本身有刺激性，所產生的醋酸的量非常重要，應避免超出感官檢測的閾值。LAB產生的另一個重要的化合物是雙乙醯，雙乙醯有特徵性的奶油風味。
雙乙醯的形成取決於前體物質的出現，可由乙醛和乙醯CoA反應形成，或丙酮酸和乙醛反應產生五碳的乙醯乳酸，後者進而再形成四碳的'雙乙醯分子和一分子CO2。LAB 發酵過程中可產生的 2，3-丁二醇來自乙偶茵，具有淡淡的苦啤酒的風味，通常在檢測閾值以下。
它的形成是一個還原的過程，即電子以乙偶茵和 2，3-丁二醇的形式固定。LAB 發酵過程中還產生乳酸乙酯、丙烯醛等，對葡萄酒的風味產生影響。在含氮豐富的果汁發酵時，葡萄酒中出現乳酪的風味。賴氨酸是酵母的重要營養，但過量添加會導致出現所謂的鼠臭味。一些植物乳桿菌和短乳桿菌代謝酒石酸為醋酸，產生所謂的敗壞病，這些是葡萄酒釀造中不希望看到的。
誘發蘋果酸-乳酸自然發酵需要採取以下措施：
1、PH值的調整：
當葡萄酒酸度比較高時，也就是在最需要進行蘋果酸-乳酸發酵時，這一發酵就越難觸發。
在這種條件下，輕度的化學降酸，將PH值提高到3.2，有利於蘋果酸-乳酸發酵的觸發。
為此，可通過在每升葡萄酒中加入500~1000mg碳酸鈣或1000~1500mg碳酸氫鉀達到這一目的。
2、溫度的控制：
要保證蘋果酸-乳酸發酵的觸發和順利進行，必須使葡萄酒的溫度穩定在18~20℃。
因此，在紅葡萄酒浸漬結束轉罐時應盡量避免溫度的突然下降，在氣溫較低的地區或季節還必須對葡萄酒進行升溫處理。
最理想的升溫方法是利用暖氣對環境加熱，但如果溫度高於22℃，生成的揮發酸含量則較高，從而影響葡萄酒的質量。
3、二氧化硫的處理：
乳酸細菌對游離態二氧化硫較為敏感，結合態二氧化硫也會影響他們的活動，因此，對葡萄酒原料的二氧化硫處理酒成為控制蘋果酸-乳酸發酵的必要條件，而且二氧化硫的用量應足以防治乳酸菌病害，但又不能成為在酒精發酵結束後蘋果酸-乳酸發酵的限制因素。
為此，葡萄原料的二氧化硫處理最多不能超過100mg/l；
酒精發酵結束後應絕對避免葡萄酒的二氧化硫處理。
4、通風：
通風對乳酸細菌的生長常常是有利的。
因此正在酒精發酵結束後，可對葡萄酒進行適當的通氣。
但是，在這一發酵過程中應盡量保證容器處於添滿狀態，以避免醋酸菌的活動。
利用正在進行蘋果酸-乳酸發酵的葡萄酒接種：
在葡萄酒酒精發酵結束以後，由於沒有良好的發育條件和缺乏活潑的乳酸菌，有時蘋果酸-乳酸發酵並不能立即進行。
這時可在含有多量蘋果酸的葡萄酒中加入25~50%的正在進行或即將結束的蘋果酸-乳酸發酵葡萄酒，或用這種葡萄酒換池時的酒腳或過濾的沉澱來接種。
在保持適當溫度條件下，將酸度很高的葡萄酒與經過自然發酵酸度減弱等等葡萄酒相混合，這樣就可從少量蘋果酸-乳酸發酵的葡萄酒出發，在數星期之內，使大量的葡萄酒降酸。
這一方法的缺點是：首先，必須有適合的葡萄酒；
其次，在接種後葡萄酒中的乳酸菌不一定會順利繁殖；
若加大接種量，對於這種發放產生蘋果酸-乳酸發酵顯然是不必要的，但也許是不現實的。
人工誘發蘋果酸-乳酸發酵——活性干乳酸菌的使用：
1、蘋果酸-乳酸發酵的發酵劑：
景谷縣一些即耐酒度、酸度，又首先轉化蘋果酸的優良乳酸菌株，經過大量繁殖之後作為發酵劑使用，可以使葡萄酒的蘋果酸-乳酸發酵安全可靠。
現在，國外市場已有葡萄酒明串球菌和乳桿菌製成活性乳酸菌發酵劑出售（有興趣的夥伴八匠鼎松仁建議大家可以咨詢查閱一番）。
目前發酵發酵劑的類型可分為液體培養發酵劑、冷凍乾燥發酵劑、冷凍濃縮發酵劑和復合發酵劑4中。
他們的特點如下：
①、液體培養發酵劑：
其優點是活性高且適應力強，其缺點是保存時間短，在轉移到新培養基之前，只能在冰箱中保存大約兩周。
②、冷凍乾燥發酵劑：
目前多數蘋果酸-乳酸發酵劑大多採用此形式。
他們大量地接種和酒中以達到能觸發蘋果酸-乳酸發酵的菌群數，而且可以被貯藏在封閉物體或冰箱中，大約一年都不會失活。
有些凍乾的發酵劑不用復水和再生酒可直接加到葡萄酒中。
其缺點是這些凍乾的菌株不能再惡劣的環境匯總生長繁殖（例如在非常低的PH值、高酒精度、養分缺乏的葡萄酒中）；
③、冷凍濃縮發酵劑：
深度冷凍室最好的保藏發放，在-20℃~-80℃的溫度下保藏。
細菌必須保持冷凍狀態，一旦融化就必須復活或使用，而不能重新冷凍；
④、復活發酵劑：
有幾種乳酸菌組成的發酵劑是有益的。
因為它能較好地適應葡萄酒中的營養條件並對破壞單菌株的噬菌體有抵抗力。
當使用復活菌株發酵劑時，要記住每個起始物培養基和葡萄酒都要選擇特定的菌株。
這些發酵劑活活化後接到葡萄酒中，可以成功地觸發蘋果酸-乳酸發酵。
但是，用活性干乳酸有效地控制蘋果酸-乳酸發酵，必須滿足一下條件：
①、葡萄酒的總二氧化硫通常不能超過80mg/l；
②、活性干乳酸菌在接種前應在稀釋一倍並含有5g/l酵母菌自溶物、PH值4.5的含糖為80g/l的葡萄汁中活化24~72小時，使活性乳酸菌群體數量達到107個/ml；
③、發酵溫度必須控制在18~20℃的范圍內，PH值3.2以上。
Hansens等人推出了無需活化即可直接接種於葡萄汁或正在進行酒精發酵的葡萄酒中的活性乳酸菌Viniflora LP。
改產品是由純培養植物乳桿菌經過冷凍獲得的活性干乳酸菌。
據研究報道，Viniflora LP在接種後可立即觸發蘋果酸的分解，並在3~7天內結束，且過程中不影響發酵和不產生揮發酸。
2、人工誘發蘋果酸-乳酸發酵條件的控制：
①、葡萄收獲季節到來之前，就實行蘋果酸-乳酸發酵計劃。
葡萄必須再沒有腐爛現象的情況下採摘，以減少醋酸菌和野生酵母進入釀酒廠，這樣可以保證二氧化硫添加量控制在50mg/l以下；
②、子啊壓榨葡萄汁時加入少量或不加二氧化硫，無游離二氧化硫或微量，總二氧化硫控制在20~40mg/l，以消減一些潛在的有害細菌和酵母；
③、一般在酒精發酵快結束（殘糖＜50g/l）或酒精發酵完成後即酒精濃度＜14%（體積分數）時接入乳酸菌為最好；
④、PH：3.2~3.5；溫度：18~20℃；
⑤、分解L-蘋果酸（每天下降0.1~0.2g/l）為好。
3、蘋果酸-乳酸發酵結束的控制：
葡萄酒在經過蘋果酸-乳酸發酵以後，其中的乳酸菌群體數量並不立即下降，子啊適宜的條件下，他們可以以平衡狀態較長期地存在於葡萄酒中，在此期間可作用於殘糖、檸檬酸、酒石酸、甘油等葡萄酒成分
引起多種病害和揮發酸含量的升高，因此，當通過紙層析檢測到葡萄酒中無蘋果酸時，已表明蘋果酸-乳酸發酵結束，此時應立即分離轉罐，以除去酒腳，同時需要進行20~50mg/l的二氧化硫處理，以充分抑制乳酸菌的活動，保證葡萄酒的生物穩定性。
蘋果酸-乳酸酶的新技術：
1、蘋果酸-乳酸酶的研究和應用：
葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵的實質是乳酸菌中的眾多酶類參與生化作用的結果。
根據這一機理，目前已研製出蘋果酸-乳酸酶。
則為控制蘋果酸-乳酸發酵開辟了新的途徑。
研究人員正在努力提高這類酶對葡萄酒固定酶接種葡萄酒的方式促進蘋果酸-乳酸發酵。
但現在面臨的困難主要是在實踐中很難獲得大量的蘋果酸-乳酸酶，而且在貯藏過程中，即使在-20℃的條件下，其活性也很快地下降，因此，這一方法仍處於實驗階段。
2、固定化乳酸菌進行蘋果酸-乳酸發酵的應用：
由於乳酸菌的生長受到葡萄酒的ph、二氧化硫、酒精濃度的抑制，加之發現了靜止乳酸菌細胞也可迅速降解蘋果酸，不一定非在生長中的乳酸菌發生蘋果酸的降解。
所以，近年來日本等過進行了固定化乳酸細胞進行蘋果酸-乳酸發酵的研究。
其方法是採用海藻酸鹽凝膠、聚丙烯醯胺凝膠、瓊脂、交叉菜聚糖加5%皂土等，把乳酸菌細胞（108~109個/ml）包埋於凝膠內，製成固定化乳酸菌細胞。
人喉將固定化乳酸菌裝入柱中，串聯或其他方法使用即可進行葡萄酒的蘋果酸-乳酸連續發酵。
但由於反應器存在易污染雜菌、固定化劑和固定化細胞會脫落於葡萄酒中以及連續發酵細胞的活性會逐漸下降等缺點，尚需進一步完善，才能應用於工業化生產。
Ⅱ 乳酸菌 活化方法
放進適宜的水與葡萄糖與一定的無機鹽,在適宜的pH值和溫度等條件下,在密閉的絕對干凈的容器內進行,應該是這樣~~!因為你的凍干保存的乳酸菌只是缺水,有水就能活了.如果我沒記錯,應該是這樣吧....簡單一點就低濃度水再水浴加熱(溫度不能太高)....不過我勸你還是問以下專家.....我的答案可能是錯的,請原諒~~~!!!!!!!!!!
Ⅲ 生物選修1知識點 詳細
徐州二中2011屆生物知識點匯總（選修一模塊）
考點一、酶的應用：酵在洗滌等方面的應用；制備和應用固相酶
一、酶在洗滌等方面的應用
1．加酶洗衣粉是指含有酶制劑的洗衣粉,目前常用的酶制劑有四類：蛋白酶、脂肪酶 、澱粉酶、纖維素酶 。其中應用最廣泛、效果最明顯的是鹼性蛋白酶 和鹼性脂肪酶 。鹼性蛋白酶能將血漬、奶漬等含有的大分子蛋白質水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽，使污跡從衣物上脫落。脂肪酶、澱粉酶和纖維素酶也能分別將大分子的脂肪、澱粉、纖維素水解為小分子物質，使洗衣粉具有更強的去污能力。
酶制劑的特點：能夠耐酸、耐鹼、忍受表面活性劑和較高的溫度，並且通過特殊的化學物質將酶層層包裹，與洗衣粉其他成分隔離。
2、影響酶活性的因素有溫度 、酸鹼度 和表面活性劑 。 酶不能直接添加到洗衣粉中，因為洗衣粉中的表面活性物質會降低酶的活性。將基因工程生產出的酶用特殊水溶性物質包裹起來，與洗衣粉的其它成分隔離開來。
3、加酶洗衣粉能減少對環境的污染，因為加酶洗衣粉可以降低表面活性劑和三聚磷酸鈉的用量，使洗滌劑朝低磷、無磷的方向發展。（普通洗衣粉的化學成分有：表面活性劑、水軟化劑、鹼劑、漂白粉等成分，有的洗衣粉中還含有增白劑、香精和色素，以及填充劑等。）
普通洗衣粉 加酶洗衣粉
相同點 表面活性劑可以產生泡沫，可以將油脂分子分散開，水軟化劑可以分散污垢
不同點 酶可以將大分子有機物分解為小分子有機物，小分子有機物易容於水，從而與纖維分開
4、可在洗滌後比較污物的殘留狀況，如：已消失、顏色變淺、面積縮小等來判斷洗滌效果。
二、制備和應用固相酶
1、固定化酶是指在一定的空間范圍內起催化作用，並能反復和連續使用的酶。
原理：將酶固定在不溶於水的載體上，使酶既易催化反應，又易於回收，可以重復使用。
2、使用固定化酶技術，將這種酶固定在一種顆粒狀載體上，再將這些酶顆粒裝到一個反應柱內，柱子底端裝上分布著許多小孔的篩板。酶顆粒無法通過篩板的小孔，而反應溶液卻可以自由出入。生產過程中，將葡萄糖溶液從反應柱的上端注入，使葡萄糖溶液流過反應柱，與固定化葡萄糖異構酶接觸，轉化成果糖，從反應柱的下端流出。反應柱能連續使用半年，大大降低了生產成本，提高了果糖的產量和質量。
3．固定化酶和固定化細胞是利用物理或化學的方法將酶或細胞固定在一定空間內的技術，包括包埋法、化學結合法和物理吸附法。一般來說，酶更適合採用化學結合和物理吸附法固定，而細胞多採用包埋法固定化。這是因為細胞個大，而酶分子很小；個大的難以被吸附或結合，而個小的酶容易從包埋材料中漏出。
4．包埋法法固定化細胞即將微生物細胞包埋在不溶於水的載體中。常用的載體材料有明膠、瓊脂糖、海藻酸鈉、醋酸纖維素和聚丙烯醯胺等。
固定化細胞是在固定化酶的基礎上發展起來的，它的優點如下：(1)省去了酶的分離手續.為多酶系統,無須輔因子再生；(2)細胞生長快,而且多,反應快；(3)可以連續發酵,節約了成本,而且在蒸餾和提取前不用分離去細胞,能一邊徘出發酵液,一邊進行培養,排除了產物抑制和消耗；(4)保持酶在細胞內的原始狀況,增加了酶的穩定,特別是對污染因子的抵抗力增加.
缺點：(1)必須保持菌體的完整,防止菌體自溶,否則,將影響產品純度；(2)必須防止細胞內蛋白酶對所需酶的分解,同時,需抑制胞內其他酶的活性止副產物的形成；(3)細胞膜,壁會阻礙底物滲透和擴散。
類型 優點 不足
直接使用酶 催化效率高，低耗能、低污染等。 對環境條件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很難回收，不能被再次利用，提高了生產成本；反應後酶會混在產物中，可能影響產品質量。
固定化酶 既能與反應物接觸，又能與產物分離，固定在載體上的酶還可以被反復利用。 一種酶只能催化一種化學反應，而在生產實踐中，很多產物的形成都通過一系列的酶促反應才能得到的。
固定化細胞 成本低，操作更容易。 固定後的酶或細胞與反應物不容易接近，可能導致反應效果下降等。
應用：1、某一實驗小組的同學，欲通過制備固定化酵母細胞進行葡萄糖溶液發酵實驗，實驗材料及用具齊全。（1）酵母細胞的固定採用的方法是包埋法。
（2）請完善該實驗小組的同學在制備固定化酵母細胞過程的步驟
①配製氯化鈣溶液時應用蒸餾水。 ②海藻酸鈉溶解應用小火間斷加熱，邊攪拌邊加熱。③海藻酸鈉溶液必須冷卻至室溫才能加入酵母細胞。④注射器中的海藻酸鈉和酵母細胞的混合物應滴入氯化鈣溶液中形成凝膠珠。
（3）該實驗小組用如圖所示的裝置來進行葡萄糖發酵
①為使該實驗中所用到的固定化酵母細胞可以反復運用，實驗過程中，一定要在無菌條件下進行。
②加入反應液後的操作是關閉活塞1和活塞2。
③裝置的長導管起到什麼作用？釋放CO2，減小反應柱內壓力；防止空氣進入反應柱。
（4）實驗過程中，可能會觀察到的現象：有氣泡產生、有酒味散發
實驗過程中，裝置內可能會發生的反應式為：（有氧呼吸、無氧呼吸產生酒精和二氧化碳）
應用：2、麥芽汁可以滲入到由海藻酸鈉和啤酒酵母製成的凝膠珠中，啤酒酵母可以利用自身細胞內的一系列酶將可發酵性糖轉化成乙醇。下面是利用固定化酵母細胞發酵生產啤酒的實驗過程：
步驟1：酵母細胞的活化。稱取lg乾酵母置於50mL燒杯中，加l0mL蒸餾水，攪拌，靜置1h。
步驟2：配製物質的量濃度為0．05mol／L的氯化鈣(CaCl2)溶液。
步驟3：配製海藻酸鈉溶液。稱取0.7g海藻酸鈉置於50mI燒杯中，加l0mL蒸餾水，燒杯放在酒精燈上用小火或間斷加熱。
步驟4：在冷卻至常溫的海藻酸鈉溶液中加入活化的酵母細胞，充分混合後轉入注射器
步驟5：固定化酵母細胞。以恆定的速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到配製好的氯化鈣(CaCl2)溶液中形成凝膠珠，讓凝膠珠在氯化鈣(CaCl2)溶液中浸泡30分鍾。
步驟6：固定化酵母細胞(凝膠珠)用蒸餾水沖洗2～3次。
步驟7：將適量的凝膠珠放人500mL錐形瓶中，加300mL已消毒的麥芽汁，封口於25℃下發酵。
仔細閱讀上述過程，回答下列問題：
(1)步驟6用蒸餾水沖洗2～3次的目的是：洗去雜質(氯化鈣)和雜菌，防止污染。
(2)發酵產物酒精可用重鉻酸鉀進行檢驗，但需在酸性性條件下才呈現灰綠色。
(3)如何檢驗凝膠珠的質量是否合格？（方法一是用鑷子夾起一個凝膠珠放在實驗桌上用手擠壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠的製作成功。方法二是在實驗桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也能表明制備的凝膠珠是成功的。）
考點二、生物技術在食品加工中的應用：發酵食品加工的基本方法
一、發酵： 廣義：是通過微生物的培養來大量生產各種代謝產物的過程。包括有氧發酵（如醋酸發酵、谷氨酸發酵）和無氧發酵（如酒精發酵）。 狹義：是指微生物的無氧呼吸（包括酒精發酵、乳酸發酵等）。 所以：發酵≠無氧呼吸。
應用： 釀酒、發饅頭、麵包製作、酒精製造、生產葯用酵母片、生產維生素、生產抗菌素等。
二、果酒製作的原理：菌種：酵母菌，單細胞真核生物，異養兼性厭氧型，適宜條件下出芽生殖1、酵母菌的兼性厭氧生活方式：在有氧條件下，有氧呼吸，大量繁殖（無性的出芽生殖）。在無氧條件下，酒精發酵。 繁殖的最適溫度：20℃； 酒精發酵的最適溫度：18~25℃。
在缺氧、20℃左右（一般將溫度控制在18～25℃，最適為20℃）、呈酸性的發酵液中，酵母菌可繁殖並進行酒精發酵。而絕大多數其它微生物都因無法適應這一環境而受到抑制。2、溫度對發酵的影響：酵母菌只能在一定溫度下生活。溫度低於10℃，酵母菌發育很緩慢。隨著溫度的升高，繁殖速度加快，20℃時為最佳繁殖溫度，此時酵母菌生殖速度快、生活力強。超過35℃，酵母菌生長受到抑制，繁殖速度迅速下降，到40℃酵母菌停止出芽，開始出現死亡。如果想要獲得高酒精濃度的發酵液、減少究竟的損耗，必須控制好發酵溫度。
3、防止發酵液被污染的措施：榨汁機要洗凈並晾乾、發酵瓶要洗凈並用70%的酒精消毒、裝入葡萄汁後要密封
4、葡萄酒呈紅色的原因：在發酵的過程中，隨著酒精度的提高，紅葡萄皮的色素也進入發酵液，使葡萄酒呈紅色。
三、果醋製作的原理：菌種：醋酸菌，原核生物，異養需氧型，二分裂生殖1、酒變醋的原理：當氧氣、糖源都充足時，醋酸菌將葡萄汁中的糖分解成醋酸；當缺少糖源時，醋酸菌將乙醇變為乙醛，再將乙醛變為醋酸。C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O （發酵條件：溫度適宜、適時通氣、控製糖源供應）2、控制發酵條件的作用：①醋酸菌對氧氣的含量特別敏感，當進行深層發酵時，即使只是短時間中斷通入氧氣，也會引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最適生長溫度為30～35℃，控制好發酵溫度，使發酵時間縮短，又減少雜菌污染的機會。3、醋酸菌的來源：菌種可以到當地生產食醋的工廠或菌種保藏中心購買。也可以從食醋中分離醋酸菌。 果酒果醋的製作流程：挑選葡萄→沖洗→榨汁→酒精發酵→果酒（→醋酸發酵→果醋）四、腐乳製作的原理：菌種：毛霉，真核生物，異養需氧，孢子生殖
1、多種微生物參與了豆腐的發酵，如青黴、酵母、麴黴、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一種絲狀真菌。毛霉等微生物產生的蛋白酶能將豆腐中的蛋白質分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可將脂肪水解為甘油和脂肪酸。2、腐乳製作的實驗流程：讓豆腐上長出毛霉→加鹽腌制→加鹵湯裝瓶→密封腌制（1）毛霉的生長：將豆腐塊平放在籠屜內，將籠屜中的控制在15～18℃，並保持一定的溫度。約48小時後，毛霉開始生長，3天後菌絲生長旺盛，5天後豆腐塊表面布滿菌絲。豆腐塊上生長的毛霉來自空氣中的毛霉孢子，而現代的腐乳生產是在嚴格無菌的條件下，將優良毛黴菌種直接接種在豆腐上，這樣可以避免其他菌種的污染，保證產品的質量。（2）加鹽腌制：將長滿毛霉的豆腐塊分層整齊地擺放在瓶中，同時逐層加鹽，隨著層數的加高而增加鹽量，接近瓶口表面的鹽要鋪厚一些。加鹽腌制的時間約為8天左右。加鹽可以析出豆腐中的水分，使豆腐塊變硬，在後期的製作過程中不會過早酥爛。同時，鹽能抑制微生物的生長，避免豆腐塊腐敗變質。（3）配製鹵湯：鹵湯直接關繫到腐乳的色、香、味。鹵湯是由酒及各種香辛料配製而成的。鹵湯中酒的含量一般控制在12%左右。加酒可以抑制微生物的生長，同時能使腐乳具有獨特的香味。香辛料可以調制腐乳的風味，也具有防腐殺菌的作用。3、實驗注意事項（1）控制好材料的用量：①用鹽腌制時，注意控制鹽的用量，鹽的濃度過低，不足以抑制微生物的生長，可能導致豆腐腐敗變質；鹽的濃度過高會影響腐乳的口味。②鹵湯中酒的含量應控制在12%左右，酒精含量越高，對蛋白酶的抑製作用也越大，使腐乳成熟期延長；酒精含量過低，不足以抑制微生物的生長，蛋白酶的活性高，加快蛋白質的水解，雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難以成塊。③所用豆腐含水量在70%左右，含水量過高不易成形。
（2）防止雜菌污染：①用來腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干凈後要用沸水消毒。②裝瓶時，操作要迅速小心。整齊地擺放好豆腐、加入鹵湯後，要用膠條將瓶口密封。封瓶時，最好將瓶口通過酒精燈的火焰，防止瓶口被污染。③越接近瓶口，雜菌污染的可能性越大，因此要隨著豆腐層數的加高加鹽量要增加，接近瓶品表面的鹽要鋪的厚一些。
考點三、生物技術在其他方面的應用：蛋白質的提取和分離
一、蛋白質的提取和分離的基本原理和方法
1、實驗原理：蛋白質的物化理性質：形狀、大小、電荷性質和多少、溶解度、吸附性質、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質。2、凝膠色譜法（分配色譜法）：（1）原理：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內部，路程長，流動慢。（2）凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。（3）分離過程： 混合物上柱→洗脫→大分子流動快、小分子流動慢→收集大分子→收集小分子(洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質分子的差速流動。)（4）作用： 分離蛋白質，測定生物大分子分子量，蛋白質的脫鹽等。3．緩沖溶液：（1）原理：由弱酸和相應的強鹼弱酸鹽組成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），調節酸和鹽的用量，可配製不同pH的緩沖液。（2）作用：抵制外界酸、鹼對溶液pH的干擾而保持pH穩定。4．凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質的帶電性質、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同。（2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯醯胺凝膠電泳等。（3）分離過程：在一定pH下，使蛋白質基團帶上正電或負電；加入帶負電荷多的SDS，形成「蛋白質－SDS復合物」，使蛋白質遷移速率僅取決於分子大小。
二、蛋白質的提取和分離的實驗步驟：
1、樣品處理 ①紅細胞的洗滌：洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，採集的血樣要及時採用低速短時間離心分離紅細胞，然後用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時間離心，如此重復洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。②血紅蛋白的釋放 ：在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。（註：加入蒸餾水後紅細胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細胞膜，有利於血紅蛋白的釋放和分離。）2、粗分離 ①分離血紅蛋白溶液：將攪拌好的混合溶液離心後，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質的沉澱層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質的暗紅色沉澱物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉澱層，於分液漏斗中靜置片刻後，分出下層的紅色透明液體。②透析：取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質，或用於更換樣品的緩沖液。3、純化：4、純度鑒定：SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳
三、注意事項1、電泳技術：電泳技術就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的。2、紅細胞的洗滌：如果分層不明顯，可能是洗滌次數少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉澱，也得不到純凈的紅細胞，影響後續血紅蛋白的提取純度。3．如何檢測凝膠色譜柱的裝填是否成功：由於凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。4．為什麼凝膠的裝填要緊密、均勻？如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內形成無效的空隙，使本該進入凝膠內部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。5．沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的：不但節約時間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內的空氣。6．G-75：「G」代表凝膠的交聯程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5g。7．裝填完後，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密8．加入檸檬酸鈉有何目的？為什麼要低速、短時離心？為什麼要緩慢攪拌？防止血液凝固；防止白細胞沉澱；防止紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。9．與其他真核細胞相比，紅細胞的特點及這一特點對進行蛋白質的分離的意義：哺乳動物及人的成熟的紅細胞是雙面凹圓餅狀，沒有細胞核和細胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什麼時候應該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。10．如何檢測血紅蛋白的分離是否成功：如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關