hplc多肽分析方法

❶ 跪求實驗方案急。關於植物小分子多肽的提取分離和分析 最好用到高效液相提取 分析的

多肽類化合物廣泛存在於自然界中，其中對具有一定生物活性的多肽的研究，一直是葯物開發的一個主要方向。生物體內已知的活性多肽主要是從內分泌腺組織器官、分泌細胞和體液中產生或獲得的，生命活動中的細胞分化、神經激素遞質調節、腫瘤病變、免疫調節等均與活性多肽密切相關。隨著現代科技的飛速發展，從天然產物中獲得肽類物質的手段也不斷得到提高。一些新方法、新思路的應用。不斷有新的肽類物質被發現應用於防病治病之中。本文介紹了近幾年肽類物質分離、分析的主要方法研究進展。
1 分離方法
採取何種分離純化方法要由所提取的組織材料、所要提取物質的性質決定。對蛋白質、多肽提取分離常用的方法包括：鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉澱法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到一起對特定的物質進行分離純化，同時上述這些方法也是蛋白、多肽類物質分析中常用的手段，如層析、叫泳等。
1.1 高效液相色譜（HPLC）
HPLC的出現為肽類物質的分離提供了有利的方法手段，因為蛋白質、多肽的HPLC應用與其它化合物相比，在適宜的色譜條件下不僅可以在短時間內完成分離目的，更重要的是HPLC能在制備規模上生產具有生物活性的多肽。因此在尋找多肽類物質分離制備的最佳條件上，不少學者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類、如何分析測定都是目前研究的內容。
1．1．1 反相高效液相色譜（RP-HPLC）
結果與保留值之間的關系：利用RP-HPLC分離多肽首先得確定不同結構的多肽在柱上的保留情況。為了獲得一系列的保留系數，Wilce等利用多線性回歸方法對2106種肽的保留性質與結構進行分析，得出了不同氨基酸組成對保留系數影響的關系，其中極性氨基酸殘基在2～20氨基酸組成的肽中，可減少在柱上的保留時間；在10～60氨基酸組成的肽中，非極性氨基酸較多也可減少在柱上的保留時間，而含5～25個氨基酸的小肽中，非極性氨基酸增加可延長在柱上的保留時間。同時有不少文獻報道了肽鏈長度、氨基酸組成、溫度等條件對保留情況的影響，並利用計算機處理分析得到每種多肽的分離提取的最佳條件。
肽圖分析（Peptide Mapping）：肽圖分析是根據蛋白質、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點，使用專一性較強的蛋白水解酶[一般未肽鏈內切酶（endopeptidase）]作用於特殊的肽鏈位點將多肽裂解成小片斷，通過一定的分離檢測手段形成特徵性指紋圖譜，肽圖分析對多肽結構研究合特性鑒別具有重要意義。利用胰蛋白酶能特意性作用於Arg和Lys羧基端的肽鏈的性質，通過RP-HPLC法採用C18柱檢測了重組人生長激素特徵性胰肽圖譜。同時胰島素的肽圖經V8酶專一裂解也製得，並可鑒別僅相差一個氨基酸殘疾的不同種屬來源的胰島素。人類腫瘤壞死因子的單克隆抗體結構也應用酶解法及在線分析技術確定了肽圖，便於鑒定分析。此項技術已經在新葯開發中得到廣泛應用。
1.1.2 疏水作用色譜（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）
HIC是利用多肽中含有疏水基因，可與固定相之間產生疏水作用而達到分離分析的目的，其比RP-GPLC具有較少使多肽變性的特點。利用GIC分離生產激素（GH）產品的結構與活性比EP-GPLC分離的要穩定，活性較穩定。Geng等利用HIC柱的低變性特點，將大腸桿菌表達出的經鹽酸胍乙啶變性得到人重組干擾素-γ。通過HIC柱純化、折疊出高生物活性的產品。不同人尿表皮生長因子（EGF）也利用HIC純化到了，均具有良好的生物活性。HIC可將未經離子交換柱的樣品純化。而RP-HPLC則不能達到這一要求。
1.1.3 分子排阻色譜（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）
SEC是利用多肽分子大小、形狀差異來分離純化多肽物質，特別對一些較大的聚集態的分子更為方便，如人重組生長激素（hgH）的分離，不同結構、構型的GH在SEC柱上分離行為完全不同，從而可分離不同構型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體，利用SEC研究修飾化的PEG的分離方法，此PEC具有半衰期長、作用強的特點。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。
1．1．4離子交換色譜（Iron-Exchange chromatography,IEXC）
IEXC可在中性條件下，利用多肽的帶電性不同分離純化具有生物活性的多肽。其可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類，還有一些新型樹脂，如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。在多肽類物質的分離分析研究中，對多肽的性質、洗脫劑、洗脫條件的研究較多，不同的多肽分離條件有所不同，特別是洗脫劑的離子強度、鹽濃度等對純化影響較大。Wu等報道利用離子交換柱層析法，探討分離牛碳酸酐異構體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件，獲得了有價值的數據供今後此類物質分離研究。
1．1．5膜蛋白色譜（Chromatography of Membrane Protein,CMP）
CMP+分離強蔬水性蛋白、多肽混合物的層析系統，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白後形成SDS-融膜蛋白，並由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團（P-端），又具有陽離子鈣（C-端），與固定相結合主要決定於膜蛋白的大小、SDS結合量有關。利用原子散射法研究cAMP的分離機制發現，樣品與SDS結合後在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達到分級分離的目的。
1．1．6高效置換色譜（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）
HPDC是利用小分子高效置換劑來交換色譜柱上的樣品，從而達到分離的目的。它具有分離組分含量較少成分的特性。利用HPDC鑒定分離了低於總量1%組分的活性人重組生長激素（rHG ）。在研究非毒性交換劑時Jayarama發現硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是對β乳球蛋白A和B的良好置換劑，一般DS的相對分子質量為1×104和4×104最宜。研究表明置換劑的相對分子質量越低，越易於與固定相結合，因此在分離相對分子質量小的多肽時，需要更小的置換劑才能將其置換純化出來。
1.1.7 灌注層析（Perfusion Chromatography，PC）
PC是一種基於分子篩原理與高速流動的流動相的層析分離方法，固定相孔徑大小及流動相速度直接影響分離效果。試驗證明其在生產、制備過程中具有低投入、高產出的特性。目前市場上可供應的PC固定相種類較多，適合於不同分子量的多肽分離使用。
1.2 親和層析（Affinity Chromatography，AC）
AC是利用連接在固定相基質上的配基與可以和其特異性產生作用的配體之間的特異親和性而分離物質的層析方法。自1968年Cuatrecasas提出親和層析概念以來，在尋找特異親和作用物質上發現了許多組合，如抗原-抗體、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸與其互補鏈等等。對多肽類物質分離目前主要應用其單抗或生物模擬配基與其親和，這些配基由天然的，也有根據其結構人工合成的。Patel等人利用一系列親和柱分離純化到了組織血漿纖維蛋白酶原激活劑蛋白多肽。
固定金屬親和層析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年來發展起來的一種親和方法。其固定相基質上鰲合了一些金屬離子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通過配為鍵鰲合側鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特別是肽序列中含有His-X-X-X-His的結構最易結合到金屬離子親和柱上，純化效果較好。其中胰島素樣生長因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氫葉還原酶融合蛋白等均用此方法分離到純度較高的產品。
Chaiken等人報道了另一種親和層析方法，利用反義DNA表達產生，其與正鏈DNA表達產生的肽或蛋白具有一定的親和性，如Arg加壓素受體復合物，已用此法分離得到。DNA與蛋白、多肽復合物之間的作用也是生物親和中常用的方法。將人工合成的寡核苷酸結合在固定相基質上，將樣品蛋白或多肽從柱中流過，與之結合可達到分離特定結構多肽的目的。
1.3 毛細管電泳（Capillary electrophoresis，CE）--分離分析方法
CE是在傳統的電泳技術基礎上於本世紀60年代末由Hjerten發明的，其利用小的毛細管代替傳統的大電泳槽，使電泳效率提高了幾十倍。此技術從80年代以來發展迅速，是生物化學分析工作者與生化學家分離、定性多肽與蛋白類物質的有利工具。CE根據應用原理不同可分為以下幾種；毛細管區帶電泳Capillary Zone electrophoresis，CZE）、毛細管等電聚焦電泳（Capillary Isoeletric Focusing，CIEF）毛細管凝膠電泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）和膠束電動毛細管層析（Micellar Electokinetic Electrophoresis Chromatorgraphy,MECC）等。
1.3.1 毛細管區帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）
CZE分離多肽類物質主要是依據不同組分中的化合物所帶電性決定，比傳統凝膠電泳更准確。目前存在於CZE分離分析多肽物質的主要問題是天然蛋白或肽易與毛細管硅膠柱上的硅醇發生反應，影響峰形與電泳時間，針對這些問題不少學者做了大量實驗進行改進，如調節電池泳液的PH值，使與硅醇反應的極性基團減少；改進毛細管柱材料的組成，針對多肽性質的不同採取不同的CZE方法研究分離5個含9個氨基酸殘基的小肽，確定了小肽分析的基本條件，即在低PH條件下，緩沖液中含有一定濃度的金屬離子如Zn2+等，此時分離速度快而且准確。
1．3．2細管等電聚電泳（Capillary Isleletric Focusing,CIEF）
由於不同的蛋白、多肽的等電點（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的電泳槽中，其可在等電點pH條件下聚集沉澱下來，而與其他肽類分離開來。CIEF在分離、分析混合多肽物質中應用不多，主要應用與不同來源的多肽異構體之間的分離，如對rHG不同異構體分離。由於在CIEF柱表面覆蓋物的不穩定性限制了此法的廣泛應用。
1．3. 3毛細管凝膠電泳 (Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
CGE是基於分子篩原理，經十二烷基磺酸鈉（SDS）處理的蛋白或多肽在電泳過程中主要靠分子形狀、分子量不同而分離。目前，又有一種非交聯歡、線性、疏水多聚凝膠柱被用於多肽物質的分離分析，此電泳法適於含疏水側鏈較多的肽分離，這種凝膠易於灌注，使用壽命長，性質較為穩定。
1．3．4膠束電動毛細管層析（Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC）
MECC的原理是在電泳液中加入表面活性劑，如SDS，使一些中性分子帶相同電荷分子得以分離。特別對一些小分子肽，陰離子、陽離子表面活性劑的應用都可使之形成帶有一定電荷的膠束，從而得到很好的分離效果。有文獻報道在電解液中加入環糊精等物質，可使用權含疏水結構組分的多肽選擇性與環糊精的環孔作用，從而利用疏水作用使多肽得到分離。
1．4多肽蛋白質分離工程的系統應用
以上提到的分離多肽的技術在實際應用過程中多相互結合，根據分離多肽性質的不同，採用不同的分離手段。特別是後基因組時代，對於蛋白質組深入的研究，人們對於分離多肽及蛋白質的手段不斷改進，綜合利用了蛋白質和多肽的各種性質，採用包括前面提到的常規蛋白多肽提取方法，同時利用了高效液相色譜，毛細管電泳，2-D電泳等手段分離得到細胞或組織中盡可能多的蛋白多肽。在蛋白質組學研究中系統應用蛋白和多肽分離鑒定的技術在此研究中即是分離手段也是分析方法之一。特別是以下提到的質譜技術的發展，大大的提高了蛋白多肽類物質的分析鑒定的效率。
2 分析方法
2．1 質譜分析（Mass Spectrometry, MS）
MS在蛋白、多肽分析中已經得到了廣泛應用，特別是在分離純化後的在線分析中，MS的高敏性、快速性特別適合多肽物質分析鑒定。其中連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）和電霧離子化質譜（Electrospray Ionization, EIS）是近幾年發展起來的新方法。
2．1．1連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）
cf-FAB是一種弱離子化技術，可將肽類或小分子量蛋白離子化成MH+或（M-H）形式。主要應用於肽類的分離檢測，其具有中等解析度，精確度大於+0.2amu，流速一般在0.5-1.5μl·Ml-1。在測定使流動相需加0.5%-10%基質如甘油和高有機溶劑成分，使樣品在檢測探針處達到敏感化。cf-FAB常與HPLC、CEZ等方法結合使用達分離分析的目的，許多多肽的cf-FAB分析方法已經建立，並得到很好的應用。如Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。證明L-Pro在保持小肽構相穩定性。連接分子方面具有重要意義。
2.1.2 電霧離子化質譜（Electrospray Ionozation，EIS）
EIS可產生多價離子化的蛋白或多肽，允許相對分子質量達1×105蛋白進行分析，解析度在1500-2000amu。精確度在0.01%左右。EIS更適合相對分子質量大的蛋白質的在線分析，且需要氣化或有機溶劑使樣品敏感化。利用EIS與HPLC聯合分離分析GH和血紅蛋白均獲成功，其也可與CEZ聯合應用。
2.1.3 基質輔助激光解析/離子化-飛行時間質譜（Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtry，MALDI-TOF MS）
MALDI-TOF是目前蛋白質鑒定中精確測定測定分子質量的手段，特別適合對混合蛋白多肽類物質的相對分子質量的測定，靈敏度和解析度均較高。它是目前蛋白質組學研究的必備工具。同時結合液相色譜的聯用技術可以高效率的鑒定多肽物質。特別是當各種原理的質譜技術串聯應用時，不但可以得到多肽的相對分子質量信息，還可以測定它的序列結構，此項技術將在未來蛋白質組學研究中起到決定性作用。
2.2 核磁共振(Nuclear Magnetic resonance，NMR)
NMR因圖譜信號的純數字化、過度的重疊范圍過寬（由於相對分子質量太大）核信號弱等原因，在蛋白、多肽物質的分析中應用一直不多。隨著二維、三維以及四維NMR的應用，分子生物學、計算機處理技術的發展，使NMR逐漸成為此類物質分析的主要方法之一。NMR可用於確定氨基酸序列、定量混合物中的各組分組成含量等分析中。但要應用於蛋白質分析中仍有許多問題需要解決，例如，如何使分子量大的蛋白質有特定的形狀而便於定量與定性分析，如何減少數據處理的時間問題等。這些問題多有不少學者在進行研究。雖然在蛋白質分析中應用較少，NMR在分析分子中含少於30個氨基酸的小肽時是非常有用的，可以克服上述蛋白質分析中的缺點而達到快速准確分析的目的。
2.3 其他
除上述方法之外，氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、場解析質譜、IR、UV光譜、CD、圓而色譜、生物鑒定法、放射性同位素標記法及免疫學方法等都已應用於多肽類物質的結果鑒定、分析檢測之中。
以上簡要的介紹了近幾年多肽物質分離、分析的常用方法及最新研究方向。隨著科學技術水平的不斷發展，會有許多更新的分離分析手段不斷涌現，因此這一領域的研究具有廣闊的前景。 應用SDS-PAGE顯示小分子多肽
SDS-PAGE在分離、鑒定和純化蛋白質方面有著廣泛應用，其有效分離范圍取決於聚丙烯醯胺的濃度和交聯度，其孔徑隨著雙丙烯醯胺與丙烯醯胺比率的增加而減小，比率接近於1：20時，孔徑達到最小值。分子量低於10kD的小分子肽類，即使用較高濃度的聚丙烯醯胺凝膠的SDS-PAGE也不能完全分離，或是顯不出色，或是顯帶較弱，帶型彌散。且分子量越小，效果也越差。
為了能在SDS-PAGE上顯示測定小分子量的多肽，通常採取兩種方法：一是增加凝膠的濃度和交聯度，在制膠時加入一些可以降低聚丙烯醯胺凝膠網限孔徑的溶質分子，使用尿素、甘油或蔗糖等物質；二是選擇緩沖液中的拖尾離子的種類和濃度以達到改善多肽的分離效果。
操作步驟
1．電泳緩沖液的配製如下表所示
緩沖液Tris
(mol/L)Tricine
(mol/L)pHSDS
(%)
陽極緩沖液
陰極緩沖液
膠緩沖液0.2
0.1
3.0—
0.1
—8.9*
8.25**
8.4*—
0.1
0.3
* 用HCl調pH
** pH約為8.25

2．丙烯醯胺貯存液的配製
單丙-雙丙混合物單丙的百分數雙丙的百分數
49.5% T, 3%C
49.5% T, 6%C48
46.51.5
3.0
T：丙烯醯胺的總濃度
C：交聯度

3．膠的制備，與一般SDS-PAGE相似，按下表配製分離膠和濃縮膠
組 份分離膠
16% T，6%C濃縮膠
6% T，3%C
49.5% T, 3%C丙烯醯胺溶液（ml）
49.5% T, 6%C 丙烯醯胺溶液（ml）
膠緩沖液（ml）
脲（g）[甘油（ml）]
水（ml）
10%過硫酸銨（μl）
TEMED（μl）
總體積（ml）—
3.3
3.3
3.6[2.4]
1
40
4.0
10.040.48
—
1.00
—
1.50
25
2.5
3.03
4．樣品緩沖液
4% SDS
12%甘油
50mmol/L Tris
2%巰基乙醇
0.01% Serva blue
多肽樣品與樣品緩沖液混合沸煮2min（或40℃溫浴30min）。
5．將灌膠的玻璃板固定在電泳裝置上，用1%瓊脂糖封邊，倒入陰極緩沖液，依次加樣。
6．將電泳裝置放入電泳槽內，倒入陽極緩沖液，將正負極與電泳儀相接，恆電壓50~60V，待指示劑進入分離膠後，電壓可升至70~90V，恆壓約3h待指示劑走出凝膠下緣停止電泳。
7．染色、脫色及膠的保存同SDS-PAGE。

❷ HPLC原理是什麼

原理：

儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內，由於樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別。

被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據就可以以圖譜形式列印出來，以便研究人員分析。

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高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）又稱「高壓液相色譜」、「高速液相色譜」、「高分離度液相色譜」、「近代柱色譜」等。

①高壓：流動相為液體，流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。

②高速：分析速度快、載液流速快，較經典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鍾，有些樣品甚至在5分鍾內即可完成，一般小於1小時。

③高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

④高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在μL數量級。

⑤應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物的分離分析，顯示出優勢。

⑥柱子可反復使用：用一根柱子可分離不同化合物

⑦樣品量少、容易回收：樣品經過色譜柱後不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

此外高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。

高效液相色譜的缺點是有「柱外效應」。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

HPLC使用的色譜柱是很細的(1~6 mm)，所用固定相的粒度也非常小（幾μm到幾十μm)，所以流動相在柱中流動受到的阻力很大，在常壓下，流動相流速十分緩慢，柱效低且費時。

為了達到快速、高效分離，必須給流動相施加很大的壓力，以加快其在柱中的流動速度。為此，須用高壓泵進行高壓輸液。高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。HPLC使用的高壓泵應滿足下列條件：

a. 流量恆定，無脈動，並有較大的調節范圍（一般為1~10 mL/min)；

b. 能抗溶劑腐蝕；

c. 有較高的輸液壓力；對一般分離，60×10^5Pa的壓力就滿足了，對高效分離，要求達到150~300×10^5Pa。

⑴往復式柱塞泵

當柱塞推入缸體時，泵頭出口（上部）的單向閥打開，同時，流動相進入的單向閥（下部）關閉，這時就輸出少量的流體。

反之，當柱塞向外拉時，流動相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時關閉，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。這種泵的特點是不受整個色譜體系中其餘部分阻力稍有變化的影響，連續供給恆定體積的流動相。

⑵氣動放大泵

其工作原理是：壓力為 p1 的低壓氣體推動大面積（ SA ）活塞A ，則在小面積（ SB ）活塞 B 輸出壓力增大至 p2 的液體。壓力增大的倍數取決於 A 和 B 兩活塞的面積比，如果 A 與 B 的面積之比為 50 : 1 ，則壓力為 5 × Pa 的氣體就可得到壓力為 250×Pa 的輸出液體。這是一種恆壓泵。

❸ 請問HPLC是做什麼的原理操作方法

HPLC是高效液相色譜，英文全稱是High Performance Liquid Chromatography。該方法在化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中被用來做重要的分離分析技術。

用途：高效液相色譜更適宜於分離、分析高沸點、熱穩定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質，因而廣泛應用於核酸、肽類、內酯、稠環芳烴、高聚物、葯物、人體代謝產物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲劑、除莠劑的分析等物質的分析。

原理：高效液相色譜以液體為流動相，採用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離後，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析和分離。

操作方法：如下圖所示，溶劑貯器中的流動相被泵吸入，經梯度控制器按一定的梯度進行混合然後輸出，經測其壓力和流量，導入進樣閥（器）經保護柱、分離柱後到檢測器檢測，由數據處理設備處理數據或記錄儀記錄色譜圖，餾分收集器收集餾分，廢液瓶收集廢液。

(3)hplc多肽分析方法擴展閱讀：

液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，於60年代後期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。

HPLC根據固定相和流動相的成分分為正相色譜和反向色譜。

正相色譜法

採用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。

反相色譜法

一般用非極性固定相（如C18、C8)；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用於分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。

參考資料：網路-高效液相色譜

❹ 多肽和蛋白質類葯物的分析方法

1.1生物檢定法
由於蛋白多肽類葯物多為有生物活性的物質,且生物活性不僅取決於葯物的一級結構，與二 、三級結構亦密切相關，故生物檢定法是研究該類葯物動力學獨特而必需的方法。生物檢定 法 有兩個目的，直接測定體液中葯物濃度及鑒定標記葯物的生物活性。其方法主要可分為兩大 類。
1.1.1在體分析常規的有胰島素的小鼠血糖法等，另外還有根據各 類蛋白多肽的生物活性 不同而建立的各異的方法，如根據IL-8可將大量中性粒細胞從骨中動員出的性質[1] 而建立 的IL-8動員中性粒細胞家兔體內實驗。這類方法最直觀地反映生物活性，但涉及整體動物 ，費時費力，靈敏度不高，變異較大。
1.1.2離體組織（細胞）分析如NGF刺激雞背根神經節增長，縮宮素 的大鼠離體子宮法等。 隨著分子生物學的發展，許多特異性強，靈敏度高的依賴細胞株被建立，細胞培養已是最常 用的方法。根據蛋白多肽與細胞相互作用的機理不同，具體的操作亦有多種。如細胞增殖法 （Proliferation assays）,快速靈敏,但特異性稍差; 抑制增殖法(Antiproliferation as s ays),檢測系統簡單,靈敏而專一; 減少細胞損傷法(Cytopathic effect rection assays ) [2],則是依據具有抗病毒活性的葯物如干擾素，保護細胞不受病毒損傷, 方法直觀 靈敏, 但 可能會受到多肽亞型的干擾。以上的方法都是以細胞數目的增減為量效指標，計數方法有直 接計數法和間接計數法，後者包括MTT法，同位素（3H,14C）摻入法 等。此外，還有根據蛋 白多肽與細胞間接作用進行檢測，如與免疫檢測聯用的抗體誘導法[3]，結合酶反 應的酶誘 導分解法[4]等。總的說來，細胞培養法多具有靈敏特異，客觀可靠的優點，但其 不足也顯 而易見。首先，生物檢定法無法定量失去活性的小代謝物，無法示蹤它們的體內動態；其次 ，樣品多存在於人或動物血清中，血清中內源物質的干擾以及可能存在的內源因子的交叉反 應，影響了方法的專屬性；再者，啟動生物過程常需閾量細胞因子從而降低了方法的靈敏度 ；依賴株細胞長期培養易發生變異而影響檢測的特異性。
1.2免疫學方法
免疫學方法是利用蛋白多肽葯物抗原決定簇部位的單克隆或多克隆抗體特異地識別被檢葯物 ，再以放射計數，比色等方法予以定量，即將特異的抗原抗體反應配以靈敏檢測的方法。常 用的方法有三種。
1.2.1放射免疫法（Radioimmunoassays RIA）該法是被測葯物（Ag ）,標記葯物（多為125I-Ag）與抗體（Ab）的競爭性結合反應，方法的特異性 取決於抗原抗體的親和力及標記葯 物的純度，與生物檢定法相比，有簡明，易於控制的優點。
1.2.2免疫放射定量法（Immunoradiometrec assays IRMA）該法中 被測葯物依然是Ag，它 先與固定相上的Ab形成Ab∶Ag復合物，再與標記抗體125I-Ab結合，形成Ab∶Ag ∶125I-Ab夾心 狀。由於Ag需有兩個Ab來識別，這就大大增加了方法的特異性，是一靈敏而低變異的方法， 只是對標記抗體的純度要求很高。
1.2.3酶聯免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA）ELISA的原理與IRMA相 似，只是第二個抗體不是用碘標，而是用可以與底物發生顯色反應的酶如HRP來標記，與上 述兩法相比，ELISA具有使用壽命長，重復性好，無輻射源的優點，並且已有不少實驗證明 ，它與生物檢定法具有一定的量效關系[4]及相關性[5]，提示它可部分地 反映葯物的生物活性。
免疫學方法的缺點在於它測定的是蛋白多肽的免疫活性而不是生物活性；不能同時測定代謝 物，且具有抗原決定簇的代謝片段可能增加結果誤差；不同來源的抗體與相同的蛋白多肽反 應可能有較大的差別；還可能受到內源物質的干擾。但免疫法畢竟是一種迅速，靈敏，適於批處理的方法，已有數十種蛋白多肽被開發成能滿足葯物動力學研究的商品葯盒。臨床 葯動學領域，免疫法已逐漸取代生物檢定法。
1.3同位素標記示蹤法
放射性同位素標記技術是研究蛋白多肽在生物體內處置的一種最常用的方法。所使用的同位 素有125I, 99mTc, 3H,14C, 35S 等，其中125I因比放射性高，半衰期適宜，標記制備簡單 而最為常用。標記方法有兩種，一是內標法，即把含有同位素的氨基酸加入生長細胞或合成 體系，該法對生物活性地影響可能較小，但由於制備復雜而限制了其廣泛應用；二是外標法 ，常用化學方法如氯胺T或Iodogen法將125I連接於大分子上，因相對簡單而被首 選。
同位素法具有簡便直觀，檢測迅速的優點，尤其適用於蛋白多肽葯物的組織分布研究，但其 缺點亦顯而易見。首先，它不能進行人體葯物動力學研究；其次，同位素標記後是否會引起 葯物的生物活性及其在生物體內的代謝行為發生變化，一直存在爭議．前者可通過調整反應 條件和生物檢定法加以改善和驗證，基本上可使生物活性無明顯變化；後者因葯而異則復雜 的多，已有報道認為[6]，放射性標記法可干擾表皮生長因子與細胞的相互作用， 從而導致 其體內清除的紊亂；最後，由於蛋白多肽進入體內會被降解代謝，或與其它蛋白質結合，總 的放射性不能代表葯物動力學過程，因此如何鑒別樣品的原葯，降解物及結合物是該法中需 解決的關鍵問題，常用的方法有兩種。
1.3.1SDS-PAGE法根據葯物Mr的大小選擇不同濃度的凝膠電 泳，通過控制電流等條件使得原 葯與其它產物分開，然後通過切割膠條放射計數或放射自顯影的方法，來檢測電泳放射性圖 譜。該法具有較高的解析度和靈敏度，但電泳過程中，125I-小肽和游離 125I可能擴散至空白凝膠或電解液中，從而使結果可能偏高。
1.3.2HPLC法高效反相色譜（RHPLC），高效排阻液相色譜（SEHPLC ）[7]，高效離子交換液相色 譜（IEHPLC）分別根據保留時間與蛋白多肽的疏水-親水性特徵，Mr大小，極性的 關系 來分離樣品中的物質。它們共同的優點是特異性高，解析度好，可同時測定原葯和降解物， 其中SEHPLC亦可得到結合物的信息，而RHPLC用於蛋白多肽的分離有獨特的優越性。但因受 注入樣品量的限制，靈敏度，重現性都受影響，且設備昂貴，成本較高。
1.3.3 HPLC-RAD法
高效液相偶聯同位素在線檢測系統。這種方法將HPLC的高度分析分離行為和同位素的高靈敏度檢測結合在一起。使得葯物的分析分離更加直觀和方便。特別在蛋白質多肽類葯物葯動學方面體現了其獨特的優點。
1.4色譜法
1.4.1HPLC在進行普通葯物動力學研究中，HPLC是技術成熟，應用廣 泛的分析手段。在蛋 白多肽葯物的實驗研究或產業化中，HPLC都是主要的分離純化工具。但鑒於蛋白多肽葯物結 構的特殊性，除了一些小分子多肽，如peptichemio[8]，加壓素的八肽拮抗劑（oc tapeptid e antagonist of vasopressin）[9]可分別直接或經選擇性柱反應後,單獨 用帶熒光檢測 器的HPLC進行葯動學研究外，HPLC常需進一步改進或與其它更靈敏的檢測技術聯用方能滿足 葯動學的需要。除了上述提及的與同位素的聯用，還有許多與免疫學方法的聯用，如Philli ps[10]採用免疫親和色譜技術分析人三種不同體液中粒細胞集落刺激因子的濃度； Partilla [11]等認為HPLC與RIA聯用可以檢測人體液中的神經肽。此外，令人矚目的還有液 /質在線聯用（LC-MS）。
LC-MS將高分離能力，適用范圍廣泛的色譜分離技術與高靈敏、專屬及通用,在研究蛋 白多肽的結構中具有重要價值的質譜法聯用起來，成為強有力的分離分析方法。多年來限制 LC-MS技術發展的決定因素是介面問題，由傳送帶介面（Moving-belt interface），熱噴 霧 介面（Thermospray），到最近的電噴霧離子化介面（Electrosptay ionization ESI），聯 用技術日趨成熟，尤其適用於生物樣品中低濃度（pg/ml）葯物及代謝物的測定[12] ，而蛋 白多肽類葯物恰有在體內代謝快，濃度低的特點。國外已將用LC-MS於該類葯物，葯物代 謝 物[13，14]的動力學研究，國內尚處於起步階段，除了儀器本身價格昂 貴，技術上亦存在 一些問題，如它對樣品的純度要求很高如何將葯物從生物體液，尤其是血漿中提取純化以 減少干擾；如何選擇合適的內標以減少系統誤差；在將LC-MS用於檢測體育禁用肽(HCG,HGH ,EPO,ACTH等)時發現，糖肽難用於質譜分析，因為在質譜條件下，同樣的氨基酸序列可產生 多種不同質量的多糖鏈，而每條鏈及整個分子都有可以產生質譜信號，這就大大降低了質譜 信號的專屬性。盡管LC-MS在蛋白多肽葯物的體內葯物代謝動力學研究中還存在一 定的難度，但其作為實用性強，前景好的領域已引起人們的廣泛關注。
1.4.2高效毛細管電泳（HPCE）HPCE是離子或荷電粒子以電場為驅動 力，在毛細管中按其 濃度和分配系數不同進行高效，快速分離的新技術，它以高解析度，高靈敏度，分析時間短 ，樣品量少及操作簡單等諸多優點而成為蛋白多肽生物分子分離分析的重要手段。在臨床 上 ，生物體液中低濃度蛋白多肽的分析面臨的問題有：蛋白多肽與毛細管壁的相互作用所引起 的遷移時間的改變，這可以通過塗層CE加以改善；由於毛細管很細，管內容積很小，進樣量 的不易控制給實驗的重復性帶來影響，而且很可能無法對低濃度的樣品提供足夠的靈敏度。 國外根據樣品的性質採用不同的預處理，大體上可分為非特異性和高親和性兩種， 將樣品加以濃縮，取得了滿意的效果[15]。HPCE在檢測上的迅速發展與HPLC已有並 駕齊驅之 勢，況且鑒於HPCE在樣品微量分析的優越性，已有人在葯物動力學研究、體內分析中，將微 透析連續采樣與之聯用[16]，這在整個葯動學研究中都不失為一有希望的方向。 2結語
由以上可知，現代科學技術的發展給蛋白多肽類葯物的研究提供了多樣的分析手段，但鑒於 該類葯物的特殊性，尚無一種方法能完全滿足動力學研究的要求。根據人用葯物注冊國 際協調會議（ICH）對生物葯物臨床前安全性評價「在科學基礎上的靈活性和具體情節個別 處理」的總則，人們通常將幾種方法聯合應用，互相補充，才能得到比較可靠的結果。