泛素化蛋白的研究方法

1. 泛素-蛋白酶體介導的蛋白質降解途徑

主要有四步：

1、泛素的活化：泛素甘氨酸端的羧基連接到泛素活化酶E1的巰基，這個需要以ATP作為能量，最終形成一個泛素和泛素活化酶E1之間的硫酯鍵。

2、E1將活化後的泛素通過交酯化過程交給泛素結合酶E2。

3、泛素連接酶E3將結合E2的泛素連接到目標蛋白質上並釋放E2，形成特定的泛素化的蛋白質。

4、泛素化的蛋白質被特定的蛋白酶體識別並結合，最終在蛋白酶的催化下蛋白質分解為短肽或氨基酸。

(1)泛素化蛋白的研究方法擴展閱讀：

泛素樣蛋白的來源：

泛素蛋白由76個氨基酸殘基組成的多肽，它可以被一系列的酶促反應活化，進而與底物靶蛋白相連接（如圖中箭頭所示）。UBL修飾系統採用的也是類似途徑。

有三種酶——E1、E2和E3——參與了泛素修飾反應，這包括多泛素蛋白合成反應，即在一個泛素蛋白的基礎之上再添加好幾個泛素蛋白。

E1酶負責活化泛素蛋白、E2酶通過轉硫醇作用從E1酶處獲得泛素蛋白，並將其與底物蛋白相結合，然後E3酶將泛素蛋白與底物連接（在某些情況下會先形成一種硫酯中間產物，然後再與底物結合）。

所有真核生物編碼的E2和E3同工酶種類非常多，其中E2同工酶有幾十種，而E3同工酶則多達數百種。這樣，細胞就能對多種蛋白進行各種方式、特異性的修飾和調節，而且這些修飾調控作用也都會受到嚴密的時空調控。

泛素蛋白的C末端通常都經由醯胺鍵（amide linkage）與靶蛋白的氨基團連接在一起。最常見的連接是與靶蛋白賴氨酸的ε氨基團相連，不過也可以與靶蛋白的N末端相連。此外，最近還發現泛素蛋白可以與靶蛋白上的半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸相連。

在多泛素鏈中，一個泛素蛋白分子的賴氨酸側鏈與另一個泛素蛋白的C末端相連，如此反復形成多泛素鏈。泛素蛋白含有7個賴氨酸殘基，所有這些賴氨酸殘基都可以參與上述多泛素鏈的合成過程。

2. 泛素化的過程

具體過程：泛素化修飾涉及泛素激活酶E1、泛素結合酶E2和泛素連接酶E3的一系列反應:首先在ATP(紅色所示)供能的情況下酶E1(蛋白質編號1r4n)粘附在泛素分子尾部(淡黃色所示)的Cys殘基上(綠色所示,注意在這個結構中,Cys突變為Ala)激活泛素,接著,E1將激活的泛素分子轉移到E2酶上(蛋白質編號1fxt),隨後,E2酶和一些種類不同的E3酶共同識別靶蛋白,對其進行泛素化修飾。根據E3與靶蛋白的相對比例可以將靶蛋白單泛素化修飾和多聚泛素化修飾。E3酶(蛋白質編號1ldk和1fqv)的外形就像一個夾子,靶蛋白連接在中間的空隙內(星號所示)。酶的左側結構域決定靶蛋白的特異性識別,右側結構域定位E2酶以轉移泛素分子。蛋白質泛素化的結果是使得被標記的蛋白質被蛋白酶分解為較小的多肽、氨基酸以及可以重復使用的泛素。 泛素-蛋白酶體途徑是先發現的，也是較普遍的一種內源蛋白降解方式。需要降解的蛋白先被泛素化修飾，然後被蛋白酶體降解。
不過後來又發現，並非所有泛素化修飾都會導致降解。有些泛素化會改變蛋白的活性，導致其他的生物效應，如DNA損傷修復，機體免疫應答等。 蛋白質泛素化作用是後翻譯修飾的一種常見形式，該過程能夠調節不同細胞途徑中各式各樣的蛋白質底物。通過一個三酶級聯（E1-E2-E3），蛋白質的泛素連接由E3泛素連接酶催化，這種酶是cullin-RING復合體超級家族的最佳代表。
在從酵母到人類的各級生物中都保守的DDB1-CUL4-ROC1復合體是最近確定出的cullin-RING泛素連接酶，這種酶調節DNA的修復、DNA復制和轉錄，它能被病毒所破壞。
由於缺少一個規則的SKP1類cullin連接器和一種確定的底物召集結構域，目前人們還不清楚DDB1-CUL4-ROC1 E3復合體如何被裝配起來以對各種蛋白質底物進行泛素化。
在這項新的研究中，DDB1-CUL4A-ROC1復合體被病毒劫持的形式進行了晶體結構分析。分析結果表明DDB1利用一個β-propeller結構域作為cullin骨架結合物，利用一種多變的、附著的獨立雙β-propeller折疊來進行底物的呈遞。
通過對人類的DDB1和CUL4A復合體進行聯系提純，然後進行質譜分析，研究人員確定出了一種新穎的WD40-repeat蛋白家族，這類蛋白直接與DDB1的雙propeller折疊結合並充當E3酶的底物募集模塊。這些結構和蛋白質組學研究結果揭示出了cullin-RING E3復合體的一個新家族的裝配和多功能型背後的結構機制和分子邏輯關系。 E1,E2,E3對底物的泛素化可形成幾種不同的泛素化底物。有的底物蛋白只能被單泛素化，如H2B；有的底物蛋白有多個賴氨酸殘基，在合適條件下會被多位點單泛素化；還有一些蛋白在單個賴氨酸位點會形成多聚泛素鏈，這種多聚泛素鏈可以根據連接泛素鏈的賴氨酸位點的不同可以分為單一、混合以及樹枝狀的結構。

3. 泛素化修飾是細胞生物學研究嗎

泛素化修飾是細胞生物學研究的范疇，是蛋白質修飾的一種類型，蛋白質的修飾有多種類型，除了常見的無機和有機小分子修飾，如磷酸化、糖基化、脂醯化等，還有一類用小肽進行修飾的，例如泛素化（ubiquitination），類泛素化NEDD化（neddylation）、ISGylation蘇木化（SUMOylation）等。而泛素-蛋白酶體系統則負責特異性地降解大多數細胞內蛋白（約占 80% 以上），是一種高效蛋白降解途徑。泛素化修飾還可以直接影響蛋白質的活性和定位，調控包括細胞周期、細胞凋亡、轉錄調控、DNA 損傷修復以及免疫應答等在內的多種細胞活動。

泛素-蛋白酶體系統組成

4. 蛋白質泛素化，急急急急急急急急急急急急！！！！！！！！！

急了還一分懸賞分也沒有？？？

.蛋白質泛素化
在最新一期的《自然》雜志上，來自華盛頓大學的華裔科研人員鄭寧（Ning Zheng）助理教授又發表了一篇有關泛素蛋白連接酶結構生物學的新文章。自2000年以來，鄭博士先後在Cell、Nature和Science等國際權威雜志上發表了多篇文章，並且有三篇文章成為雜志的封面故事進行推薦。
蛋白質泛素化作用是後翻譯修飾的一種常見形式，該過程能夠調節不同細胞途徑中各式各樣的蛋白質底物。通過一個三酶級聯（E1-E2-E3），蛋白質的泛酸連接又E3泛素連接酶催化，這種酶是cullin-RING復合體超級家族的最佳代表。
在從酵母到人類的各級生物中都保守的DDB1-CUL4-ROC1復合體是最近確定出的cullin-RING泛素連接酶，這種酶調節DNA的修復、DNA復制和轉錄，它能被病毒所破壞。

由於缺少一個規則的SKP1類cullin連接器和一種確定的底物召集結構域，目前人們還不清楚DDB1-CUL4-ROC1 E3復合體如何被裝配起來以對各種蛋白質底物進行泛素化。

在這項新的研究中，鄭博士等人對人類DDB1-CUL4A-ROC1復合體被病毒劫持的形式進行了晶體結構分析。分析結果表明DDB1利用一個β-propeller結構域作為cullin骨架結合物，利用一種多變的、附著的獨立雙β-propeller折疊來進行底物的呈遞。
通過對人類的DDB1和CUL4A復合體進行聯系提純，然後進行質譜分析，研究人員確定出了一種新穎的WD40-repeat蛋白家族，這類蛋白直接與DDB1的雙propeller折疊結合並充當E3酶的底物募集模塊。這些結構和蛋白質組學研究結果揭示出了cullin-RING E3復合體的一個新家族的裝配和多功能型背後的結構機制和分子邏輯關系。

2.RNAi(RNA干擾)
過去在對生物體基因功能研究時,通常利用反義寡核苷酸、核酶[1]等抑制目的基因表達,而近年來發現了一種新的誘導基因沉默的技術,即RNA干擾(RNA interference,RNAi).與其它關閉基因工具不同,RNAi是一種由雙鏈RNA介導的特異性抑制同源基因表達的技術.由於它具有高特異性和高效性,已經廣泛應用於植物、真菌、蠕蟲和低等脊椎動物以及哺乳動物的基因功能研究,並且在人類基因組功能研究和基因葯物研製及基因治療等方面,有很好的應用前景.

3.生物晶元-下個世紀的革命性技術
通過對微加工獲得的微米結構作生物化學處理能使成千上萬個與生命相關的信息集成在一塊厘米見方的晶元上。採用生物晶元可進行生命科學和醫學中所涉及的各種生物化學反應，從而達到對基因、抗原和活體細胞等進行測試分析的目的。生物晶元發展的最終目標是將從樣品制備、化學反應到檢測的整個生化分析過程集成化以獲得所謂的微型全分析系統（micro total analytical system）或稱縮微晶元實驗室（laboratory on a chip）。生物晶元技術的出現將會給生命科學、醫學、化學、新葯開發、生物武器戰爭、司法鑒定、食品和環境衛生監督等領域帶來一場革命。

4.讓腫瘤細胞自行凋亡
美國伊利諾伊州立大學的科學家成功合成出一種可以讓腫瘤細胞自行凋亡的分子。
在罹患腫瘤疾病期間，有缺陷細胞按程序凋亡的過程被破壞，癌變細胞能夠對抗機體發出的凋亡信號，這樣癌變細胞就可以毫無監控地分裂，並形成腫瘤。
根據科學家們掌握的證據，癌變細胞的這種能力與半胱天冬酶-3（caspase-3）的缺失有關，這種蛋白酶參與到細胞凋亡過程中。由於癌變細胞中半胱天冬酶-3酶原蛋白(procaspase-3)形成caspase-3的過程被破壞，所以這種蛋白酶的數量不足。
保羅·赫根羅德(Paul Hergenrother)領導的科學家團隊研究了超過兩萬種化合物以尋找到能夠促進半胱天冬酶-3酶原蛋白合成半胱天冬酶-3的物質。終於科學家們找到了這種化合物。合成分子PAC-1能夠促進半胱天冬酶-3的形成。同時，它還激活了從小鼠和人類腫瘤中分離出來的癌變細胞的自然死亡的過程。
PAC-1主要是針對那些procaspase-3含量較高的細胞發揮作用。在腸、皮膚、肝臟等部位的腫瘤細胞及白血病細胞中這種蛋白的含量較高。同時，健康細胞對於PAC-1的作用並不敏感，因為健康細胞中procaspase-3的含量並不高。研究人員指出，通過對同一個腫瘤患者的正常細胞與腫瘤細胞進行化驗表明，癌變細胞對PAC-1的敏感程度要高2000倍。
保羅·赫根羅德指出，「我們可以預測出像PAC-1這樣的化合物的潛在能力。」他還補充說，他們將選擇一些腫瘤細胞中procaspase-3的含量水平較高的患者進行治療。
科學家計劃在以後將要進行臨床研究以評估PAC-1的安全性。科學家指出，在沒有發現嚴重的副作用的情況下，原則上醫生們將獲得一種治療腫瘤的新方法。

5.研究者首次繪制調節成人幹細胞生長基因圖譜
最近，美國肯塔基州大學（UK）的Gary Van Zant博士及其研究小組在國際權威科學雜志《自然遺傳學》上發表了他們的一項重大成果。他們繪制了一個幹細胞基因和它的蛋白產品Laxetin，並且在此工作基礎上，進行了鑒定基因自身的調查研究。這是至今為止首次對幹細胞基因進行的完全研究。
這一特殊基因由於能調節體內特別是骨髓內成人幹細胞的數目而顯得尤為重要。現在它已被鑒定，研究者希望該基因與它的蛋白產品Latexin能夠應用於臨床。比如，增加進行化療或者骨髓移植病人的幹細胞數量。化療病人一個大難關是面臨治療後幹細胞喪失。這就限制了化療所能進行的劑量與類型。但是如果Latexin能夠用於增加幹細胞數量，病人就能夠接受更大劑量化療，並能更快速恢復。在骨髓移植中幹細胞數量增加同樣有用，在這里需要大量的幹細胞來幫助病人從癌症恢復。另外一個Latexin可能的應用是幫助臍帶血中幹細胞數目，這同樣用於血髓移植中移植健康幹細胞。目前，臍帶血中幹細胞移植僅能用於兒童因為臍帶血不含有移植給成人所需的足夠幹細胞數量。
目前僅在骨髓的幹細胞群中檢測了Latexin效果。Van Zant說，可能或者很可能在如肝，皮膚，胰腺或大腦組織中的幹細胞群能受Latexin的類似影響。這為使用幹細胞治療如由肝病，糖尿病損傷或者中風造成的中樞神經損傷等其他疾病和狀況開辟了新的治療策略。
研究者同樣看到了基因在如白血病和淋巴瘤中正常幹細胞轉化為癌變幹細胞的可能作用。如果基因確實起作用，那麼同樣可能是新治療方法的關鍵。這些發現對於幹細胞調節分子機制的深入了解具有作用，這包括一些幹細胞如何癌變。這些發現同樣有助於科學家發展控制用於治療的幹細胞數目與功能的有效方法，同樣為發生在幹細胞中年齡相關變化提供了一個較好的解釋。

5. 如何進行蛋白質的泛素化和去泛素化鑒別

主要有四步： 1.泛素的活化：泛素甘氨酸端的羧基連接到泛素活化酶E1的巰基，這個步驟需要以ATP作為能量，最終形成一個泛素和泛素活化酶E1之間的硫酯鍵。 2.E1將活化後的泛素通過交酯化過程交給泛素結合酶E2。 3.泛素連接酶E3將結合E2的泛素連接到目標蛋白質上並釋放E2，形成特定的泛素化的蛋白質。4.泛素化的蛋白質被特定的蛋白酶體識別並結合，最終在蛋白酶的催化下蛋白質分解為短肽或氨基酸。

6. 蛋白質經泛素-蛋白酶體降解研究基本思路（圖文詳解）

泛素 為含76個氨基酸、大小約為8.6 kDa的小蛋白質，在真核生物中普遍存在且高度保守。人類基因組中的四個基因編碼泛素： UBB ， UBC ， UBA52 和 RPS27A 。

泛素具有7個賴氨酸殘基（K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63）和一個甲硫氨酸殘基（M1）。泛素之間主要通過賴氨酸殘基和甲硫氨酸殘基進行各種連接。由此產生的泛素鏈產生一定的拓撲結構，可通過對蛋白底物進行修飾並決定底物的功能。

將泛素添加到底物蛋白質中稱為蛋白質的 泛素化 。蛋白質泛素化是一種動態的多方面翻譯後修飾，涉及真核生物學的幾乎所有方面。泛素化涉及三個主要步驟：活化，結合和連接，分別由泛素激活酶（E1），泛素結合酶（E2s）和泛素連接酶（E3s）執行。其中人源E1有2種： UBA1 和 UBA6 ；人源E2有35種；人源E3有數百種。

E3酶具有兩個結構域之一：HECT結構域以及RING結構域。HECT結構域的E3連接酶先自身結合泛素然後將泛素轉移至底物，而RING結構域的E3連接酶使E2酶直接將泛素轉移至底物。

HECT結構域E3通過2種機制連接遍在蛋白質靶底物：首先，遍在蛋白從E2的活性位點轉移到E3的活性位點中的Cys，然後遍在蛋白化目標底物中的Lys殘基。相反，RING-和RING相關的結構域E3連接酶在一步中用作泛素化靶基質的支架：E2將遍在蛋白直接轉移至靶底物中的Lys殘基。

目前，人體內還存在E4酶。E4酶為泛素鏈延伸因子，能夠對單泛素化的底物進行泛素鏈的延伸形成多聚泛素化。

單泛素化 是在一個底物蛋白殘基上添加一個泛素分子。 多單泛素化 是將一個泛素分子添加到多個底物殘基中。 多泛素化 是在底物蛋白上的單個殘基上形成遍在蛋白鏈。目前，泛素可結合的底物殘基有賴氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、酪氨酸

根據泛素與底物的連接位點，目前有9種方式的泛素化，包括M1, K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63, G76。不同方式的泛素化調控不同的功能。其中，與蛋白酶體降解相關的泛素化為K48。

全面的蛋白質組學研究確定了成千上萬種蛋白質上成千上萬的泛素化位點。大多數蛋白質在其細胞壽命的某些時刻將經歷泛素化。

研究蛋白質泛素-蛋白酶體降解大部分是研究兩個蛋白質之間的關系，即一個E3連接酶和一個底物蛋白。

環己醯亞胺（Cycloheximide, CHX）為細胞內蛋白合成抑制劑。MG132為蛋白酶體抑制劑。
圖3中，相對於MG132未處理組中SUBSTRATE蛋白在各時間點無明顯變化，MG132處理組中的SUBSTRATE蛋白在2h、4h、8h的水平明顯減小。說明SUBSTRATE的降解與蛋白酶體相關。

圖4中，隨著E3泛素連接酶表達量的增加，底物蛋白的表達水平相應降低。圖5中，隨著E3泛素連接酶酶活性失活突變表達量的增加，底物蛋白的表達水平無明顯變化。圖6中，用E3泛素連接酶的siRNA敲低細胞內E3泛素連接酶的表達水平，底物蛋白的表達水平相應增加。圖7中，過表達E3泛素連接酶酶，底物蛋白的半衰期減少。圖8中，敲低E3泛素連接酶酶，底物蛋白的半衰期增加。說明E3泛素連接酶能降低底物蛋白的表達水平。

使用免疫共沉澱的方法檢測兩個蛋白質之間的相互作用。大致分為以下三種：

通過文獻或者生物信息學分析E3泛素連接酶和底物蛋白不同的結構域。圖15上為E3泛素連接酶的不同結構域示意圖：Domain1, Domain2, Domain3, Domain4；圖15下為底物蛋白的不同結構域示意圖：DomainA, DomainB, DomainC, DomainD。使用免疫共沉澱的方法檢測兩個蛋白質之間不同結構域的相互作用，見圖16和圖17。找到相應結構域後，檢測這兩個結構域之間的相互作用，見圖18和圖19。

一般使用外源表達的泛素分子檢測蛋白質的泛素化，也可使用內源的泛素抗體。因為泛素化為泛素分子與底物蛋白質的共價結合，SDS無法破壞此種相互作用力，所以圖20中能夠看到多聚泛素化鏈的存在。一個泛素分子大約為8.5KD，因此IB結果可能會出現基於底物蛋白質清晰的ladder帶或smear帶。

蛋白質泛素化為一種蛋白質翻譯後修飾，能夠調控蛋白質的功能。目前的泛素化種類有K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63，即泛素分子的K6，K11，K27，K29，K33，K48，K63與底物蛋白質共價結合。一般認為，K48的泛素化可被蛋白酶體識別。因此，需要確認底物蛋白質的泛素鏈為K48鏈。將泛素分子賴氨酸單位點突變（見圖21）或泛素分子單賴氨酸保留突變（見圖23），通過免疫沉澱和免疫印跡的方法檢測底物蛋白質泛素化的種類，見圖22和圖24。

通過過表達（圖25）或敲低（圖26）E3泛素連接酶的方式檢測底物蛋白質泛素化水平的改變。

體外泛素化能夠排除體內復雜的環境，讓E3泛素連接酶直接與底物蛋白質作用，使E3泛素連接酶泛素化底物蛋白質更有說服力。體外UB, E1, E2, ATP以及buffer均有商業化試劑盒。只需純化E3泛素連接酶和底物蛋白質進行體外泛素反應，檢測底物蛋白質的泛素化。

7. 簡述泛素化途徑（Ubiquitination pathway）的主要步驟及其主要功能

主要有兩步：第一步，泛肽激活酶、泛肽載體蛋白、泛肽-蛋白連接酶共同作用下，將泛肽C端的羧基與底物蛋白的賴氨酸殘基的ε氨基形成異肽鍵，後續泛肽以類似的方式連接成串，完成對底物蛋白的多泛肽化標記。
第二步，多泛肽化標記的底物蛋白被26S蛋白酶體迅速降解稱成為小肽片段，再由其它肽酶水解為游離的氨基酸。
主要功能：由於基因突變、自由基破壞、環境脅迫、疾病等導致反常蛋白的產生，需要被及時降解清除，以免干擾正常的生命活動；維持體內的氨基酸代謝庫；防禦機制的組成部分；蛋白質前體的裂解加工等。

8. 什麼是泛素化

是指泛素（一類低分子量的蛋白質）分子在一系列特殊的酶作用下，將細胞內的蛋白質分類，從中選出靶蛋白分子，並對靶蛋白進行特異性修飾的過程。

泛素-蛋白酶體途徑是先發現的，也是較普遍的一種內源蛋白降解方式。需要降解的蛋白先被泛素化修飾，然後被蛋白酶體降解。

不過後來又發現，並非所有泛素化修飾都會導致降解。有些泛素化會改變蛋白的活性，導致其他的生物效應，如DNA損傷修復，機體免疫應答等。

蛋白質泛素化作用是後翻譯修飾的一種常見形式，該過程能夠調節不同細胞途徑中各式各樣的蛋白質底物。通過一個三酶級聯（E1-E2-E3），蛋白質的泛素連接由E3泛素連接酶催化，這種酶是cullin-RING復合體超級家族的最佳代表。

在從酵母到人類的各級生物中都保守的DDB1-CUL4-ROC1復合體是最近確定出的cullin-RING泛素連接酶，這種酶調節DNA的修復、DNA復制和轉錄，它能被病毒所破壞。