中葯單體研究方法

① 中葯化學的中葯化學成分結構測定一般程序和方法

一、純度的確定
(1)首先觀察外形、顏色是否單一純正，晶形是否一致。
(2)色譜分析：薄層色譜結果為單一斑點，應注意點樣量不可太小，展開劑不可只選一種。有時可用氣相色譜和高效液相色譜法，結果為單一色譜峰。
(3)熔點測定：熔點距一般應小於2℃。
二、物理常數的測定
物理常數固體樣品包括熔點、比旋度等;液體樣品包括沸點、折光率、比旋度等。
三、分子式測定
採用高分辨質譜法得到分子離子峰，可直接得出分子式。如無高分辨質譜則可先測出分子量(一般用質譜)，再進行元素分析測出所含元素及百分含量，求出實驗式，最後計算出分子式，實驗值與理論值應非常接近。
四、化合物功能團和分子骨架的推定
採用的方法有計算不飽和度、化學反應、IR光譜、UV光譜、NMR譜、MS數據，綜合分析，有時與已知物進行比較，以確定被測樣品的基本骨架與功能團(取代基)。
五、化學結構的確定
通過綜合分析所有波譜數據，必要時要作一些特殊的測試，如NMR中的一些新方法，甚至作Ⅹ射線衍射等測試，確定化學結構式。如果有可能，進行人工合成，將從中葯中提取分離所得樣品與人工合成品進行全面比較來證明結構式的正確性。

② 中葯葯理研究的具體方法

1 血清葯理學方法學研究
在中葯葯理學研究中，有相當一部分葯理活性實驗和作用機理是在體外進行的，而利用中葯粗提物直接進行體外實驗，其結果的真實性和可靠性都受到很大影響。中葯血清葯理學研究方法是指給動物經口用葯後一定的時間采血，取含葯血清進行體外實驗的一種研究方法，該方法由日本學者田代真一提出，95年前後國內即陸續開展。國家自然科學基金委員會曾於1996年資助重點項目：中葯復方體外實驗的方法學研究，在含葯血清葯理作用強度與體內給葯的量效關系研究、給葯方案研究、反應體系中含葯物血清加入量的確定、采血時間的確定及時效關系研究、含葯血清低溫保存和血清滅活對效應的影響等方面做了大量卓有成效的工作。在以含頭風飲(川芎、天麻為主)葯物血清抗血小板釋放5-HT和阻滯內皮細胞鈣通 道作用為指標的實驗中證實：在一定范圍內，動物給葯量與吸收入血的葯物量及含葯血清的體外葯理效應呈正相關〔1〕；含葯血清的葯物濃度除與給葯劑量有關外，還與給葯方案 (如一日內給葯次數及給葯天數等)直接相關〔2〕；體外實驗體系中含葯血清加入量 的多少對葯理效應產生明顯的影響，因而對最佳反應體系的探索具有重要意義〔3〕 ；在採用血清葯理學方法進行實驗前，進行時效關系研究，找出給葯後最佳采血時間是十分 必要的〔4〕；含葯血清低溫保存和血清滅活可能對葯理效應產生明顯影響，應以使 用新鮮血清或保存時間較短的血清
為宜〔 5〕。鑒於目前多數中葯或復方有效成分尚不明確，成為制約中葯現代研究的瓶頸，近年 進行了中葯血清葯化學與血清葯理學協同研究的嘗試，以揭示產生葯效的物質基礎。提出在 建立血清化學成分指紋圖譜並測定相應含葯血清葯理效應強度後，進行葯物效應成分分析， 如果含葯血清的葯理效應強度與其血清指紋圖譜中某成分指紋峰大小相一致，則說明該成分 與所觀察葯理作用密切相關〔6〕。中葯血清葯理學針對中葯及其復方復雜多樣的化 學成分的特點，結合化學、微生物學、分子生物學等多學科的先進技術手段，將有可能成為 中葯葯理學研究的一種新的方法體系。
2 單味葯葯理研究
常用單味中葯葯理研究是中葯葯理研究的重要內容。近年仍以對整體動物 葯理效應觀察及對器官、組織、細胞的影響等為主，現代生物技術如分子生物學研究方法 也受到廣泛關注和應用。研究的葯味相對集中，以補益葯、活血化瘀葯居多，不少常用中葯 的新葯理作用機理被揭示。
研究發現黃芪對自然衰老大鼠腦皮質、海馬、紋狀體3個腦區降低的M膽鹼受體和M1亞型受體密度有顯著的上調作用，並可調節老年大鼠血漿環核苷酸含量〔7〕；衰老大鼠心肌 β受體密度及T3、T4、皮質醇含量均降低，黃芪、人參、枸杞子可 升高之〔8，9〕；對肝硬化大鼠存在的下丘腦血管加壓素系統異常有改善作用 〔10〕；可以明顯提高腎病綜合征大鼠血漿白蛋白水平，改善腎小球濾過率和尿鈉排泄 〔11〕；對環磷醯胺所致免疫功能抑制小鼠細胞毒活性有顯著增強作用，並可能
通過調控巨噬細胞C1q的分泌功能來增強免疫和抗腫瘤作用〔12，13〕；還發現 黃芪煎劑及含黃芪小鼠血清均對小鼠脾淋巴細胞增殖、混合淋巴細胞培養反應及IL-2的產生有促進作用〔14〕。冬蟲夏草水提液能降低正常心肌細胞內Ca2＋ 的濃度，減輕缺氧再給氧時細胞內Ca2＋超載現象，並明顯減輕缺氧再給氧時細胞 內脂質過氧化〔15，16〕。紅參在預防高血壓性視網膜動 脈硬化起重要作用，能使內皮細胞膜的光整性、細胞器的結構及內皮細胞分泌各種血管舒縮 物質保持正常，抑制平滑肌細胞的異常增生，還有擴張血管、減少外周阻力及調節血壓的作 用〔17〕。生地黃可明顯抑制皮質酮致「陰虛」模型小鼠巨噬細胞Ia抗原 的高水平表達，降低其提呈抗原能力，從而表現出一定的免疫抑製作用〔18〕。丹參注射液可明顯降低缺血再灌注引起的大鼠腦水腫，減少腦皮層及海馬組織丙二醛含量，提高過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性和還原型谷胱甘肽、三磷酸腺苷的含量〔19〕。
3 有效部位、有效單體葯理研究
隨著中葯化學成分提取、分離技術的進步，中葯葯理學與中葯化學學科結合更為密切， 中葯 有效部位、有效單體的葯理研究日益增多。近年研究涉及的有效部位和有效單體有數十種， 研究較多、較深入的有人參皂甙、雷公藤多甙、三七皂甙、淫羊藿總黃酮、川芎嗪、天花粉 蛋白、牛膝多糖、地黃多糖等。有效部位、有效單體葯理作用的深入研究，有助於揭示中葯 治療疾病的機理。研究發現，人參皂甙對輻射引起的細胞膜損傷有防護作用〔20〕 ；人參二醇皂甙對心肌缺血再灌注犬心臟功能具有保護作用〔21〕；人參根總皂甙 具有明顯抗DNA損傷及抗突變效應〔22〕；人參皂甙Rb1對應激性性行為低下有保護 作用，其機制可能與抑制應激動物血漿皮質酮升高和提高睾酮水平有關〔23〕。雷 公藤多甙具有抗炎和免疫抑製作用，能顯著降低人工晶體表面、虹膜和睫狀體的炎症反應 〔24，25〕；對哮喘豚鼠肺組織的磷脂酶A2有明顯抑製作用 〔26〕。三七總皂甙顯著提高心肌細胞內肌漿網膜鈣泵活性，減少心肌細胞Ca2 ＋〔27〕，對犬心肌缺血再灌注損傷有保護作用〔28〕。天花粉蛋白能 明顯抑制小鼠黑色素瘤細胞S期DNA合成，通過抑制瘤細胞分裂增殖以及誘導瘤細胞凋亡而 抗腫瘤〔29〕。
4 復方葯理研究
復方是中醫用葯的主要形式，以中醫葯理論為指導，運用現代科學手段，對古方和現代經驗方進行多指標的系統葯理研究，可以在更深的層次揭示方劑的治療原理，有效地指導臨床用葯和中葯新產品研創。近年來，中葯復方在葯效學、葯代動力學和分子葯理研究等方面取得了較好的進展。
近年古方的葯理研究有數十首，其中桂枝湯、六味地黃湯、四君子湯、四物湯、大承氣湯、 補中益氣湯、當歸補血湯等研究較多。在古方研究中較多地探討了方劑的作用機制，給方劑 的傳統功效描述賦予現代葯理學內容。如桂枝湯可能通過影響興奮胃腸運動的胃泌素、胃動素、P物質以及抑制胃腸運動的生長抑素、 血管活性腸肽等在下丘腦和胃腸道中的含量來調節胃腸運動〔30～33〕；桂枝湯 對與呼吸道感染有關的10株病毒致細胞病變均有不同程度的抑製作用，其含 葯血清能抑制單純皰疹病毒等4株病毒對Hep-2細胞的增殖〔34〕。當歸補血湯 含葯血清隨給葯劑量增加可使造血祖細胞集落數明顯增多〔35〕。將六味地黃湯 方視為一個整體，以活性評價為導向，從六味地黃湯中定向追蹤分離 ，獲得了具有調節免疫功能的活性部位，該部位對TH及TC的功能有調節 作用〔36〕。這些研究都在一定程度上說明了方劑的作用原理。經驗方的葯理研究 開展得更為廣泛，其研究內容多結合新葯研究的有關要求，著重於葯效及安全性評價，不少 方劑已經或即將開發為新葯。
配伍是中醫用葯的特點和優勢所在，用葯理研究方法觀察方劑配伍與葯理效應變化之間的關系，探討方劑的配伍規律，仍然是復方葯理研究的重要內容。近年雖然還是以方劑葯味加減 、正交設計等方法為主，但在應用中也有明顯提高，採用一些新方法來更好地分析方劑的配伍問題〔37〕。關於復方配伍規律的基礎研究99年納入國家自然科學基金重點研究 項目，強調運用高新技術手段探討方劑的物質基礎，綜合分析配伍-化學成分變化-葯理效 應三者之間的聯系，闡明配伍內涵，成為新的探索方向。生脈散復方化學動態變化與葯效關 系研究表明，各葯配伍後葯效的變化可能與產生新物質有關〔38〕。以方劑的物質 基礎研究為核心，注重方劑配伍理論與現代葯理交互作用理論結合，物質基礎分析與葯理效 應觀察相結合，從組成方劑的單味葯、方劑的化學部分以及化學成分三個層次探討方劑的配 伍與物質基礎的變化的關系，在整體動物、器官組織、細胞亞細胞及分子生物學四個水平上 探討方劑的配伍、物質基礎的變化與葯理效應間的聯系，已成為復方配伍研究的基本思路 〔39〕。
5 葯代動力學研究
葯代動力學研究機體對葯物的處理規律，對於深入了解葯物的作用機理，指導臨床合理用葯 ，制定適宜的用葯方案等均有重要意義。中葯葯代動力學尤其是方劑的葯代動力學研究尚 無很好的方法和手段，目前主要採用體內葯物濃度法、葯物累積法(動物急性死亡率法)、葯理效應法、微生物指標法等，但因受到諸多因素的制約，尚待進一步完善。近年進行了黃 芩 甙、葛根素、苦參鹼、芸香甙、綠原酸、鉤藤鹼、馬錢子鹼、千金藤素等成分在動物體內的 葯代動力學研究，但單一有效成分的葯代參數顯然還難以反映含有該成分的單味中葯或復方 的葯代動力學過程。1991年黃熙等提出復方效應成分動力學假說，將中葯復方看作是一個整 體的葯物，研究方劑效應成分在體內的命運。認為所謂「復方效應成分」可以是母方中的原 形單體，也可以是母方中不含有的新成分，既可能是一個，也可能是多個化學成分(組成)； 「效應」既可以是活性效應，也可以是毒性效應〔40〕。有人提出綜合運用中葯有 效成分葯動學-葯效學同步分析統一模型、血清葯理學方法及高效毛細管電泳、二維及三維 高效液相色譜法、液質聯用或質質聯用技術等，進行中葯及復方的葯代動力學研究〔4 1〕。

③ 對中葯毒性的研究目前有哪些方法

大概有5種方法：

1
有毒成分及毒理研究方法

這是中葯毒性研究最常用的方法。主要是在中葯成分中提取、分離毒性成分，進行相關毒性實驗，如在含生物鹼的中葯中已知的有毒成分有：川烏、草烏、附子、天雄、雪上一枝蒿等品種中的烏頭鹼；雷公藤和昆明山海棠中的雷公藤鹼；馬錢子中的番木鱉鹼；曼陀羅、洋金花的莨菪鹼；苦楝子中的苦楝鹼；麻黃中的麻黃鹼；光慈菇、山慈菇中的秋水仙鹼等。其毒理作用主要是損害神經系統。外周迷走神經和感覺神經中毒，常先呈異常興奮後抑制，能直接影響心臟功能，並發其他臟器的變性壞死；中樞神經中毒，可引起視丘、中腦、延腦、脊髓的病理改變；呼吸中樞中毒可引起呼吸麻痹窒息。再如在含有苷類的中葯中，已知的毒性成分有：洋地黃、萬年青、八角楓、蟾酥、夾竹桃等品種中的強心苷，可直接作用於心臟，引起心肌收縮的增強，心率減慢；木通、黃葯子、商陸等皂苷成分，對局部有刺激作用，並能抑制呼吸，損害心臟、腎臟，尚有溶血作用；白果中的銀杏酸和銀杏酚，苦杏仁、桃仁、郁李仁、木薯、瓜蒂等品種中的苦杏仁甙，水解後可析出氫氰酸，能迅速與細胞線粒體中氧化型細胞色素酶的三價鐵結合，阻止細胞的氧化反應；芫花、廣豆根等品種中的黃酮苷，可刺激胃腸道和對肝臟的損害，引起惡心嘔吐、黃疸等症狀。

2
中葯毒代動力學研究方法

毒代動力學是運用葯代動力學的原理和方法，定量地研究毒性劑量下葯物在動物體內的吸收、分布、代謝、排泄過程和特點，進而探討葯物毒性發生和發展的規律性的一門科學。其主要目的是：揭示在毒性試驗條件下葯物所達到的全身暴露與毒性發生的內在聯系；比較動物與人的全身暴露來解釋毒理試驗數據的價值；為臨床前毒性研究的實驗設計（如動物種屬、試驗劑量和用葯方案的設計）提供依據。

3
細胞毒性試驗MTT法

這是藉助於細胞生物學技術直接觀察中葯在細胞學水平上的毒性反應。包括對細胞、細胞器形態結構的影響和對細胞整體活動的影響等。而MTT法可以快速高效地檢測葯物對細胞增殖的影響及毒性反應。從微觀角度反映中葯毒理作用的生物學基礎。

4
中葯血清葯理學方法

目前該方法應用於中葯毒性研究的尚較少，但直接用實驗動物的含葯血清培養細胞觀察中葯的毒性效應，可從微觀角度闡明毒理。為從細胞分子水平闡明中葯毒性機理開辟道路，值得借鑒。

5
分子生物學技術
將分子生物學方法應用於中葯毒理學研究，如對中毒臟器中核酸含量測定，對葯物性損傷的肝細胞中葯物代謝酶和抗氧化物酶活性的測定、毒理基因組學和蛋白組學的探討等，均將有助於從基因分子水平探討中葯毒性產生的機理與本質。

④ 中葯化學的分離純化方法

將中葯的提取液經濃縮（或不濃縮）後，較長時間放置，就可析出沉澱，再經重結晶可得單體成分，這是個別現象，如從槐米中提取蘆丁。如果要得到更多的成分，或者要系統地研究一味中葯中的化學成分，則需經過比較復雜的過程，一般是經過初步分離純化，得到某一類型的總成分（混合物），或者得到極性相近的一混合物，再經過進一步分離得到單體成分。分離方法有很多種。
┌系統溶劑分離法
│
├兩相溶劑萃取法
├沉澱法
│
·分離純化方法┼鹽析法
├分餾法
├結晶法
│
└色譜法

⑤ 簡述中草葯有效成分提取和分離方法

草葯提取分離中方法有超臨界流體萃取法、膜分離技術、超微粉碎技術、中葯絮凝分離技術、半仿生提取法、超聲提取法、旋流提取法、加壓逆流提取法、酶法、大孔樹脂吸附法、超濾法、分子蒸餾法等。具體如下 ：

1、超臨界流體萃取

利用超臨界狀態下的流體為萃取劑，從液體或固體中萃取中葯材中的葯效成分並進行分離的方法。原理是以一種超臨界流體在高於臨界溫度和壓力下，從目標物中萃取有效成分，當恢復到常壓常溫時，溶解在流體中成分立即以溶於吸收液的液體狀態與氣態流體分開。

2、膜提取分離技術

分離基本原理是利用化學成分分子量差異而達到分離目的．在中葯應用方面主要是濾除細菌、微粒、大分子雜質（膠質、鞣質、蛋白、多糖）等或脫色。

3、超微粉碎技術

是利用超聲粉碎、超低溫粉碎技術，使生葯中心粒徑在5～10μm以下，細胞破壁率達到95%。葯效成分易於提取也容易被人體直接吸收。適合於各種不同質地的葯材，而且可使其中的有效成分直接暴露出來，從而使葯材成分的溶出和起效更加迅速完全。

4、葯絮凝分離技術

將絮凝劑加到中葯的水提液中通過絮凝劑的吸附、架橋、絮凝作用以及無機鹽電解質微粒和表面電荷產生凝聚作用，使許多不穩定的微粒如蛋白質、錳液質、鞍質等連接成絮團沉降，經濾過達到分離純化的目的。

(5)中葯單體研究方法擴展閱讀：

中草葯提取和分離經歷了三個發展階段。第一階段，是傳統的丹、丸、膏、散；第二階段，是以水醇法或醇水法為主的提取、粗處理技術與現代工業制劑技術相結合而製成中成葯；第三階段，是運用現代分離技術和檢測技術精製化和定量化的現代植物葯。

植物葯的三個階段，只是說明它們先後產生的時間順序，並不表示後一階段會取代或取消前一階段。正如化學葯不能取消天然葯物、生物葯也不能取消化學葯一樣。但後一層次比前一層次更多體現或運用了現代科技。

植物提取物和現代植物葯在概念的內涵上存在著交叉性，互相包含著彼此的部分內容。現代植物葯在很大程度上是以提取物為基礎的，植物提取物是現代植物葯的主要原料和組成部分；而有些植物提取物品種則被直接作為葯用。