熒光pcr擴增產物分析方法

❶ 科普講堂|實時熒光定量PCR檢測方法

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。目前，PCR成為分子生物學研究必不可少的一部分。實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標准曲線對模板進行定量分析的方法。該項技術可以對DNA、RNA樣品進行相對定量、絕對定量和定性分析，提高了普通PCR技術的特異性和准確性，被廣泛應用於基礎研究、疾病診斷、農業檢測和法醫調查等領域。

一、常規PCR

利用DNA分子會在體外95°高溫時會發生變性解旋變成單鏈，然後降溫到60°C左右時引物會與單鏈DNA按鹼基互補配對原則結合，接著再升高溫度到72°C左右，即DNA聚合酶最適反應溫度，DNA聚合酶會沿著磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成相應的互補鏈，如此循環往復以達到DNA分子擴增的目的，常規PCR技術無法實現精確定量。

二、實時熒光定量PCR

如要對DNA、RNA樣品進行精確定量研究，就需要採用實時熒光定量PCR，根據檢測實時熒光PCR產物的方式不同，實時熒光定量PCR主要有DNA結合染料法、基於探針的化學法、淬滅染料引物法等類型。

1.  DNA 結合染料法

原理 ：應用一種帶有熒光的、非特異的DNA結合染料檢測PCR過程中積累的擴增產物。

應用於核算定量和基因表達驗證。

優缺點： 它們的優點是可以對任何雙鏈DNA 進行定量，不需要探針，具有相對高的靈敏度和可靠性，並且成本低，簡單易用，缺點是它們能在反應中結合所有的DNA雙鏈，其中包括在PCR過程中產生的引物二聚體或其他非特異產物。

染料法一般使用的是SYBR Green I染料，這是一種可以與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料，不會與單鏈DNA結合，並且在游離狀態下幾乎無熒光，只有與雙鏈DNA結合才會發出熒光，因此將PCR擴增產生的雙鏈DNA數量與熒光強度直接關聯，產生實時監測的效果。

2.  基於探針的化學法

原理： 應用一個或多個熒游標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產物；依賴熒光能量共振傳遞檢測特異性擴增產物。

應用於核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR。

優缺點： 探針法的鑒別能力遠遠大於DNA結合染料法，因為它們只與目的產物結合，從不與引物二聚體或其他非特異產物結合，缺點是它的合成價格高。

探針法中最常用的TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5』末端，而淬滅基團則在3』末端，PCR擴增時在加入引物的同時加入探針，探針完整時，熒光信號被淬滅基團吸收，PCR擴增時，5』→3』外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團和淬滅基團分離，從而檢測器可以接收到熒光信號。

3.  淬滅染料引物法

原理： 採用熒游標記引物擴增，從而使熒游標記基團直接摻入PCR擴增產物中，依賴熒光能量共振傳遞。

應用於核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR

優缺點：探針和目標片段的特異性結合產生熒光信號，因此減少了背景熒光和假陽性，還可進行多重PCR擴增，缺點是原料成本價格高

三、實時熒光PCR儀

實時熒光PCR系統包括熱循環儀，用於熒光激發的光學系統以及用於收集熒光數據和管理分析的計算機軟體，數據通過實時分析軟體以圖表的形式顯示。

❷ 熒光定量PCR的原理以及的結果如何分析

不同探針有些許差別，但原理一樣。簡單說：就是在探針上加上熒光素，在Taq聚合酶作用下合成帶有熒光素探針的片段，再給它激發光，釋放一光波，儀器檢測並分析。
至於結果：儀器有自動分析功能，會給出一個閾值線。閾值線與熒光曲線的交叉點就是CT值。根據CT值和你使用的試劑盒說明書來判讀結果。

❸ 怎樣分析熒光定量pcr結果分析

如果有標准曲線,按照標准曲線計算. 一般都是相對量.則用delta delta CT方法來計算.舉例如下：對照組基因A的CT值為20,內參（比如βactin)CT值15.實驗組基因A CT值18,內參CT值14. 首先算加樣量：delta CT=15-14=1.2的1次方是2.也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍. 基因A:delta CT=20-18=2.2的2次方是4.也就是說基因A的量在實驗組是對照組的4倍.但是由於加樣量是2倍,所以4處以2=2,最後的相對量是2倍. 幾點注意： 1.必須確定擴增的特異性 2.只有相同目標的CT值才能相減（擴增效率有可能不同） 3.2的某次方只是理論值,實際擴增效率低於2. 4.最好不用Syber Green

❹ 實時定量PCR的結果是怎樣分析的

1、如果有標准曲線，按照標准曲線計算。

2、一般都是相對量，則用delta delta CT方法來計算。

3、舉例如下：對照組基因A的CT值為20， 內參（比如βactin)CT值15。實驗組基因A CT值18，內參CT值14。

4、首先算加樣量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍。基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是說基因A的量在實驗組是對照組的4倍。但是由於加樣量是2倍，所以4處以2=2，最後的相對量是2倍。

5、幾點注意：必須確定擴增的特異性，只有相同目標的CT值才能相減（擴增效率有可能不同），2的某次方只是理論值，實際擴增效率低於2，最好不用Syber Green。

(4)熒光pcr擴增產物分析方法擴展閱讀：

PCR原理：

1、PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

2、PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

參考資料來源：網路--PCR反應

❺ pcr擴增dna實驗報告結果分析是什麼

pcr擴增dna實驗報告結果分析是延伸」三步反應的多次循環，使DNA片段在數量上呈指數增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。在環境檢測中，靶核酸序列往往存在於—個復雜的混合物如細胞提取液中，且含量很低。

利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。

實驗分析

PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，並記錄在電腦軟體之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標准曲線獲得定量結果。

利用外標准曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最准確，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用於基因表達研究、轉基因研究，葯物療效考核、病原體檢測等諸多領域。

以上內容參考：網路——聚合酶鏈式反應（ PCR擴增）

❻ pcr擴增產物分析的方法有免疫印跡嗎

PCR擴增產物的分析方法微孔板夾心雜交法顏色互補分析法PCR-ELISA法PCR-OLA法PCR-打點雜交法微孔板夾心雜交法：該法是通過一固定於微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特 異雜交使產物的間接地固定於微孔板上，然後，再用一生物素 等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一特異性較一次 雜交，漂洗後顯色即可判斷結果。該法需要兩個雜交過程來檢測 一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用於HBV 的檢測，其敏感度可達5個HBVDNA分子。此法的敏感性和特異性與 PCR32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡 便、快速、避免了同位素標記探針的危害，顯色反應類似於臨床常 規應用的ELISA，適於臨床實驗室常規應用。另一種微孔板雜交法不 是採用夾心法，而是直接將特異探針固定微孔板上，然後用生物素 標記的PCR產物雜交。微孔板雜交與膜印跡雜交相比，有如下優點： ①前者易操作；②固相微孔板漂洗時間短，節省了檢測時間，因為 膜雜交過程中，反應劑要浸透膜中，漂洗時，使反應劑全部浸出需 要時間較長；③本底低，微孔板雜交不需Dehatdt液和預雜交以及封 閉過程。另外，微孔板固定的DNA不需再加熱或UV照射。微孔板雜交的基本過程包括L：DNA的固定，探針的雜交和酶聯顯色。DNA的固定在一定鹽濃度條件下，DNA單鏈的一端可固定在微孔板上。不同來源 的微孔板固定DNA時所需鹽濃度不同。因此，必須用一系列的鹽濃度 （0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）來固定加熱變性的核酸，然後，用固 定濃度的標記探針雜交。顯色後，判斷合適的固定鹽濃度。固定方 法的選擇必須使DNA最大量的固定，且不影響雜交。用合適濃度的 NaCl或(NH4)2SO4可達到此目的。硫氰酸鈉則無固定作用。鹽濃度合 適時，DNA應為一端固定到微孔板上，而太低或太高濃度的鹽可能使 DNA「平躺」固定在孔內而影響雜交。Mg2+雖有促進DNA固定的作 用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。被固定的DNA應大於300bp， 否則影響雜交結果。每孔可固定高達200ng(624bp)的DNA。合適的鹽 濃和固定量一經確定，可按下法固定DNA。
待固定DNA100℃加熱5min變性並立即冷卻。與合適的固定液混合後，加入微孔板的孔內。固定液：10mmol/L磷 酸鈉-10mmol/LEDTA，pH7.0，合適濃度的NaCl（與DNA變性混合後， 終濃度為最適固定濃度）。用膠布封好，浸於37℃水浴2h。用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。立即用於雜交，或封閉於塑料袋內保存。雜交可採用標準的雜交系統雜交。夾心雜交時，是將變性的PCR產物與檢 測探針一並加。雜交與漂洗時間均較一般膜雜交短。顯色根據不同酶標檢測分子的不同選擇不同的底物、終止劑和測定波 長。顏色互補分析法(A)顏色互補分析法是利用三原色原理，當不同DNA片段（A和B）同時擴增時，用引 物5』端修飾技術將不同引物用不同顏色熒光素標記（A片段引物標記綠色的熒 光素，B標記紅色的羅丹明）。如果僅有一條片段被擴增，擴增產物激發後，只有 一種顏色（紅色或綠色）。如果兩條不同大小的片段均被擴增，可通過電泳分離，紫 外激發後可觀察到不同顏色的兩條帶。如果兩條被擴增片段大小相同，電泳後可見一 條紅綠互補色-黃色帶。如果不用電泳法分離擴增片段，通過一定手段除未摻入引 物，亦可觀察到擴增產物的顏色。此時，擴增產物無論大小，只要均被擴增，就可見 一條紅綠互補的黃色條帶。該法簡便、易於自動化，可用於檢測基因，缺失、染色體轉位和病原微生物。這種情 況下，只需判斷產物的有無。另外，在檢測多種基因實變、多種病原菌和HLA分型 時，可用復合PCR。此時，不同引物可用不同熒光素標記（如綠色的ROX；藍色的COUM 等）。PCR-ELISA法：(A)本法避免了電泳和雜交的步驟，適於常規ELISA記數儀檢測。因為5』端修飾後仍 可進行常規PCR擴增特異靶序列，因此，可以通過修飾其中一個引物的5』端使其攜帶 便於PCR產物固定的功能基團，而通過另一引物5』端的修飾使產物便於檢測。鏈霉親和素的包被：不同廠家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差異並不顯著。親和層析純化的鏈霉親和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmol/LNaCl， 2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，Ph7.2 配成1μg/ml。向微孔板的每孔內加入100μl，封好，室溫過夜。 用PBS液漂洗。
擴增產物與包被板的結合：PCR產物1μl用50μ1PBS-Tween液稀釋後加入包被孔內。室溫下作用30min。 用PBS-Tween液漂洗6次，去除未摻入的熒光引物。 ELISA：向結合有PCR產物的孔內加入50μlPBS-Tween液稀釋的HRP-抗FITC抗體，室溫下作用 30min。用PBS-Tween漂洗6次。將1mgTMB溶於1ml二甲基亞碸中，用50mmol/L醋酸鈉-檸檬酸液（Ph4.9）稀釋10倍， 向每孔內加入30%（v/v）H2O23μl，再加入80μlTMB液，使反應在室溫下進行2～5min ，再加入80μl2mol/L硫酸終止反應。於ELISA計數儀上450nm測定OD值。另外，引物的修飾除用圖2-3所示的生物素和FITC外，還可用DNA結合蛋白質的結合位 點和生物素修飾，將DNA結合蛋白質（GCN5或TyrR）包被在微孔板內，與PCR產物結合 後，可加入酶標親和素進行ELISA檢測。PCR-ELISA法可用於PCR產物定量分析。需注 意的是，定量分析時，PCR要在對數期內終止，並需設立已知標准對照。PCR-OLA法(A)研究表明、不同個體中同源DNA片段序列間的差異大部分是限定於單個核苷酸的位 置。已弄清的人遺傳病的40個基因結構變異中，絕大部分屬鹼基替換，同樣，作為遺 傳連鎖分析標記的大部分序列變異主要是位於基因組的非編碼區的點突變。所以，一 般基因檢測技術的一個重要要求是能很容易地檢出單一核苷酸變異。寡核苷酸連接試 驗（OLA）就是為此目的而設計的。它可以單獨或結合PCR快速確定緊密相關的DNA序 列。OLA是通過設計兩種能與靶序列DNA精確並列雜交的寡核苷酸完成的。寡核酸雜交 後，DNA連接酶可使其正常配對的相鄰鹼基共價連接，而錯配的相鄰鹼基可通過調節 連接酶和NaCl濃度防止其連接，連接產物可通過凝膠電泳觀察其大小，或通過5』端 修飾技術使一個寡核苷酸5』端帶有一個配基。連接後，通過固相化的親和配基使其 固定，漂洗後，檢測另一寡核苷酸3』端攜帶的適當標記分子。這一過程如重復進行 多個循環，則連接產物會呈線性增加，故稱這循環進行的OLA為連接檢測反應（LDR）。 此反應中若再加入兩種與上述寡核苷酸互補的寡核苷酸互補的寡核苷酸進行循環的連 接反應，則稱之為連接酶鏈反應。兩寡核苷酸在無靶序列的情況下，在非常接近的位 置發生雜交的可能性極小，因此，OLA技術的假陽性極少。另外，連接酶所形成的鍵 是連接產物。該法適於簡單、標准化的基因組樣品處理法，或直接用表面活性劑和蛋 白酶初步處理有核細胞作為檢測樣品。需指出的是，這里是以放射性標記檢測分子為 例的。如圖2-6中的地高辛標記分子可避免放射性同位素的缺點，且敏感性相當，更 易於自動化。
寡核苷酸的設計與標記：用於OLA的寡核苷酸一般為20mer，使被檢變異核苷酸位於 即將連接的兩個寡核苷酸接頭的5』端。即位於圖2-6中第2步左側寡核苷酸的3』端。 左側寡核苷酸是5』標記生物素。右側寡核苷酸5』端需磷酸化才能與左側寡核苷酸的 3』-OH相連接。用PNK酶處理很易使其5』或3』標記可以選擇其它標記物（如熒光素 等）。OLA反應：向一軟質圓底微滴定板內依次加入：3μlPCR擴增DNA產物；1μl剪切的鮭精DNA(10μg /μl);1μl0.5mol/LNaCl混勻室溫作用10min。加入1μl0.5mol/LHCl，混勻。加入1μl生物素標記探針水溶液（140fmol）和1μl32P探針（1.4fmol），2μlT4連 接(約0.1WeiSS單位，用5×連接緩沖液稀釋)。5X連接緩沖液：250mmol/LTris-HCl， Ph7.5;500mmol/LNaCl;500mmol/LMgCl2;25mmol./LDTT;5mmol/LATTP;500μg/μlBSA。 不同寡核苷酸與底物反應的連接所需酶液度不同，OLA試驗時，一定要小心滴定最適 酶濃度，提高連接溫度（50℃）可擴加OLA的特異性。混勻，在100%濕度下於37℃作用1h。加入1μl1mol/LNaOH，混勻，室溫下作用10min。加入1μl1mol/LHCl中和。加入2μl10%SDS，3μl15%（w/v）鏈霉親和素包被的瓊脂糖懸液，混勻後室溫作用 10min。將一事先用0.5%奶粉-0.1%SDS-100μg/ml蛙精DNA煮過的Whatman4號濾膜置於點樣器 上，然後，將微孔板內混合液加入點樣孔內，真空抽濾點膜。再用數毫升1%SDS和 0.1mol/LNaOH分別依次抽洗膜。取下膜，用塑料保鮮包好進行放射自顯影。打點雜交當擴增產物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過 程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再 用放射性或非放射性標記的探針雜交。點雜交還有助於檢測突變 DNA的突變類型，用於人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同 位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性 均不容懷疑，對人們認識某些疾病與基因變異的關系起了很大的作 用。但是，由於同位素不穩定和放射性危害，不能常規用於臨床或 法醫檢驗。因而用非放射性物質（生物素、和地高辛等）標記的寡 核苷酸探針分析PCR產物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的 方法。非放射性標記物質穩定性高、使用方便、安全、檢測速度 快。因此，本節僅敘述非放射性標記探針的點雜交與檢測情況。
膜的制備：點雜交膜的制備有兩種方法，一是將擴增產物直接固定於膜上，每 一個探針制備1張膜。然後，用不同的等位基因特異或某一微生物特 異探針在嚴格條件下雜交來檢測擴增產物的突變類型或鑒定病原 菌；另一種方法是將不同的探針固定到尼龍膜上，然後，用標記的 PCR產物作探針去雜交。這樣，根據雜交點的位置即可判斷產物序列 變異的種類。顯然，前一方法較後一方法繁瑣，費時，費力；而後 一方法僅需一次雜交即可判斷結果。產物的固定：⑴取1張帶正電荷的尼龍膜，按點樣器的 大小裁剪膜，並做好標記。⑵將膜浸入水中濕透至少 1min。⑶變性PCR產物：此步可在圓底微孔板或微量離 心管內操作。每點的變性方法為；5～20μl(50～100ng)PCR 產物與100μl變性液（0.4mol/LNaOH-25mmol/LEDAT） 混勻，室溫作用5min即可。⑷小心將預濕的膜裝在點 樣器上，注意膜與點樣器接觸表面不能有任何氣泡。 因氣泡會使點樣點呈環形或月牙形或樣品間彌散融 合。膜固定後，每孔內加100μl變性混合液，打開真空泵。⑸抽干變性液後，每孔內再加100μlTE緩沖 液，真空抽濾「洗滌」樣品。⑹取下膜，置於厚3mm濾 紙上漬干。重復制備用於其它基因探針的膜時，一定要認真清洗點樣器，以免樣品間的交叉污染。⑺漬干 的膜於80℃真空干烤1h或於254nmUV光源下以60～120mJ/cm2 的強度下照射使DNA固定在膜上。此時，的膜可直接用 於雜交，也可以用濾紙包好存於塑料袋或乾燥缸內。探針的固定：因寡核苷酸的探針太短，在膜上固定較 困難，即使固定上，也會影響雜交。這就是需要將寡 核苷酸探針用末端轉移酶加polydT尾後，UV線照射固 定。因為UV可激活胸腺嘧啶，使其與尼龍膜上的氨基共價結合，使探針間接地牢固地固定在尼龍膜上。這 種加尾固定的探針不影響雜交。但這種雜交對固定探針的要求是，在同一條件下與PCR產物的雜交必須是特 異的。通過選擇探針的合適長度，G+C含量或通過改變 探針的固定可達到特異性的要求。這種固定的探針可 用於檢測人類基因的突變，也可用來檢測病原微生 物。
(1)加尾反應是用脫氧核糖核酸末端轉移酶（TDT）催化，它可將dT依次加在寡核苷酸的3』端，在四種脫氧 核苷中，以dT加尾效果最好。通過改變dT濃度和TdT量 可調節加尾長度，在下述反應條件下，加尾長度可達 400個dT。①向一微量離心管中依次加入：寡核苷酸探 針，100～200pmol;10×TdT緩沖液(1mol/L二甲胂酸鉀; 250mmol/LTris-HCl，Ph7.6;10mmol/LCoCl2;2mmol/LDTT) 10μl;dTTP80～110nmol；TdT，60～80U；補水至100μl。 ②混勻後，稍加離心，置37℃水浴60～90min。③加入 100μl10mmol/LEDTA終止反應。加尾長度可通過10%聚 丙烯醯胺凝膠電泳監測。(2)點膜：①加尾探針6pmol，用0.3mol/LNaOH室溫處理5min，然後，用2.5mol/LNH4Oac中和。②加入等體 積6×SSC(1×SSC:0.15mol/LNaCl，0.015mol/L檸檬酸三 鈉pH7.0)。③將6×SSC預濕的尼龍膜（zeta-probe）或 hybond-N固定在點樣器上。④點樣方法同上。(3)固定：①小心取下膜，置於TE緩沖液飽和的4～6 濾紙上，DNA面朝上。②將濾紙和膜一起置於254nmUV 燈下照射固定，poly(dT)400尾的探針在40mJ/cm2r的 劑下固定效果最好。輻射劑與給定光源對給定面積的 能量釋放率（輻照度）和輻照時間有關。一般對一個 固定光源而言，輻照劑量為：輻照劑量（J/cm2）=輻照度（w/m2）×輻照時間(s)其中，J為輻照能量單位；w為輻照通量單位。輻照度 與照射角度有關，與入射角度θ的餘弦（cosθ）呈正 相關。③固定後，在100ml6×SSC-0.5%SDS液中於42～55℃ 漂洗30min左右。漂洗後可立即用於雜交，也可以在蒸溜水中浸洗，晾乾後室溫保存。
探針的固定量與加尾長度均影響雜交結果。如用poly (dT)400尾的不同固定量的探針與等PCR產物（2.33fmol） 雜交，固定6pmol苷酸雜交時，有29.2%的PCR產物與 1.1%的寡核而固定的探針600fmol雜交時，僅有2.2%的產 物與0.8%。用不同加尾長度的等量產物6pmol固定寡核苷酸與（時，僅0.33%233fmol）雜交結果表明， poly(dT)300探針與產物雜交；而有1.3%的探針poly (dT)400時，則與產物雜交。因此，固定的探針加最好 在400個以dT尾上，固定量也至少6pmol。雜交寡核苷酸探針的雜交：每一寡核苷酸探針均有自己的雜交溫度和漂 洗條件，主要取決於探針的Tm值。Tm值則受探針長度，G+C含量和雜 交液的鹽渡影響。一般要由如下公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)來計算Tm 值。在1mol/L鹽濃時，雜交溫度可比預測的寡核苷酸Tm值低5～20℃。 提高雜交溫度和降低鹽濃度可提高雜交的嚴格性。漂洗液一般不含 鹽，漂洗溫度比雜交溫度低5℃。一旦確定了探針的雜交與漂洗條 件，可按下述方法進行雜交。⑴在（2×SSPE3.6mol/LNaCl：; 200mmol/LNaH2PO4;20mmol/LEDTA，Ph7.4）液中預濕點樣膜。⑵置 膜於塑料封口袋中，並加入適量雜交液（SSPE，5×Denhardt液， 0.5%TritonX-100），封口。袋內不要有氣泡。⑶置於水浴加熱搖 動，在雜交溫度下預雜交5min。⑷取出塑料袋，剪開一角。加入非 放射性標記物（如生物素-補骨脂素）標記的探針。每毫升雜交中加 入1pmol探針。封口後搖育20～60min。雜交時間不能太長，否則會 引起探針與膜的不可逆結合。⑸從袋中取出膜，室溫下在漂洗液 （SSPE-0.1%TritonX-100）中洗1～2次。⑹漂洗溫度下預熱的漂洗 液在合適溫度下洗10min。漂洗後的膜可用於顯色檢測。
反向點雜交：反向點雜交即擴增產物作為相中的探針與固定到膜上 的寡核苷酸雜交。如前述，這種雜交最基本的要求就是在同一條件 下，所有固定探針均與擴增產物特異雜較。為此，主要是認真選擇 與設計寡核苷酸探針，使各探針在同一條件下Tm值相近。在同一雜 交特異。一旦確定了合適的雜交和漂洗條件，即可按上述基本程度雜交。只是雜交探針（產物）在加入前應加熱變性或用等體積的 400mmol/LNaOH-10mmol/LEDTA變性。雜交時間（2～4h）要長些。PCR 產物的標記可以用標記引物擴增或在擴增時摻入標記物。雜交的檢測不同非放射性標記物的檢測原則上基本相同。若為酶標探針則可直接進行顯色檢測。下面以生物素標記物為例加以說明。酶標親和素的結合 ⑴漂洗後的膜在緩沖液A（PBS，100mmol/LNaCl，5%TritonX-100） 中與一定濃度的HRP-標記鏈霉親和素在室溫作用10min，並輕輕振 盪。⑵用緩沖液B（液A，1mol/L尿素，1%硫酸葡聚糖）在室溫下漂 洗5min，並輕輕振盪，將膜上非特異吸附的HRP-鏈霉親和素洗掉。顯色不同酶標親和素的顯色條件與底物均不同，下面以HRP的顯色加以說 明。⑴將上述膜於緩沖液C（100mmol/L檸檬酸鈉，pH5.0）中在室溫下作 用5min，並輕輕振盪。⑵在緩沖液D中室溫下，輕輕振盪10min。此步應避強光。緩沖液D： 1份底物（TMB：2mg/ml，用無水乙醇配製）和19份緩沖液C。⑶在緩沖液E中顯色，該液應現用現配。應避強光。緩沖液E：2000 份緩沖液D和1份3%H2O2。顯色時間取決於雜交體中含標記物的量； 一般為1～15min即可。雜交陽性呈深藍紫色。⑷當膜色（信/噪比）合適時，在液C中洗膜1h終止反應，在此過程 中應更換2～3次液體。⑸雜交膜可拍照記錄結果，也可封於緩沖液C避光條件下貯存。膜的再利用⑴脫色：將膜置於0.18%Na2SO4液中即可脫掉膜上的顏色。 ⑵去雜交的探針：將膜置於水-0.5%SDS中，65℃加熱1h。 ⑶這種處理的膜可再與另一種探針雜交。
問題與對策信號弱：①點膜的產物少-增加點膜量；②雜交時探針濃度低-加大 探針濃度；③雜交漂洗過於嚴格-增加鹽濃度或降低雜交溫度；④TMB 液貯存時間過長（TMB液4℃可存2個月）-重新配製。本底信號強：①雜交時探針濃度高-降低探針濃度；②雜交時間長- 縮短雜交時間；③雜交漂洗不嚴格-降低鹽濃度和提高雜交溫度；④ 顯色時間長-縮短顯色時間。雜交膜的高本底著色：①同②；②在緩沖液C中洗膜時間短-延長漂 洗時間（過多的硫酸葡聚糖也能增加膜的本底著色；③同2④；④避 光不嚴格-顯色過程中及顯色後要確保雜交膜的避光。陰性對照出現陽性信號：①點樣混淆，即把陽性標本點於陰性對照 的位置，重復實驗即可糾正；②PCR較物的殘留污染，用新配的試劑 重復全部擴增反應。（我自己加進的：Hybond—N+：Hybond-N+是帶正電尼龍膜，對在鹼性條件下雜交和普通的Southern雜交均有很好的靈敏性，故核酸樣品可通過簡單的鹼處理固定在膜上，而不必在紫外燈下固定，盡管紫外固定的重復性最好。）
￥
5.9
網路文庫VIP限時優惠現在開通,立享6億+VIP內容
立即獲取
PCR擴增產物的分析方法
資料範本
本資料為word版本，可以直接編輯和列印，感謝您的下載
PCR擴增產物的分析方法
地點：__________________
時間：__________________
說明：本資料適用於約定雙方經過談判，協商而共同承認，共同遵守的責任與義務，僅供參考，文檔可直接下載或修改，不需要的部分可直接刪除，使用時請詳細閱讀內容
第 1 頁

PCR擴增產物的分析方法
微孔板夾心雜交法
顏色互補分析法
PCR-ELISA法
PCR-OLA法
PCR-打點雜交法
微孔板夾心雜交法：
該法是通過一固定於微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特 異雜交使產物的間接地固定於微孔板上，然後，再用一生物素 等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一特異性較一次 雜交，漂洗後顯色即可判斷結果。該法需要兩個雜交過程來檢測 一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用於HBV 的檢測，其敏感度可達5個HBVDNA分子。此法的敏感性和特異性與 PCR32P探針的

❼ 熒光定量pcr原理

熒光定量pcr原理如下：

熒光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR擴增反應體系中加入熒光基團，通過對擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測,最後通過標准曲線對未知模板進行定量分析的方法。

以探針法熒光定量PCR為例：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。

開始時，探針完整地結合在DNA任意一條單鏈上，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時，Taq酶將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成同步。

Ct值最大的意義就是用來計算目的基因的表達量，此時就有兩個概念容易被提及，那就是絕對定量和相對定量，絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數目，即通常所說的拷貝數。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數。

Ct值誠然可以被利用來計算這兩種定量結果，但是絕對定量實驗必須使用已知拷貝數的絕對標准品，必須做標准曲線。相對定量可以做標准曲線，也可以不做標准曲線。絕對標准品製作困難難以獲取，實驗室基本都是選擇相對定量的方法來計算相對基因表達量。

❽ PCR產物的檢測方法有哪些都有什麼原理

1.瓊脂糖凝膠電泳 同時點分子量marker，根據marker條帶判斷產物分子量大小，從而大致判斷是不是你要的
2.酶切 已知你產物的序列，看上面有什麼酶切位點，用一個酶或者兩個酶切斷，看與理論預測的條帶數目和大小是否一致。一般檢測有以上兩步就行了，如果需要知道確切的需要進行3
3.測序 連接到pMD-18t 載體上，轉到大腸桿菌中。拿到公司去測序，測序結果通過gene bank比對看與哪個基因一致，這種方法最准確
4.表達 pcr產物連到真核或者原核表達載體上，適宜條件表達出來以後的蛋白做質譜分析，看與理論產物表達的蛋白是否有一致的片段

❾ 熒光pcr法是什麼

一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環後產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。

Real-timePCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由於在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據。

技術原理

將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合後，完成高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環，並遵守聚合酶鏈反應規律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離於反應體系中。

在特定光激發下發出熒光，隨著循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值，同時利用數個已知模板濃度的標准品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數。