蛋白質組分析方法

㈠ 基因組和蛋白質組之間的關系，企業常用的分析蛋白質組的方法有哪些

組學omics,研究的是整體.按照分析目標不同主要分為基因組學,轉錄組學,蛋白質組學,代謝組學.基因組學研究的主要是基因組DNA,使用方法目前以二代測序為主,將基因組拆成小片段後再用生物信息學演算法進行迭代組裝.當然這僅僅是第一步,隨後還有繁瑣的基因注釋等數據分析工作.轉錄組學研究的是某個時間點的mRNA總和,可以用晶元,也可以用測序.晶元是用已知的基因探針,測序則有可能發現新的mRNA,蛋白組學針對的是全體蛋白,組要以2D-Gel和質譜為主,分為top-down和bottom-up分析方法.理念和基因組類似,將蛋白用特定的物料化學手段分解成小肽段,在通過質量反推蛋白序列,最後進行搜索,標識已知未知的蛋白序列.代謝組分析的代謝產物,是大分子和小分子的混合物,主要也是用液相和質譜.總而言之,這些技術都想從全局找變數,都是一種top-down的研究方法,原因很簡單：避免『只緣身在此山中』的尷尬.但因為技術局限,都各有缺點,尤其是轉錄組和蛋白組數據,基本上顛覆了以前一直認為的mRNA水平能代表蛋白水平的觀念,因為這兩組數據的重合度太低.所以目前很多研究都開始使用交叉驗證方法.

㈡ 蛋白質組學主要包括哪些分析技術及各自特點

雙向凝膠電泳
雙向凝膠電泳的原理是第一向基於蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。由於雙向電泳技術在蛋白質組與醫學研究中所處的重要位置，它可用於蛋白質轉錄及轉錄後修飾研究，蛋白質組的比較和蛋白質間的相互作用，細胞分化凋亡研究，致病機制及耐葯機制的研究，療效監測，新葯開發，癌症研究，蛋白純度檢查，小量蛋白純化，新替代疫苗的研製等許多方面。近年來經過多方面改進已成為研究蛋白質組的最有使用價值的核心方法。

等電聚焦
等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質分離等電點不同的蛋白質的電泳技術。等電聚焦凝膠電泳依據蛋白質分子的靜電荷或等電點進行分離，等電聚焦中，蛋白質分子在含有載體兩性電解質形成的一個連續而穩定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質是脂肪族多氨基多羧酸，在電場中形成正極為酸性，負極為鹼性的連續的pH梯度。蛋白質分子在偏離其等電點的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動；當蛋白質遷移至其等電點位置時，其靜電荷數為零，在電場中不再移動，據此將蛋白質分離。

生物質譜
生物質譜技術是蛋白質組學研究中最重要的鑒定技術，其基本原理是樣品分子離子化後，根據不同離子之間的荷質比（M/E）的差異來分離並確定分子量。對於經過雙向電泳分離的目標蛋白質用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽鍵）成肽段，對這些肽段用質譜進行鑒定與分析。目前常用的質譜包括兩種：基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧質譜（ESI- MS）。

飛行時間質譜
MALDI 的電離方式是 Karas和Hillenkamp於1988年提出。MALDI的基本原理是將分析物分散在基質分子（尼古丁酸及其同系物）中並形成晶體，當用激光（337nm的氮激光）照射晶體時，基質分子吸收激光能量，樣品解吸附，基質-樣品之間發生電荷轉移使樣品分子電離。它從固相標本中產生離子，並在飛行管中測定其分子量，MALDI-TOF-MS一般用於肽質量指紋圖譜，非常快速（每次分析只需3~5min），靈敏（達到fmol水平），可以精確測量肽段質量，但是如果在分析前不修飾肽段，MALDI-TOF-MS不能給出肽片段的序列。

電噴霧質譜（ESI-MS）
ESI- MS是利用高電場使質譜進樣端的毛細管柱流出的液滴帶電，在N2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產生的庫侖力與液滴表面張力達到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴，這一過程不斷重復使最終的液滴非常細小呈噴霧狀，這時液滴表面的電場非常強大，使分析物離子化並以帶單電荷或多電荷的離子形式進入質量分析器。ESI-MS從液相中產生離子，一般說來，肽段的混合物經過液相色譜分離後，經過偶聯的與在線連接的離子阱質譜分析，給出肽片段的精確的氨基酸序列,但是 分析時間一般較長。 目前，許多實驗室兩種質譜方法連用，獲得有意義的蛋白質的肽段序列，設計探針或引物來獲得有意義的基因。隨著蛋白質組研究的深入，又有多種新型質譜儀出現，主要是在上述質譜儀的基礎上進行改進與重新組合。

㈢ 蛋白質組學的研究技術

可以說，蛋白質組學的發展既是技術所推動的也是受技術限制的。蛋白質組學研究成功與否，很大程度上取決於其技術方法水平的高低。蛋白質研究技術遠比基因技術復雜和困難。不僅氨基酸殘基種類遠多於核苷酸殘基（20/ 4）, 而且蛋白質有著復雜的翻譯後修飾，如磷酸化和糖基化等，給分離和分析蛋白質帶來很多困難。此外，通過表達載體進行蛋白質的體外擴增和純化也並非易事，從而難以制備大量的蛋白質。蛋白質組學的興起對技術有了新的需求和挑戰。蛋白質組的研究實質上是在細胞水平上對蛋白質進行大規模的平行分離和分析，往往要同時處理成千上萬種蛋白質。因此，發展高通量、高靈敏度、高准確性的研究技術平台是現在乃至相當一段時間內蛋白質組學研究中的主要任務。當前在國際蛋白質組研究技術平台的技術基礎和發展趨勢有以下幾個方面： 通常可採用細胞或組織中的全蛋白質組分進行蛋白質組分析。也可以進行樣品預分級，即採用各種方法將細胞或組織中的全體蛋白質分成幾部分，分別進行蛋白質組研究。樣品預分級的主要方法包括根據蛋白質溶解性和蛋白質在細胞中不同的細胞器定位進行分級，如專門分離出細胞核、線粒體或高爾基體等細胞器的蛋白質成分。樣品預分級不僅可以提高低豐度蛋白質的上樣量和檢測，還可以針對某一細胞器的蛋白質組進行研究。
對臨床組織樣本進行研究，尋找疾病標記，是蛋白質組研究的重要方向之一。但臨床樣本都是各種細胞或組織混雜，而且狀態不一。如腫瘤組織中，發生癌變的往往是上皮類細胞，而這類細胞在腫瘤中總是與血管、基質細胞等混雜。所以，常規採用的癌和癌旁組織或腫瘤與正常組織進行差異比較，實際上是多種細胞甚至組織蛋白質組混合物的比較。而蛋白質組研究需要的通常是單一的細胞類型。最近在組織水平上的蛋白質組樣品制備方面也有新的進展，如採用激光捕獲微解剖(Laser Capture Microdissection, LCM) 方法分離癌變上皮類細胞。 利用蛋白質的等電點和分子量通過雙向凝膠電泳的方法將各種蛋白質區分開來是一種很有效的手段。它在蛋白質組分離技術中起到了關鍵作用。如何提高雙向凝膠電泳的分離容量、靈敏度和解析度以及對蛋白質差異表達的准確檢測是目前雙向凝膠電泳技術發展的關鍵問題。國外的主要趨勢有第一維電泳採用窄pH梯度膠分離以及開發與雙向凝膠電泳相結合的高靈敏度蛋白質染色技術，如新型的熒光染色技術。
質譜技術是目前蛋白質組研究中發展最快，也最具活力和潛力的技術。它通過測定蛋白質的質量來判別蛋白質的種類。當前蛋白質組研究的核心技術就是雙向凝膠電泳－質譜技術，即通過雙向凝膠電泳將蛋白質分離，然後利用質譜對蛋白質逐一進行鑒定。對於蛋白質鑒定而言，高通量、高靈敏度和高精度是三個關鍵指標。一般的質譜技術難以將三者合一，而最近發展的質譜技術可以同時達到以上三個要求，從而實現對蛋白質准確和大規模的鑒定。 做過雙向凝膠電泳的人一定會抱怨它的繁瑣、不穩定和低靈敏度等缺點。發展可替代或補充雙向凝膠電泳的新方法已成為蛋白質組研究技術最主要的目標。目前，二維色譜 (2D-LC)、二維毛細管電泳 (2D-CE)、液相色譜－毛細管電泳 (LC-CE) 等新型分離技術都有補充和取代雙向凝膠電泳之勢。另一種策略則是以質譜技術為核心，開發質譜鳥槍法(Shot-gun)、毛細管電泳-質譜聯用 (CE-MS)等新策略直接鑒定全蛋白質組混合酶解產物。隨著對大規模蛋白質相互作用研究的重視，發展高通量和高精度的蛋白質相互作用檢測技術也被科學家所關注。此外，蛋白質晶元的發展也十分迅速，並已經在臨床診斷中得到應用。蛋白質組生物信息學
蛋白質組資料庫是蛋白質組研究水平的標志和基礎。瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大，種類最多的蛋白質組資料庫。丹麥、英國、美國等也都建立了各具特色的蛋白質組資料庫。生物信息學的發展已給蛋白質組研究提供了更方便有效的計算機分析軟體；特別值得注意的是蛋白質質譜鑒定軟體和演算法發展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大學、UCSF等都有自主的搜索軟體和數據管理系統。最近發展的質譜數據直接搜尋基因組資料庫使得質譜數據可直接進行基因注釋、判斷復雜的拼接方式。隨著基因組學的迅速推進，會給蛋白質組研究提供更多更全的資料庫。另外，對肽序列標記的從頭測序軟體也十分引人注目。

㈣ 蛋白質含量測定方法

蛋白質含量測定分析方法有：馬斯亮藍法（Bradford）、Folin酚試劑法（Lowry）、BCA法等。
蛋白純化是目前生物研究鄰域中較為熱門的一個大方向，其中蛋白含量測定是純化過程中很重要的一項內容。
Folin酚試劑法（Lowry）是目前最靈敏的測定方法，但耗費時間長，操作需嚴格計時，顏色深淺隨不同蛋白質而變化，因為其中的酒石酸鉀-硫酸銅試劑配置保存困難，逐漸被考馬斯亮藍法取代。
考馬斯亮藍法（Bradford）是採用考馬斯亮藍G250染料與蛋白質結合，應用廣泛，顏色穩定，專一性較差，干擾物質多。
BCA法主要基於雙縮脲原理，用於快速檢測，抗干擾能力強，但受金屬螯合劑影響。
每種測定方法都不是完美無缺的，都有其優缺點，在選擇時應考慮：試驗所要求的靈敏度和精確度；蛋白質的性質；溶液中存在的干擾物質；測定時所耗費的時間等因素。就具體情況選擇最合適的試驗方法。

㈤ 蛋白質組的技術原理

雙向凝膠電泳技術(2-DE)
雙向凝膠電泳技術與質譜技術是目前應用最為廣泛的研究蛋白質組學的方法。雙向凝膠電泳技術利用蛋白質的等電點和分子量差別將各種蛋白質區分開來。雖然二維凝膠電泳難以辨別低豐度蛋白，對操作要求也較高，但其通量高、解析度和重復性好以及可與質譜聯用的特點，使其成為目前最流行、可靠的蛋白質組研究手段。雙向凝膠電泳技術及質譜基礎的蛋白質組學研究程序為樣品制備→等電聚焦→聚丙烯醯胺凝膠電泳→凝膠染色→挖取感興趣的蛋白質點→膠內酶切→質譜分析確定肽指紋圖譜或部分氨基酸序列→利用資料庫確定蛋白。蛋白質組研究要求有高解析度的蛋白質分離及准確、靈敏的質譜鑒定技術。凝膠電泳中蛋白質的著色不僅影響蛋白質分離的解析度，同時也影響後續的質譜鑒定。蛋白質的染色可分為有機試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色四類。
Unlu 等提出了一種熒光差異顯示雙向電泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白質組學分析方法。差異凝膠電泳(DIGE)是對2-DE 在技術上的改進，結合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒游標記的樣品，並第一次引入了內標的概念。兩種樣品中的蛋白質採用不同的熒游標記後混合，進行2-DE，用來檢測蛋白質在兩種樣品中表達情況，極大地提高了結果的准確性、可靠性和可重復性。在DIGE技術中，每個蛋白點都有它自己的內標，並且軟體可全自動根據每個蛋白點的內標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。DIGE 技術已經在各種樣品中得到應用。
高效液相色譜技術(HPLC)
盡管二維凝膠電泳（2-DE）是常用的對全蛋白組的分析方法，但其存在分離能力有限、存在歧視效應、操作程序復雜等缺陷。對於分析動態范圍大、低豐度以及疏水性蛋白質的研究往往很難得到滿意的結果。Chong 等使用HPLC/ 質譜比較分析惡性腫瘤前和癌症兩種蛋白質差異表達。利用HPLC 分離蛋白質，並用MALDI-TOF-MS鑒定收集的組分，從而在兩種細胞中的差異表達中對蛋白質進行定量分析。多維液相色譜作為一種新型分離技術，不存在相對分子質量和等電點的限制，通過不同模式的組合，消除了二維凝膠電泳的歧視效應，具有峰容量高、便於自動化等特點。二維離子交換-反相色譜(2D-IEC-RPLC)是蛋白質組學研究中最常用的多維液相色譜分離系統。
飛行時間質譜技術
表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜技術於2002 年由諾貝爾化學獎得主田中發明，剛剛產生便引起學術界的高度重視。SELDI 技術是蛋白質組學研究中比較理想的技術平台，其全稱是表面增強激光解吸電離飛行時間質譜技術(SELDI-tof)。其方法主要如下：通常情況下將樣品經過簡單的預處理後直接滴加到表面經過特殊修飾的晶元上，既可比較兩個樣品之間的差異蛋白，也可獲得樣品的蛋白質總覽。因此，在應用方面具有顯著優勢。SELDI 技術分析的樣品不需用液相色譜或氣相色譜預先純化，因此可用於分析復雜的生物樣品。SELDI 技術可以分析疏水性蛋白質，PI 過高或過低的蛋白質以及低分子質量的蛋白質( < 25 000) ，還可以發現在未經處理的樣品中許多被掩蓋的低濃度蛋白質，增加發現生物標志物的機會。SELDI 技術只需少量樣品，在較短時間內就可以得到結果，且試驗重復性好，適合臨床診斷及大規模篩選與疾病相關的生物標志物，特別是它可直接檢測不經處理的尿液、血液、腦脊液、關節腔滑液、支氣管洗出液、細胞裂解液和各種分泌物等， 從而可檢測到樣品中目標蛋白質的分子量、PI、糖基化位點、磷酸化位點等參數。
同位素標記親和標簽(ICAT)技術
同位素親和標簽技術是一種用於蛋白質分離分析技術，此技術是蛋白質組研究技術中的核心技術之一。該技術用具有不同質量的同位素親和標簽( ICATs) 標記處於不同狀態下的細胞中的半胱氨酸，利用串聯質譜技術，對混合的樣品進行質譜分析。來自兩個樣品中的同一類蛋白質會形成易於辨識比較的兩個不同的峰形，能非常准確的比較出兩份樣品蛋白質表達水平的不同。ICAT 的好處在於它可以對混合樣品直接測試；能夠快速定性和定量鑒定低豐度蛋白質，尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等；還可以快速找出重要功能蛋白質。
由於採用了一種全新的ICAT試劑，同時結合了液相色譜和串聯質譜，因此不但明顯彌補了雙向電泳技術的不足，同時還使高通量、自動化蛋白質組分析更趨簡單、准確和快速，代表著蛋白質組分析技術的主要發展方向。針對磷酸化蛋白分析以及與固相技術相結合ICAT技術本身又取得了許多有意義的進展，已形成ICA T 系列技術。
生物信息學技術
生物信息學在生命科學研究中起著越來越重要的作用。利用生物信息學對蛋白質組的各種數據進行處理和分析，也是蛋白質組研究的重要內容。生物信息學是蛋白質組學研究中不可缺少的一部分。生物信息學的發展，已不僅是單純的對基因組、蛋白質組數據的分析，而且可以對已知的或新的基因產物進行全面分析。在蛋白質組資料庫中儲存了有機體、組織或細胞所表達的全部蛋白質信息，通過用滑鼠點擊雙向凝膠電泳圖譜上的蛋白質點就可獲得

㈥ 蛋白質組學的研究手段有哪些原來這里已經有回答了，還不滿意，希望詳盡點。

一 雙向電泳。雙向電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)與質譜(mass spectrum, MS)的結合是最常見的蛋白質組學的研究手段。雙向電泳包括第一向等電聚焦(Isoelectric focusing, IEF)和第二向SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)。雙向電泳可以提供包含有分子量和等電點信息的二維圖譜
二 多維色譜法。在多維色譜法中，蛋白樣品通常先被消化成肽段，然後經過離子交換、反相HPLC(high-performance liquid chromatography)而被分離。該方法的中HPLC可以直接和質譜偶聯，可有效的分析極酸或極鹼、高度疏水等傳統2-DE方法難以分析的蛋白質，而且易於實現分析的自動化。
三 熒光差異凝膠電泳技術(differential in-gel electrophoresis, DIGE)。DIGE可用三種不同的熒光染料來分別對樣品進行標記，熒光染料可以通過醯胺鍵與蛋白質的賴氨酸ε-氨基共價結合。將標記的樣品混合然後在同一塊雙向電泳凝膠上分離。這樣在一塊雙向電泳凝膠上可獲得三幅圖像，即在一塊凝膠內分析不同的蛋白樣品。DIGE有效地改善了傳統2-DE的重復性。
四 定量蛋白質組學方法：
⑴ ICAT(isotope-coded affinity tags)方法。ICAT是用於定量蛋白質組學研究的穩定同位素標簽法的一種。在穩定同位素標簽法中，質譜可以通過識別標記的肽段和未標記的肽段之間的信號強度差異來達到定量的目的。在ICAT方法中，帶有生物素半分子的同位素標簽對樣品中蛋白質的半胱氨酸殘基進行標記，標記的蛋白樣品經過消化成為肽段後，經陽離子交換色譜和親和素親和純化，然後進入質譜鑒定。相同肽段在質譜上會表現為雙峰，峰的強度直接反應了該肽段對應的蛋白質在兩種樣品中的相對強度。ICAT的缺點是無法標記缺乏半胱氨酸殘基的蛋白質、會丟失轉錄後修飾信息、相同肽段由於標記上的差異在HPLC中會產生不一致的洗脫表現以及增加的生物素基團會增加質譜解析的復雜性[47][48]。

⑵ cICAT (cleavable isotope-coded affinity tags)。也是穩定同位素標簽法，基於ICAT。cICAT採用了13C和酸性可裂解生物素而克服了ICAT的部分缺點。

⑶ iTRAQ 。iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)法可同時分析多達四個不同樣品的，該方法不會丟失轉錄後修飾信息，因而可以用於信號轉導中的蛋白質磷酸化修飾的研究。

㈦ 鑒別蛋白質的方法有哪些

常見的蛋白質鑒定方法有：

一、最簡單的方法就是對所要鑒定的物體進行灼燒

二、使用化學葯劑進行化學反應來鑒定蛋白質

三、較為精準的方法是使用儀器進行蛋白質鑒定，如質譜儀等

在生物學研究中經常會遇到一些關於蛋白質鑒定的問題，如單一蛋白質或者簡單混合物的鑒定；對單一蛋白質的序列分析等。這一類蛋白質鑒定，在精密度上要求較高，所以幾乎都是採用質譜儀器，來對蛋白質進行精密鑒定。

質譜技術是鑒定蛋白質的其中一種平台技術。可用到的質譜儀有Thermo Fisher的Q Exactive質譜儀，LTQ Orbitrap Velos質譜儀，以及AB SCIEX的6500 Q TRAP質譜儀。所在鑒定機構的不同，在硬體品牌的使用上也會有不同。

蛋白質鑒定的流程一般分三大步：蛋白質提取、純化、鑒定。這個流程是一個將蛋白質層層「解剖」的過程，從中我們可以對蛋白分子量進行測定，蛋白膠點、膠條、IP樣品蛋白質進行鑒定，非變性質譜分析以及Pull-down靶蛋白質譜鑒定等，較為細致的去分析蛋白質中的各種物質、性質等。

㈧ 1. 蛋白質組學研究方法概述（上）

說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學院與康昱盛主辦的蛋白質組學網路大課堂整理而成，侵刪。該課程由上海交通大學系統生物醫學研究院助理研究員庫鑫博士所授。

大夥兒都知道，蛋白質組學（proteomics），是研究一種細胞或者一種生物體所表達的全部蛋白質。雖說現在基因組測序火得一塌糊塗，但是，我們不要忽略了，蛋白質才是執行生命體功能的基本單元，而且蛋白質都是通過形成各種復合物，組成通路網路，去行使各種生物學功能的！所以，有很多生物學問題只能在蛋白質層面上去研究去探索，而且需要站在系統的層面去考察，比如說：蛋白-蛋白相互作用、蛋白的細胞定位、翻譯後修飾、信號通路及代謝通路的調控和功能等。這就是為啥蛋白質組學如此重要啦！

既然重要，科學家們自然是想盡辦法來研究了！最開始使用的技術就是傳說中的雙向凝膠電泳（2-DE），由於解析度低、蛋白質重疊等各種問題，無論是通量還是准確度，都不盡如人意。當質譜技術興起以後，就迅速被替代了。

說起質譜技術的誕生，估計很多小夥伴都聽過那個著名的diao絲逆襲的段子，講的就是2002年諾貝爾化學獎得主田中耕一，作為蛋白質譜發明人之一，由於一個不小心在實驗時錯加了甘油，結果神奇地將質譜技術引入到鑒定生物大分子的應用領域。想想，大到整個人類的科技發展史，小到每個個體的人生，都充滿了多少不可思議~

當質譜技術與蛋白質組學碰到了一起，真是天雷引了地火，產生出強烈的化學反應，迅速引爆整個學科的發展！也就十幾年的時間吧，蛋白質組學的研究目標從細胞模型、動物模型，到人的體液、組織等人體樣本，應用范圍的生物復雜度越來越高。研究目的呢，也從最初的肽段序列推導，到多肽和蛋白質的定性定量分析，翻譯後修飾，再到如今成為新熱點的靶向蛋白質組學，總之，勢不可擋啊！

說到靶向蛋白質組學，咱們都知道，一直以來蛋白質組學的應用領域主要是針對基礎生物學，比如研究通路、蛋白復合物、互作網路，表徵細胞和組織的類型，觀察細胞周期內蛋白質的表達等。近年來，由於技術的飛速發展，蛋白質組學開始被用於醫學研究和葯物研究。比如說葯物研究，國內可能用得還不多，但在歐美已經開始越來越廣泛。以肝毒性為例，蛋白質組學可以為葯物研發前期的肝毒性評估提供研究手段。

那麼，怎麼將蛋白質組學應用到臨床及葯物研發中呢？就是需要靶向蛋白質組學技術了！以前，蛋白質組學技術主要用於發現新的未知物，比如肽段、蛋白復合物、蛋白的翻譯後修飾等。這部分的應用很廣，技術門檻比較低，方法比較通用。但問題是，這種方法思路沒辦法應對大量的臨床樣本，可重復性和准確性達不到要求。

於是，靶向分析開始興起，就是說，分析之前我們就明確知道需要分析的物質是什麼，然後把它挑出來，進行一個精確的定量和分析！我們不需要一次性驗證成千上萬的蛋白，但我們需要在成百上午的樣本中驗證十幾種或者幾十種我們關心的蛋白質，而且這些蛋白質常常都是濃度很低的蛋白，用傳統的方法基本上只有被遺漏的命（後面我會詳細講為什麼會遺漏）。有了靶向技術，對於研究臨床診斷的生物標志物，就有了更大的可能和更強的支撐了！

那麼接下來，根據老師講課的思路，我就從定性檢測、定量檢測和靶向蛋白質組學三個方面來分享下聽課的收獲。

無論是定性還是定量檢測，樣品制備是跑不掉的准備工作。用於質譜的蛋白質樣品，來源非常廣泛，只要你是包含了蛋白質的東西，都可以作為來源。對於復雜的樣品，比如人體體液或組織樣本，蛋白質的提取及去高峰度，常常需要復雜的精細的處理，而且處理流程根據樣本和研究目的的不同而不同。這部分內容呢，第二講「樣品前處理」會詳扒，感興趣的小夥伴可以期待我的下一篇聽課筆記吧~

話說，蛋白質的定性檢測有兩種思路：Bottom-up和Top down。Top down是指從一個完整的蛋白出發，在質譜中進行碎片化處理，通過對碎片分子的檢測，推導出蛋白的序列。而在使用中真正占絕大多數是Bottom-up方法，也就是我們常說的shotgun方法，它充分利用了蛋白質自身的特點：可以被特定的酶在特定的位點切斷。基本思路是，先用蛋白酶把蛋白序列進行酶切，再針對酶切後的肽段進行鑒定，所以進入質譜的檢測對象永遠是肽段，再根據肽段序列再推導出蛋白序列。

1. 樣本處理 ：拿到蛋白來源的各種樣本，進行前處理和優化。

2. 蛋白分離 ：根據研究需要，用凝膠分離，提取所需的蛋白，或者不分離，全部拿來檢測，需要注意去雜質；

3. 酶切 ：用序列特異性的酶，對蛋白進行酶切；

4. 肽段分離 ：酶切後的肽段進入HPLC（高壓液相色譜），這也就是我們常說的LC-MS中的LC，肽段會因為在色譜柱填料上的保留時間的不同，得到預分離；

5. 電離 ：分離後的肽段，加電壓使其離子化（ESI）；或者用MALDI基質輔助的激光解離，就不需要HPLC的過程；

6. 質譜解析 ：將帶上電荷的肽段送入質譜，肽段會在磁場中發生偏轉（質譜儀的基本原理），在質譜里收集信號，得到譜圖。

7. 搜庫 ：用搜索軟體對質譜圖進行自動化的分析，得到肽段及蛋白序列信息。

換個角度，對Shotgun方法的流程，我們可以這樣來總結：

這裡面最關鍵的一個指標，我們叫Peptide-Spectrum matching（PSM），就是指譜圖與肽段的匹配。匹配得越好，則反推出的蛋白就越准確。這個匹配的過程，也就是我們常說的搜庫。那麼接下來我就來分享一下從課程中學習到的搜庫背景知識、搜庫工具和演算法，以及對搜索結果的評估。

質譜，聽上去很高大上，無論有多貴重，都是由三部分組成的：離子源+質量分析器+檢測器。

一台質譜可以不止一個離子源＼分析器＼檢測器，可以把幾種串聯起來，針對不同分析需要來使用。

離子源

我們先來說說離子源。蛋白質譜所使用的ESI（Electrospray ionization）電噴霧離子化，對蛋白質組學來說是一個標志性的發明！因為是直接從液相進行離子化，使它與LC（液相色譜）的聯用變得更加容易了，我們可以先用LC將非常復雜的肽段混合物進行預分離，減少每次分析物的復雜度，然後分離的肽段可以直接進入ESI，形成電離噴霧。

那麼，ESI噴霧是怎麼形成的呢？簡單來說，分離柱前端有一個小開口，被分析物根據質量及電荷的不同，依次通過前端的小開口。小開口處加了電壓，剛開始，靜電力與表面張力相同，當加大靜電力使它大於表面張力的時候，液膜破裂，形成無數帶電的小液滴，就形成噴霧了。像現在比較新的nanoESI技術，LC的流速就更加慢，離子化的效果也更好。覺得以上描述還不夠形象的童鞋，直接看圖吧：

質量分析器

說完了離子源，接下來我們來說質量分析器，這是質譜儀里最重要的一部分。我們通常聽到的各種質譜儀的名字，就是根據質量分析器的類型來命名的。我們樣品中各組分在離子源中發生電離，並經加速電場的作用後，形成離子束，進入質量分析器中。質量分析器將帶電離子根據其質荷比加以分離，記錄各種離子的質量數和豐度，用於後續定性與定量的分析。

質量分析器有兩個主要的技術參數：質量范圍和解析度。質量范圍是指是所能測定的質荷比的范圍，它決定了咱們能檢測到的離子的范圍。比如，ESI離子源能產生許多m/z大於3000的離子，如果你選的質量分析器的上限達不到3000，那麼3000以上的離子你就檢測不出來了。

然而，另一個更為重要的指標，就是質量分析器的解析度！先上個公式描述：

解析度=觀測的一個質譜峰的質荷比/半峰高處的峰寬（FWHM）

啥意思呢？比如下圖中最左邊的那個峰，它的質荷比是1,085.55，峰高一半的地方的峰寬值是0.217，於是：

解析度=1,085.55/0.217=5,000

如果這么講還是不太明白，那你可以簡單理解為，質譜解析度越高，我們將得到越尖越細的譜峰。你可能會問：譜峰又尖又細的好處是什麼？這是個好問題！事實上，解析度可以表徵兩個相鄰的譜峰在質譜中被區分開的能力。大家通過下圖感受一下不同解析度的質譜儀能給我們多麼不同的譜峰圖。

圖中以Glucagon（胰高血糖素）為例，展示了不同解析度的質譜儀給出的譜峰。當解析度是1000時，只能看一個很寬的峰（藍色）；解析度增加到3000時，峰窄一些（紅色），但還感受不到明顯的差別；當提高到10000時，很明顯能看到，其實這里包含了8個峰（綠色）；再提高到30000的時候，半峰寬更窄，兩個相鄰的峰可以徹底地被分開（黑色）。顯然，我們在解析度為1000或3000，不能准確的檢測被分析肽段的精確分子量， 從而導致譜圖無法匹配或者發生錯配。

不同的質量分析器有不同的解析度，通常的順序是：傅里葉變換質譜解析度最高，但造價太貴；其次是Orbitrap（軌道阱系列），解析度遠遠高於其它質譜；再次是TOF（時間飛行質譜）；然後是離子阱（Ion Trap）；最後是四級桿質譜（Quadrupole）。

這里我多說一句，解析度高固然好，但價格肯定就貴，選擇質譜儀的時候要根據咱們自己的研究目的以及預算范圍啦！

二級質譜

然而，要對肽段進行鑒定，一級質譜顯然是辦不到的，我們沒法根據肽段離子m/z的值就推斷出這個肽段由哪些氨基酸殘基組成（可能的組合非常多），以及序列順序是怎麼樣的，對吧？所以，鑒定肽段還需要二級質譜。

什麼是二級質譜呢？簡單來說，肽段混合物通過一級質譜得到了一級譜圖，然後從中選擇一個肽段，通過一些方法，比如，與隨性氣體進行碰撞，把肽段碰碎，得到碎片離子，再形成二級譜圖。我們通過觀察碎片離子的質量分布來推斷肽斷的殘基組成，最後再反推出蛋白質是什麼。上個圖，幫助大家理解一下二級質譜是怎麼來的。

在上一段，我提到是從一級質譜中「選擇」一個肽段進入二級質譜。這里看似講得雲淡風輕，事實上怎麼選卻是一個很關鍵的問題！通常選擇的方法我們可以叫做「TOP」法（這是我自己起的名字），比如TOP15就是指從一級譜里選前15個高度的峰，每一次分離一個肽段，然後對這個肽段進行掃描，得到二級譜圖。

大家發現了沒有？如果一個肽段在一級譜圖中沒有進入TOP15，那它連打二級譜圖的資格都沒有！原來質譜的世界競爭也是如何殘酷！二級質譜能掃描哪些肽段是由一級質譜決定的，所以我們將這種方法稱為「數據依賴性採集（DDA, data dependent acquisition）！

明白了吧，DDA這個名字就是這么來的！下次大夥兒再聽到有人說DDA，心裡不會再一百個問號飛過了吧？

咱們細想一下就不難發現，如果一個蛋白的濃度不夠高，也就是說，它的肽段在一級譜圖中很難成為那些TOPs，那麼它能進入二級質譜的可能性基本上沒有。這就是為什麼低峰度蛋白很難被鑒定到！這也就是為什麼我們在做比如血液這種樣品的時候，一定要去除血紅蛋白等高峰度蛋白（如果你想鑒定的蛋白不是血紅蛋白的話）！

很顯然，DDA方法的局限性就擺在那裡！這叫想要研究低峰度蛋白的科學家們怎麼忍？於是，一種叫做數據非依賴性採集（DIA）的新方法就應運而生了！關於這種方法的原理，下一篇推文會詳扒。

我們再通過以下這個圖來感受一下一級譜圖與二級譜圖之間的關系：

比如，第一個時間點，我們先進行MS1掃描，然後選一個峰高的肽段進行MS2掃描，依次類推。在一些掃描速度比較快的質譜儀里，一個MS1譜圖可以進行80張MS2的掃描。

鑒定碎片離子

好，我們搞清楚了二級質譜是怎麼來的，那麼我們怎麼根據檢測到的離子信息來推測這是什麼氨基酸呢？可能你會說，這還不簡單么？根據分子量呀！

沒錯，不同的氨基酸，它的分子量不就是一個簡單的值嗎？然而，這件事卻並沒有這么簡單，因為這個世界上還存在一個神奇的東西，它的名字叫同位素！

比如說碳元素，最常見的是原子量12的這種，我們叫C12，然而它還有一個同樣很穩定的好基友，C13（多一個中子）。於是，我們得考慮到這兩種穩定同位素的含量（網路說C13占 1.11%，C12佔98.89%），對於一個氨基酸而言，我們就會得到兩個不同的分子量：

為啥說平均呢？因為當肽段分子量越大，含有各種同位素的可能性及不同組合就越多，我們如果把每一種組合都算一遍分子量，這樣會得到一個長長的list，到時候做譜圖匹配時用哪一個值呢？也沒譜。所以乾脆用一個平均值來表示。

我們通過下表來感受一下各種不同的氨基酸殘基的單同位素分子量與平均分子量有多大的區別：

可能你又會問，這兩個不同的分子量分別在什麼情況下用呢？這里又要說到解析度了，如果咱們用的是高解析度質譜儀，不同的同位素峰會被明顯地分開，也就是說，譜圖里我們能看幾個同位素峰，這時我們就可以使用單同位素分子量，可以與相應的單同位素峰准確對應。但在低解析度質譜儀里，這些峰很可能混在一起，看上去只是一個峰，這種情況下，也沒辦法，只能用平均分子量去近似一下了。

下面這個圖可以很形象地展示出，單同位素分子量與平均分子量在質譜圖上差別有多大。在高分辨質譜看來，這完全就是兩種不同的離子了。上面我們也說了，根據平均分子量來計算，結果並不準確，但用單同位素分子量來計算，就可以准確對應了。

除了同位素，還有一個因素我們也需要考慮，那就是肽段碎裂進入二級質譜時，可能會形成三種不同的離子類型，這就是我們通常所說的by離子，ax離子和cz離子。

之所以會形成不同的離子對，是因為不同的碎裂方法，造成肽段斷裂的位置不同。大夥兒看看上面這個圖就明白了。當我們使用CID（碰撞誘導解離）或HCD（High-energy C-trap Dissociation）碎裂時，與惰性氣體碰撞的是C-N鍵這里，C端生成y離子，N端生成b離子，這是二級質譜產生的最常見的離子對了。當我們使用ETD（電子轉移解離）碎裂時，因為有一個電子反應的過程，在加上電子後才產生的碎裂，它的斷裂位置可能出現在N-C鍵這里，形成cz離子，而TOF類儀器可能會產生ax離子。

離子類型的信息需要傳遞給後續的搜庫步驟（通常我們在搜庫軟體中指定了儀器類型，軟體就會自動匹配離子類型），計算機需要模擬最可能的碎裂位置，生成對應的理論譜圖，然後拿來與實際譜圖比對。我們以by離子為例，來看看對一個肽段來說，它可能碎裂成哪些碎片離子：

那麼它可能會生成如下這樣的譜圖：

從譜圖上看，這個肽段所有的by離子都檢測到了。通常來說，對於豐度不錯，長短合適的肽段，在高精度質譜儀上被完整捕獲到的情況是很常見的。通常情況下50%-80%的by離子都能被捕獲到。

下篇繼續講定性檢測里的搜庫工具、結果評估，以及定量檢測的各種背景知識。

㈨ 蛋白質組學常用的研究方法

酵母雙雜交系統、抗體晶元、LCM技術、mic Solution Inc、SPR技術、色譜分離技術、雙相電泳技術、有機質譜等等。
LCM技術獲得的細胞可以用於蛋白質樣品的制備。
蛋白質樣品中的不同類型的蛋白質可以通過二維電泳進行分離。
膠染色後可以利用凝膠圖象分析系統成像，然後通過分析軟體對蛋白質點進行定量分析，並且對感興趣的蛋白質點進行定位。
Genomic Solution可以為研究者提供除質譜外的所有蛋白質組學研究工具，包括二維電泳系統，成像系統及分析軟體，膠切割系統，蛋白質消化濃縮工作站，點樣工作站等；同時還可以提供相關試劑和消耗品。
蛋白質相互作用的研究，酵母雙雜交和噬菌體展示技術無疑是很好的研究方法。
LCM-二維電泳-質譜的技術路線是典型的一條蛋白質組學研究的技術路線，除此以外，LCM-抗體晶元也是一條重要的蛋白質組學研究的技術路線。

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詳細資料請參考：on
http://proct.bio1000.com/101969/

㈩ 蛋白質組學主要包括哪些分析技術及各自特點

為探究生物進程的分子機制，需要確定介導這個過程的蛋白質-蛋白質間的相互作用。研究蛋白質間相互作用的主要技術總結如下：
一、酵母雙雜交系統
酵母雙雜交系統是當前廣泛用於蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法。其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合後，誘餌蛋白結合於報道基因的啟動子，啟動報道 基因在酵母細胞內的表達，如果檢測到報道基因的表達產物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術微量化、陣列化後則可用於大 規模蛋白質之間相互作用的研究。在實際工作中，人們根據需要發展了單雜交系統、三雜交系統和反向雜交系統等。Angermayr等設計了一個SOS蛋白介 導的雙雜交系統。可以研究膜蛋白的功能，豐富了酵母雙雜交系統的功能。此外，酵母雙雜交系統的作用也已擴展至對蛋白質的鑒定。
二、噬茵體展示技術
在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當噬菌體生長時，表面就表達出相應的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若含目的蛋白，就會與相應抗體 特異性結合，這被稱為噬菌體展示技術。此技術也主要用於研究蛋白質之間的相互作用，不僅有高通量及簡便的特點，還具有直接得到基因、高選擇性的篩選復雜混 合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結合的特異性等優點。目前，用優化的噬菌體展示技術，已經展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的cDNA文 庫，並分離出了人上皮生長因子信號傳導途徑中的信號分子。
三、等離子共振技術
表 面等離子共振技術(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成為蛋白質相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種納米級的薄膜吸附上「誘餌蛋白」，當待測蛋白與誘餌蛋白結合後，薄 膜的共振性質會發生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況。SPR技術的優點是不需標記物或染料，反應過程可實時監控。測定快速且安全，還可用於檢測 蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。
四、熒光能量轉移技術
熒 光共振能量轉移（FRET ）廣泛用於研究分子間的距離及其相互作用; 與熒光顯微鏡結合，可定量獲取有關生物活體內蛋白質、脂類、DNA 和RNA 的時空信息。隨著綠色熒光蛋白（GFP）的發展，FRET 熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內分子的動態性質。提出了一種定量測量FRET效率以及供體與受體間距離的簡單方法，僅需使用一組濾光片和測量一個比 值，利用供體和受體的發射譜消除光譜間的串擾。該方法簡單快速，可實時定量測量FRET 的效率和供體與受體間的距離，尤其適用於基於GFP 的供體受體對。
五、抗體與蛋白質陣列技術
蛋 白晶元技術的出現給蛋白質組學研究帶來新的思路。蛋白質組學研究中一個主要的內容就是研究在不同生理狀態下蛋白水平的量變，微型化，集成化，高通量化的抗 體晶元就是一個非常好的研究工具，他也是晶元中發展最快的晶元，而且在技術上已經日益成熟。這些抗體晶元有的已經在向臨床應用上發展，比如腫瘤標志物抗體 晶元等，還有很多已經應用再眼就的各個領域里。
六、免疫共沉澱技術 免 疫共沉澱主要是用來研究蛋白質與蛋白質相互作用的一種技術，其基本原理是，在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育後再加入與抗體特異結合的結合於 Pansobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若細胞中有正與興趣蛋白結合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復合物：「目的蛋白—興趣蛋白—抗興 趣蛋白抗體—SPA\|Pansobin」，因為SPA\|Pansobin比較大，這樣復合物在離心時就被分離出來。經變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，復合物 四組分又被分開。然後經Western blotting法，用抗體檢測目的蛋白是什麼，是否為預測蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內天然與興趣蛋白結合的，符合體內實際情況，得到的蛋白 可信度高。但這種方法有兩個缺陷：一是兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；二是必須在實驗前預測目的蛋白是什麼，以選擇 最後檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。
七、pull-down技術
蛋 白質相互作用的類型有牢固型相互作用和暫時型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復合體常見，最好通過免疫共沉澱（Co-IP） 、Pull-down技術或Far-western法研究。Pull-down技術用固相化的、已標記的餌蛋白或標簽蛋白（生物素-、PolyHis-或 GST-），從細胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。通過Pull-down技術可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關系，從體 外傳路或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關系。