⑴ 《肺癌MRD的檢測和臨床應用共識》
2021年3月肺高論壇上最終達成了「肺癌MRD的檢測和臨床應用共識」。
——肺癌分子(微小)殘留病灶(MRD)的檢測和臨床應用共識
共識一：MRD的概念
1、肺癌分子殘留病變，指的是經過治療後，傳統影像學(包括PET/CT)或實驗室方法不能發現，但通過液體活檢發現的癌來源分子異常，代表著肺癌的持續存在和臨床進展可能；
2、肺癌分子異常：指的是在外周血可穩定檢測出豐度≥0.02％的ctDNA，包括肺癌驅動基因或其他的Ⅰ/Ⅱ類基因變異。
共識二：MRD檢測的基本技術要求
1、MRD檢測的基本技術，包括Tumor-informed assays(個體化定製)和 Tumor agnostic assays( NGS panel和多組學技術)，目前均處在探素階段，需要前瞻性研究確定其敏感性、特異性和預測價值；
2、採用二代測序技術(NGS)，所選的多基因 panel中必須覆蓋患者Ⅰ/Ⅱ類基因變異，基本技術標準是可穩定檢出豐度≥0.02％的ctDNA；
3、驅動基因陽性的非小細胞肺癌，MRD的分子panel應包括該驅動基因；
4、MRD評估報告中必須包括cfDNA豐度， ctDNA豐度，所檢測基因VAF值；
5、需要建立針對免疫治療的MRD標准。
共識三：可手術早期肺癌MRD的應用
1、早期非小細胞肺癌患者根治性切除術後，MRD陽性提示復發風險高，需進行密切隨訪管理。建議每3～6個月進行一次MRD監測；
2、建議基於MRD開展可手術非小細胞肺癌的圍術期臨床試驗，盡可能提供圍術期精準治療方案；
3、建議分別探索MRD在驅動基因陽性和驅動基因陰性兩種類型患者中的作用。
共識四：局部晚期非小細胞肺癌MRD的應用
1、局部晚期非小細胞肺癌根治性化放療後完全緩解患者，建議檢測MRD，有助於判斷預後和制定進一步的治療策略；
2、建議開展基於MRD的化放療後現固治療的臨床試驗，盡可能提供精準的鞏固治療方案。
共識五：晚期非小細胞肺癌MRD的應用
1、晚期非小細胞肺癌目前缺乏針對MRD的相關研究；
2、晚期非小細胞肺癌系統治療後完全緩解患者，建議檢測MRD，有助於判斷預後和制定進一步的治療策略；
3、建議在完全緩解患者中開展基於MRD的治療策略研究，盡可能延長完全緩解持續時間，使患者能最大獲益。
⑵ MRD（微小殘留病灶）檢測的原理、優勢和不足
引言
惡性血液病學領域有眾多三個字母的縮寫: MDS（ myelodysplastic syndrome， 骨髓增生異常綜合征）、CML（chronic myeloid leukemia，慢性髓性白血病）、ALL（acute lymphoblastic leukemia，急性淋巴細胞白血病）、CLL（chronic lymphoblastic leukemia，慢性淋巴細胞白血病） 等等，不勝枚舉。
MRD，即可測量的殘留疾病（Measurable Resial Disease）, 也稱為最小殘留病灶（minimal resial disease），已經成為另一個血液腫瘤領域最常見的三字母縮寫。
MRD，是指白血病/淋巴瘤/骨髓瘤患者經治療緩解後，體內仍殘留少量癌細胞的狀態，最終可能會引起疾病復發。
MRD檢測逐漸成為判斷療效和預後的預測指標之一。
MRD檢測指的是什麼？
MRD檢測可以識別出傳統方法可能檢測不到的少量惡性細胞。
傳統檢測方法，比如免疫組化或免疫熒光，檢測惡性細胞的敏感度大約為100個細胞中能檢測到1個細胞（1%）。
與傳統檢測方法相比，NGS（next-generation sequencing，二代測序）或NGF（ next-generation flow cytometry，二代流式），可以顯著提高MRD檢測的敏感性。
NGS和NGF檢測MRD惡性細胞的敏感度低至10^-5（0.001%或10萬分之一的惡性細胞），甚至10^-6（0.0001%或100萬分之一）。
MRD的檢測樣本可以是外周血（如慢性淋巴細胞白血病），也可以是骨髓抽吸液（如多發性骨髓瘤和急性白血病）。
對於治療後達到完全緩解（CR，complete response）的患者，NGS或NGF檢測能夠將MRD陽性與MRD陰性的患者區分開來。
MRD陽性的閾值因疾病（或臨床試驗）不同而異。急性骨髓性白血病（AML）通常設定為10^-4，而在多發性骨髓瘤中則為10^-5。
NGS和NGF如何檢測MRD？
NGS通過高通量測序來檢測惡性腫瘤的特異性基因序列。
NGF使用多色標記抗體檢測惡性腫瘤細胞表面的特定標記分子。
MRD檢測時，NGS和NGF之間如何做出選擇？
需要考慮的關鍵因素有2個：
（1）NGS可以對儲存的組織樣本（如石蠟包埋組織或凍存組織）進行檢測，而NGF則需用新鮮樣本進行檢測（因為死亡細胞表面的標記物通常會脫落）。
（2）NGF通過異常免疫表型分子來識別惡性細胞，而NGS通過已知的腫瘤基因突變來識別惡性細胞。
在最佳條件下，NGS和NGF檢測對MRD的靈敏度均能達到10^-5和10^-6之間。
MRD陰性是否意味著病人處於完全緩解期？
並不總是如此。
單一的MRD檢測並不能完全說明問題。
例如，一個骨髓瘤患者骨髓活檢MRD陰性，但仍可能存在活動性漿細胞瘤的影像學表現。另外，骨髓瘤患者MRD陰性，但血清M蛋白仍有可能陽性（骨髓瘤治療完全反應的定義是，強化治療後血液中M蛋白完全被清除）。
此外，取樣或技術誤差也會干擾MRD的檢測結果。
對於像慢性淋巴細胞白血病（CLL）或急性淋巴細胞白血病（ALL）這樣的疾病，取外周血進行MRD檢測可以避開采樣誤差（與骨髓抽吸液相比），但敏感性可能會打折扣。
對骨髓抽吸液進行MRD檢測，抽吸液的稀釋也可能會影響MRD的檢測結果。這也是為什麼要用第一次抽出的骨髓液進行MRD檢測的原因。
在臨床實踐中，MRD檢測的意義有多大？
除了臨床研究，昂貴的MRD檢測還很少（如果有的話）能明確改變臨床實踐。
B細胞ALL患者在治療達到完全緩解後，如果進行異體造血幹細胞移植，MRD陰性患者比MRD陽性患者的預後更差。因此，對於B細胞ALL，MRD檢測具有判斷預後的臨床價值。
另外，有臨床研究嘗試根據MRD檢測結果調整治療強度，甚至停止治療，包括CAPTIVATE研究（伊布替尼/維尼曲松治療CLL）和MASTER研究（Dara-KRd療法，即達雷妥尤單抗、卡非佐米、來那度胺和地塞米松，治療骨髓瘤）治療骨髓瘤。
然而，由於存在取樣誤差、檢測技術差異和疾病異質性，MRD檢測有其局限性。
因此，MRD檢測的臨床價值還需要對每種特定疾病進行前瞻性研究。
MRD檢測在臨床研究中的意義何在？MRD陰性是臨床試驗中可接受的替代終點嗎？
MRD檢測確實具有判斷預後的臨床價值。
針對骨髓瘤、B細胞ALL和AML的Meta分析顯示，與沒有達到MRD陰性的患者相比，達到MRD陰性的患者有更好的預後。
然而，如果在有治療反應與無治療反應患者之間比較MRD檢測的預後價值，是存在邏輯漏洞的。
為什麼這么說呢？
因為，這本質上是將不同腫瘤生物學特性之間進行比較。MRD陰性不僅僅反映治療效果，也是疾病本身的腫瘤生物學特性的比較。
我們來做一個類比。
一個12周齡大的嬰兒能睡一整個晚上，父母自然很開心，不必半夜起床喂孩子或哄睡孩子。
然而，孩子的睡眠表現如此好，是歸功於睡眠訓練，還是安撫奶嘴的作用，抑或是寶寶本身就具備的天賦，就不好說了。
總結
最新MRD檢測技術（二代測序和二代流式）的優勢和不足總結如下表：
在未來幾年，MRD檢測在惡性血液病中的應用可能會繼續增加，但前提是MRD的檢測方法學不斷優化，並被更多臨床試驗驗證。
雖然MRD檢測是一個令人興奮的概念，但MRD陰性是否可以作為公認臨床療效終點（如總生存期）的替代終點，還需要精心設計的臨床試驗來驗證。
⑶ MRD微小殘留和融合基因什麼區別
MRD微小殘留是看殘留的白血病細胞是否存在以及存在多少，如果是陰性的，那麼患者的預後就越好。
MRD檢測可以用很多方法檢測，例如：流式檢測白血病細胞，RT-PCR檢測融合基因，或者測序檢測基因突變等；
當一種白血病有標志性的融合基因時，就可以通過檢測這種標志性的融合基因來判斷MRD微小殘留的情況。
所以，MRD微小殘留檢測是一項臨床目的，符合條件的情況下，檢測融合基因是一種手段。
⑷ MRD檢測技術革新助力腫瘤精準醫療
MRD（Minimal Resial Disease），即微小殘留病灶，指癌症患者在治療中或治療後體內仍有殘留的惡性腫瘤細胞存在，細胞壞死或凋亡過程中釋放出腫瘤循環DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）。同時也有NCCN指南和專家共識將MRD表示為Measurable Resial Disease，即可測量殘留病灶[1]。MRD會引起癌症患者術後腫瘤復發，所以癌症患者需要監控MRD，監測術後腫瘤復發風險。
基於檢測ctDNA的技術因其高靈敏度和無創、便捷等特點，優於傳統的臨床或影像學方法鑒定出有腫瘤復發的患者。但是ctDNA的檢測受大量游離DNA（cell-freeDNA，cfDNA）背景信號影響。因此，MRD檢測應使用高靈敏度的檢測技術。目前檢測MRD的技術眾多（詳見圖2），而最廣泛使用的檢測技術是其中三種：
1） 多參數流式細胞術（ MFC），是一種快速、定量鑒定癌細胞的方法，其峰值靈敏度為0.01%，即1萬個正常細胞中的1個癌細胞。6色（或更多）流式細胞術分析是檢測異常MRD免疫表型的最常用方法。
2）聚合酶鏈式反應技術，分為qPCR或RT-qPCR，可以根據其特有的遺傳變異，如突變或染色體變異識別惡性腫瘤細胞；本質上是癌細胞的特定DNA片段被復制和擴增，使它們更容易檢測和計數，因此即使癌細胞數量非常少，也能通過PCR檢測出基因異常；
3）NGS是一種極為敏感的DNA測序方法，其峰值靈敏度為0.0001%，即100萬個正常細胞中有1個癌細胞。NGS可以檢測B/T細胞抗原受體基因的克隆性重排，作為新興的MRD檢測方法，已受到國內外專家認可並推薦。2017年版國際臨床實踐指南（NCCN）、和2017年版《中國多發性骨髓瘤診治指南》均推薦NGS作為MRD檢測方法。
總的來說，臨床應用中，應根據不同治療目的，選擇合適的MRD檢測方法。qPCR及RT-qPCR檢測MRD的靈敏度較MFC高，但更為費時。NGS作為MRD檢測的最新技術，進一步提高了MRD檢測的靈敏度，對於評價治療療效、預測疾病復發、實施精準治療具有重要的指導意義。
MRD檢測最成熟也是最主要的應用是血液腫瘤，已成為NCCN臨床標准實踐的一部分，FDA唯一批準的MRD檢測產品也僅用於血液疾病。但隨著很多臨床試驗的推進，MRD近年也在慢慢擴展到實體腫瘤中，如乳腺癌，肺癌，結直腸癌，前列腺癌等，並以實驗室自建方法（LDT）的方式參與臨床決策【3-6】。目前實體腫瘤MRD的檢測難度較大，主要體現在兩方面：
1、不同實體瘤個體化差異大，即每個患者個體中僅攜帶非常少量、相同的基因突變，對panel的設計要求高。
2、早期實體瘤釋放到外周血的ctDNA含量非常少（低於1%），對檢測靈敏度要求極高。
針對上述難題有兩種解決方案：①使用NGS大panel；②開發個性化的MRD檢測panel。也就是目前採用ctDNA檢測MRD主要存在兩大技術路線：tumor-agnostic（僅基於血漿檢測的固定panel）和tumor-informed（基於腫瘤組織測序的ctDNA個性化定製方案)[7]。
由於組織先驗（tumor-informed）策略在檢測靈敏度上的優勢，目前許多腫瘤檢測公司基於此進行開發。其技術路線為先檢測與腫瘤發生發展相關基因的變異信息，形成每個患者的個性化基因變異圖譜，將其納入MRD檢測；最後通過液體活檢定向追蹤患者血液中的個性化變異。
如上圖所示，通過採集患者腫瘤組織進行全外顯子測序（WES），針對每位患者選取腫瘤特異性的克隆位點進行個性化定製NGS Panel（或使用多重PCR方法)，在監測時提取血漿中的ctDNA進行超高深度測序，通常在術後約四周進行MRD檢測。 在一項研究中，相對於固定panel測序策略，可為病人多爭取42%的時間採取適合的對策[6]
與此同時，也有研究引入新的方法學進一步升級MRD檢測。鑒於甲基化在腫瘤發生早期已有顯著變異、變異位點數目豐富，這些表觀基因組「標記」在不同患者之間甚至在不同癌症之間更相似，使其成為新MRD檢測方法的可能（尤其是針對早期患者）。針對甲基化位點進行設計個性化Panel，這種多組學捕獲可以對腫瘤治療全過程進行精準、高效地全程監測。
1、 Panel 卓越的性能表現
不論是10Kb小Panel還是42Mb WES，伯科液相捕獲晶元均展現出卓越的性能：優異捕獲效率與均一性。因此能保證個性化的panel檢測靈敏度，為MRD檢測提供優質的工具。
2、 豐富的引物/探針設計經驗，極速定製周期
快速針對患者選取腫瘤特異性的克隆位點設計引物/NGS Panel，最大程度實現MRD檢測高特異性的同時，七天極速定製周期能極大滿足臨床術後約四周進行MRD檢測的需求。
3、 不管定製個性化Panel還是Spike in，極大用戶客戶需求
TRACERx研究發現大約12%的患者復發時是一個新原發腫瘤【9】。部分檢測機構為了提高MRD檢測靈敏度的同時降低檢測成本，採用基礎模塊（癌症中常見的熱點驅動基因突變位點）+個體化模塊（個體化突變位點）組合個體化定製panel代替原有大panel進行MRD檢測。不論是小區域還是大區間，不論是Spike-in到小Panel還是全外顯子，伯科探針體系均能勝任，實現了MRD檢測廣度和深度上的完美結合。
4、 擁有多組學共捕獲Panel開發經驗
例如DNA&RNA共捕獲技術。隨著檢測技術的進步，可進一步支撐DNA&Methyl共捕獲等技術流程的開發。
[1] Minimal Resial Disease (MRD). (n.d.). Minimal Resial Disease (MRD). Leukemia & Lymphoma Society.
[2] Chen Xueyan, Wood Brent L., Monitoring Minimal Resial Disease in Acute Leukemia: Technical Challenges and Interpretive Complexities, Blood Reviews (2016), doi:10.1016/j.blre.2016.09.006
[3] Coakley Maria, Garcia-Murillas Isaac, Turner Nicholas C, Molecular Resial Disease and Adjuvant Trial Design in Solid Tumors. [J] .Clin Cancer Res, 2019, 25: 6026-6034.
[4] NCCN Guidelines https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/default.aspx
[5] Abbosh C, Birkbak NJ, Wilson GA, et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution [published correction appears in Nature. 2017 Dec 20]. Nature. 2017;545(7655):446-451. doi:10.1038/nature22364
[6] Coombes RC, Page K, Salari R, et al. Personalized Detection of Circulating Tumor DNA Antedates Breast Cancer Metastatic Recurrence. Clin Cancer Res. 2019;25(14):4255-4263. doi:10.1158/1078-0432.CCR-18-3663
[7] Prof.Jeanne Tie, 2020.ASCO-GI
[8] Shannon chuai，ctDNA Methylation & Mutation — A Two-Dimensional MRD Method Identifies More At-risk Patients and Predicts DFS in NSCLC.
[9] Zviran, A. et al. Genome-wide cell-free DNA mutational integration enables ultra-sensitive cancer monitoring. Nat Med 26, 1114–1124 (2020). https://doi.org/10.1038/s41591-020-0915-3