腫瘤組織標本研究方法

㈠ 病理學主要研究的方法有哪些

• 人體病理學研究方法：屍體剖驗 (autopsy)、活體組織檢查 （biopsy）、細胞學 （cytology）、分子生物學 （Molecular Biology）

• 實驗病理學研究方法：

  1．動物實驗

  利用人工方法在動物身上復制出人類某些疾病的模型及病理過程，研究疾病的病因學、發病學、病理改變及轉歸，並可施加干預因素，對疾病進行進一步的研究。

  2．組織培養和細胞培養

  將某種組織或單細胞用適宜的培養基在體外培養，以觀察細胞、組織病變的發生、發展（如細胞癌變、腫瘤生長、病毒復制、染色體變異等）可以對培養的組織、細胞施加射線，葯物等外來因子，觀察對其影響。

㈡ 腫瘤3大研究方向之 純粹腫瘤異質性探索

DOI: 10.1126/science.1254257

Broad研究所和麻省總醫院(MGH)於2014年6月12日發表在Science上： Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma

目前將膠質母細胞瘤分為4個亞型，在單細胞水平對不同分型的腦膠質瘤細胞進行瘤內異質性檢測是本文的重點。

這是第一次對獲取膠質母細胞瘤中的單個細胞展開大規模的研究 ，當時單細胞轉錄組還是相對較新的辦法。利用流式細胞術的方法，對來自5位患者的腦膠質瘤細胞進行分選，檢測了430個細胞的基因表達模式，揭示了：每個膠質母細胞瘤都包含來自多種癌症亞型的細胞，腫瘤之間這些細胞的分布各不相同。

doi: 10.1126/science.aad0501.

Broad研究所於2016年4月8日在Science上發表： Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq

對19名黑色素瘤病人的單細胞樣本進行測序，共計4645個不同的腫瘤細胞；類型包括了惡性腫瘤細胞，免疫細胞，間質細胞和內皮細胞。發現：在同種腫瘤中的惡性細胞，其轉錄的異質性與細胞周期，空間分布和抗葯性相關。單細胞轉錄組表達矩陣：GSE72056

doi: 10.1016/j.cell.2017.10.044

2017年12月發表在CELL雜志上，題目是： Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer 。通訊作者為Itay Tirosh 、Derrick T. Lin 、 Aviv Regev 、Bradley E. Bernstein

HNSCC 頭頸部鱗狀細胞癌是最常見的十大癌症之一，是一種與酒精和煙草暴露密切相關的具有異質性的上皮腫瘤，患者往往在晚期出現的淋巴結轉移（LN)。實驗使用 Smart-seq2 方法得到了：研究者對 18個頭頸部鱗癌（HNSCC）患者（ 其中包含5對原發性腫瘤和淋巴結節轉移配對樣本）中分離得到的 6000個單細胞 進行大規模scRNA-seq分析【數據公布在 GSE103322】。實驗驗證用的是細胞系 Oral cavity HNSCC cell lines (Cal-27, SCC9, SCC4, SCC25, and JHU-006; all derived from male patients) 做了RNA-seq 數據。 創造了頭頸部腫瘤的第一個細胞圖譜，揭示了頭頸部腫瘤及其轉移的許多不同類型的細胞。

DOI: 10.1126/science.aai8478

美國麻省總院和Broad研究所合作，於2017年3月31日發表在Science上： Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq

對 10例星形膠質瘤 樣本中的9800個細胞和 6例少突膠質瘤 樣本中的4300個細胞進行了單細胞RNA測序。再結合癌症基因組Atlas中的165例轉錄組數據。兩種腫瘤都含有3種癌症細胞：非增殖性細胞（nonproliferating cells）、類神經幹細胞（resemble neural stem）和祖細胞（progenitor cells）。結果表明兩種腦腫瘤亞型起源於神經祖細胞的相同類型，由基因突變模式和其微環境的組成分而區分開。結果重新定義了兩種密切相關膠質瘤的細胞組成，它們是以IDH基因突變為特徵的星形細胞瘤和少突膠質細胞瘤。

doi: 10.1002/hep.29778.

美國國家癌症中心Zheng H, Pomyen Y, Hernandez M O等於2018年7月發表在Hepatology上： Single‐cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma

肝細胞癌（HCC，hepatocellularcarcinoma）的腫瘤內分子異質性部分歸因於肝癌幹細胞（CSC，hepatic cancer stem cells）的存在。研究人員在 單細胞水平 （10X Chromium、SMART-seq）上 整合轉錄組學和功能分析 用以評估CSC的異質性程度。結果表明， CSC在單細胞水平上的表型、功能和轉錄均存在異質性，不同的CSC亞群具有不同的分子特徵 。而且不同CSC亞群內的不同基因與HCC預後相關，並且彼此相互獨立，表明 CSC異質性影響腫瘤內異質性和腫瘤進展 。

DOI: 10.1126/science.aat1699.

2018年8月英國劍橋大學、桑格研究所等在Science上發表： Single-cell transcriptomes from human kidneys reveal the cellular identity of renal tumors

探究了來自胎兒、兒童和成人腎臟的 72,501 個人腎腫瘤和正常組織的單細胞轉錄組，將兒童期Wilms腫瘤與特定的胎兒細胞類型相匹配，從而為Wilms腫瘤細胞是異常胎兒細胞的假設提供證據。在成人腎細胞癌中，對腫瘤組成的分析定義了癌症相關的正常細胞，並描繪了復雜的血管內皮生長因子（VEGF）信號轉導通路。結果揭示了人類腎臟腫瘤的確切細胞特徵和組成。

doi：10.1038/s41586-019-1373-2

2019年8月發表在nature上： A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors.

對來自9個人類捐贈者的正常肝臟組織內約10,000個單細胞進行了RNA測序,並構建了人類肝細胞圖譜。首次揭示了未知的內皮細胞、Kupffer細胞和肝細胞的亞型，並對其中一些群體進行了轉錄區劃分。證實了EPCAM+ 種群是異質的。EPCAM+ 種群包括肝細胞偏置種群、膽囊素種群以及具有強大雙能性肝臟類器官轉化潛力的TROP2int 祖細胞群體。單細胞轉錄組表達矩陣，數據公布在 GSE124395

doi: 10.1016/j.cell.2019.06.024

哈佛醫學院、博得研究所2019年8月8日 發表在cell上，題目是： An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma.

採用了包括 28個腫瘤的單細胞RNA測序 、 401個腫瘤基因組圖譜(TCGA) 標本的大量遺傳和表達分析、功能方法和單細胞譜系追蹤的整合方法獲得了膠質母細胞瘤細胞狀態和遺傳多樣性的統一模型。發現膠質母細胞瘤中的惡性細胞 以四種主要的細胞狀態存在 ，這些細胞狀態概括了不同的神經細胞類型，受腫瘤微環境的影響。膠質母細胞瘤不同狀態下細胞的相對頻率不同，受CDK 4、EGFR和PDGFRA基因拷貝數擴增和NF1位點突變的影響。作者整合了膠質母細胞瘤惡性細胞程序，其可塑性以及其通過遺傳驅動因素的調節，為膠質母細胞瘤研究提供了一個模型。

doi: 10.1158/2159-8290.CD-19-0094

2019年7月13日冷泉港實驗室發表在Cancer Discov： Cross-species single-cell analysis of pancreatic ctal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts

癌症相關的成纖維細胞(CAFs)是胰腺導管腺癌(PDAC)進展和耐葯的主要因素。文章對人和小鼠使用單細胞RNA測序（scRNA-seq）將CAFs分為三個不同的亞群（myCAFs、iCAFs、apCAFs），確定每個亞群的特定功能和特徵。證實了肌纖維母細胞CAFs(myCAFs)和炎症性CAFs(iCAFs)的存在，並定義了它們在體內的獨特基因特徵。描述了一種表達MHCⅡ類基因和CD 74基因、但不表達經典的共刺激分子的新的CAFs（抗原呈遞CAFs），在模型系統中以抗原特異性方式激活CD4 + T細胞，證實了它們被推測的免疫調節能力。

DOI：10.1038/s41422-019-0195-y

Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College於2019年7月4日發表在Cell Research： Single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ctal adenocarcinoma

使用10× scRNA技術測序：【Case】 24例胰腺導管腺癌 （PDAC）（41986個細胞）；【Control】 膽管腫瘤和十二指腸腫瘤共3例，8例非惡性胰腺腫瘤患者 （15444個細胞），揭示了導管腺癌腫瘤微環境圖譜特徵；比較了實驗組和對照組之間以及不同細胞類型之間細胞CNV水平的差異，發現相對於1型導管來說，2型導管是惡化程度較高的導管細胞；另外對兩種導管細胞的marker進行免疫組化，發現通過單細胞測序鑒定出的marker基因可以作為臨床中導管腺癌進程的分子標志物；伴隨著導管的惡性化進程，導管高表達細胞增殖和細胞遷移相關的基因；基於上述挖掘到的惡性導管細胞的marker基因，作者進行TCGA數據挖掘，將178個PAAD病人分為4種類型；通過不同的靶點抑制劑作用實驗發現CDK1可以作為一個比較好的潛在治療靶點；增殖性導管細胞伴隨著T細胞活化的缺失預示著較差的預後

doi: 10.1038/s41586-019-1434-6

美國聖猶大兒童研究醫院和麻省總醫院於2019年7月25日在Nature上發表： Resolving melloblastoma cellular architechture by single-cell genomics 。

髓母細胞瘤是最為常見的惡性兒童腦瘤。2012年，國際上將髓母細胞瘤分為4種分子亞型：WNT型、SHH型、三型和四型。WNT和SHH的腫瘤也有較為確定的細胞起源，但是三型和四型的細胞起源卻仍是個未知之謎。從目前的存活率來看，WNT亞型患者存活期較長，而三型和四型的存活期卻明顯偏短。通過將腫瘤細胞和發表的成熟腦細胞單細胞圖譜進行比較，作者發現SHH型腫瘤和其已知的起源細胞，小腦顆粒神經祖細胞（GNP ）最為類似，而四型腫瘤和單極刷細胞（UBC）最為類似。

單細胞轉錄組測序技術檢測了25個兒童髓母細胞瘤樣品。 發現三型和四型的主要差異在於不同類型的細胞比例，並通過計算推測出三型和四型腫瘤的可能起源和致癌通路。

doi: 10.1038/s41467-019-11738-0.

美國杜克大學醫學院的Jason W. Locasale、Ziwei Dai和Zhengtao Xiao於2019年8月21日發表在Nature Communications上： Metabolic landscape of the tumor microenvironment at single cell resolution

分析了來自兩種代表性人類腫瘤的 9000多個單細胞 的代謝基因表達譜，包括 黑色素瘤和頭頸癌 ，然後為評估該研究中單個腫瘤細胞的轉錄組圖譜是否與常用組織樣本的轉錄組圖譜一致，研究人員將測序數據 與來自TCGA的RNA-seq數據進行了比較 。研究發現，該單細胞RNA-seq研究中的腫瘤樣本與TCGA中的腫瘤樣本大致相當。

首次在單細胞水平解析了腫瘤微環境中的細胞代謝基因表達譜，揭示了腫瘤代謝異質性在單細胞和組織水平上的顯著差異 。在腫瘤微環境中， 不同患者來源的腫瘤細胞擁有不同的代謝基因表達特徵，但不同類型非腫瘤細胞的代謝基因表達並不受患者來源的影響 ，且不同細胞類型具有各自獨特的基因表達特徵。

㈢ 病理學研究最常用的方法

是屍體剖檢。

對死亡者的遺體進行病理剖檢（屍檢）是病理學的基本研究方法之一。屍體剖檢（autopsy）不僅可以直接觀察疾病的病理改變，從而明確對疾病的診斷，查明死亡原因，幫助臨床探討、驗證診斷和治療是否正確、恰當，以總結經驗，提高臨床工作的質量。

而且還能及時發現和確診某些傳染病、地方病、流行病、為防治措施提供依據，同時還可通過大量屍檢積累常見病、多發病、以及其他疾病的人體病理材料，為研究這些疾病的病理和防治措施，為發展病理學作貢獻。

顯然，屍檢是研究疾病的極其重要的方法和手段，人體病理材料則是研究疾病的最為寶貴的材料。

(3)腫瘤組織標本研究方法擴展閱讀：

病理學與臨床醫學之間的密切聯系，明顯地在對疾病的研究和診斷上。臨床醫學除運用各種臨床診察、檢驗、治療等方法對疾病進行診治外，往往還必須藉助於病理學的研究方法如活體組織檢查、屍體剖檢以及動物實驗等來對疾病進行觀察研究，提高臨床工作的水平。

病理學則除進行實驗研究（實驗病理學）外，也必須密切聯系臨床，直接從患病機體去研究疾病，否則也不利於病理學本身的發展。

病理學長期以來被形象地喻為「橋梁學科」，這充分表明了它在醫學中，特別是在臨床醫學中佔有不可替代的重要地位。其理由主要是由病理學的性質和任務所決定的。

㈣ 肺癌的基因檢測面面觀

已知有基因突變的肺癌患者已經達到肺癌總數的62%。這意味著肺癌基因檢測將造福更多的肺癌患者，將有62%的肺癌患者可以通過基因檢測找到靶向葯物，延長生存時間，提高生活質量。

靶向治療通常是口服用葯，毒性低於化療。

精準的基因檢測可實現肺癌精準診斷和精準治療，肺癌的基因檢測是指目前針對非小細胞型肺癌，觀察有沒有 EGFR基因突變 、 ALK基因融合 、 R0S1突變 、 C-MET基因擴增 、 C-MET基因突變 或者 HER-2過度表達 等情況。如果有上述基因突變，通常可以使用相應的靶向葯物，並且靶向葯物目前在臨床上都已經上市。

肺腺癌，常規行基因檢測；

肺鱗癌， 需要確定組織標本是「小標本」還是「手術標本」：

如果是手術標本診斷的鱗癌，一般不推薦做基因檢測 ，因為目前治療相關驅動基因主要還是發生在肺腺癌；

如果是小標本——穿刺標本或內鏡下取的標本，這部分組織一般並不能反映整體腫瘤組織的狀態，尤其是對於混合性腫瘤組織來說，鱗癌的診斷不一定完全正確。同時，臨床實踐也告訴我們，有部分鱗癌患者基因檢測能發現驅動基因陽性，療效也比較好。 因此，「小標本」診斷肺鱗癌可考慮進行基因檢測

前期的研究表明，非小細胞肺癌若有基因突變，使用靶向物要比化療葯物，無論在 客觀緩解率 、 患者生活質量，還是無進展生存時間上，都要比化療來得更好 。

目前關於肺癌的精準治療，主要內容是進行基因檢測，在使用靶向之前需要找到相應的靶點，有相應靶點才使用相應的靶向葯物，比如EGFR可以使用一代的吉非替尼、厄洛替尼或三代的奧希替尼等。

基因突變對應的葯物或意義

1- EGFR基因突變：

* 19號外顯子缺失、21號外顯子L858R/L861、18號外顯子G719X，G719、20號外顯子S768I對第一、第二代TKIs敏感（易瑞沙、特羅凱）

*20號外顯子點突變T790M對一、二代TKIs獲得性耐葯，對第三代TKIs奧西替尼有效

*20號外顯子插入突變可能預測對一、二代TKIs的獲得性耐葯

*KRAS變異與TKIs原發耐葯有關；KRAS變異與EGFR變異在肺癌患者重疊率<1%

2-ALK基因重排對ALK抑制劑敏感

3-ROS-1重排陽性一代ALK抑制劑（克唑替尼）對此敏感

4-PD-L1表達≥50% 帕博麗珠單抗（K葯）

5-PD-L1表達≥1%納武單抗（O葯）

其他：

1-抗血管治療（無需檢測靶點）雷莫盧單抗獲批用於晚期NSCLC的治療；貝伐珠單抗獲批用於晚期肺腺癌的治療，不提倡用於肺鱗癌

2-BRAFV600E突變：威羅菲尼、達拉非尼、達拉非尼+曲美替尼（MEK抑制劑）

3-高水平MET擴增或MET外顯子14突變：克唑替尼

4-RET重排卡博替尼、凡德他尼

5-HER2突變曲妥珠單抗、阿法替尼

對於肺癌患者，國內醫院常規的肺癌基因檢測靶點為三個(EGFR、ALK、ROS1)，目的是檢測是否適合使用已經上市的靶向葯物，這種方案的優點是：

1、經濟實惠，滿足大多數患者需求

2、EGFR和ALK是東亞非小細胞肺癌患者中最常見的，約佔50%

3、不吸煙女性中比例更高

肺癌基因檢測有以下兩種方法：

1、體液檢測，如胸腔積液、血液，通常普通是送檢標本，抽血10ml左右，根據所需組織學體液量不同，約需100ml；

2、腫瘤標本，即腫瘤實質性組織做標本檢測。標本檢測有新鮮標本，還有取完標本後做成蠟塊檢測，不同實驗室，檢測技術不同，所需標本不同。多數是用組織標本，通常需10張較厚切片標本，厚度為5-8μm，還需要掛膠，將標本附著於載玻片上，實驗室通過腫瘤組織細胞進行一系列基因檢測。後續檢測復雜，需實驗室技術員完成。

推薦美國foundation基因檢測、 美國CARIS生命科學公司、北京諾禾致源科技股份有限公司、世和基因、泛生子基因科技有限公司。

二次基因檢測：腫瘤復發或耐葯，醫生會再推薦做一次基因檢測，耐葯是癌細胞往往發生了新的基因變化，如一半的肺癌患者會發生T790M突變，使用三代的TKI效果會好

NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南（2018.V1）中對於「分子診斷與靶向治療原則」（NSCL-G）明確指出 肺癌基因檢測時一定要包含這8種基因靶點：包括EGFR突變、ALK基因融合/重排、KRAS、MET擴增突變、ROS1基因融合/重排陽性、BRAF、HER2基因擴增、RET融合。 針對不同的基因突變使用不同的靶向葯物治療。

所以，對於肺癌患者，特別是NSCLC，首選做「8基因檢測」，費用應該在3000-4000左右。如果費用受限，最好首選做EGFR基因檢測，這個在國內是最常見的突變基因。

【知乎總結】關注「戰癌白衣」

㈤ 如何檢查腫瘤

,臨床上常用的檢查方法包括有創檢查及無創檢查。有創檢查是指在腫瘤檢查診斷過程中直接對人體正常組織有一定創傷的檢查手段，主要是為獲取腫瘤細胞或腫瘤組織、轉移淋巴結而進行的針吸細胞學檢查、切除活檢、切取活檢、鉗取活檢、腹腔鏡等。取到的細胞及組織經細胞塗片、冰凍切片、石蠟切片得到最終診斷。部分塗片、切片還可經免疫組化染色、特殊染色進行診斷和鑒別診斷，甚至將取到的組織細胞進行電子顯微鏡檢查。
（1）常用的有創檢查方法
①細胞學檢查 臨床細胞學檢查是根據脫落細胞的形態改變診斷腫瘤的一種方法。細胞學診斷具有簡便、安全、准確、迅速和經濟等特點。細胞學檢查細胞標本的採集方法有：刮、擦、刷和印壓取細胞法，主要用於皮膚、呼吸道、消化道上下端、泌尿和生殖道的腫瘤；沖洗液取細胞法，主要是從分泌物或滲出液中採集細胞，如痰液、尿液、乳頭液和某些破潰的腫瘤組織。此外，還有細針針吸細胞學檢查。
細胞學檢查的診斷價值在於准確性高而迅速。一般認為細胞學的診斷價值有時相當於外科標本活檢診斷。細胞學診斷可在1～2小時內得到結果，尤其當標本太小、冰凍切片困難時，更宜作細胞學診斷。在普查當中細胞學檢查可以篩選出無症狀的早期腫瘤患者，尤其是在高危人群中，細胞學的篩選工作更為重要。對於不能取活體組織檢查的病例，如血友病、有出血傾向的患者、糖尿病和某些兒童以及不願做活檢的病人，細胞學診斷就成為主要手段。近些年來，細胞學檢查有新的發展，如利用免疫組化技術了解惡性腫瘤細胞的組織發生或分化，在鑒別低分化腫瘤類型和確定是否是轉移性腫瘤極為重要；檢測細胞的性激素受體；利用流式細胞術檢查癌細胞染色倍數。
②活組織檢查 腫瘤病人為明確診斷，進行病理分期及確定治療方案都必須有一個明確的組織學診斷。病理組織學診斷需有一定的腫瘤組織標本，這種通過穿刺、手術方式獲取病人組織標本的方法叫活組織檢查。活組織檢查的方式有：針吸活組織檢查，一般在局部麻醉下操作，將針頭（特製）刺入可疑腫快內然後吸得組織送病理檢查；切除活檢，是指切除整個腫瘤送病理檢查以明確診斷，切除的腫決邊界必須有一些正常的組織，此法適用於較小的腫瘤；切取活檢，是指腫瘤較大時不能做全部切除，可以採用切取活檢。可用於淺表腫瘤，亦可用於深部腫瘤。
在活組織檢查前必須選擇合適的方式，以達到診斷的要求。那麼，活組織檢查會不會引起擴散？嚴格地選擇適應證，正確地選擇活組織檢查方式，合理的操作不會引起癌擴散，關於乳腺活組織病理檢查的安全性，國內外學者們進行了長期的研究觀察，得出基本一致的結論，認為針吸或切除對預後及生存率無明顯影響。
（2）無創檢查方法
無創檢查是指檢查過程中無直接創傷的檢查手段，包括：普通X光片、X線造影、超聲波檢查、CT檢查、磁共振檢查放射性核素掃描及顯像檢查、胃鏡、腸鏡、鼻咽鏡、宮腔鏡等。
有創檢查及無創檢查對腫瘤的診斷都具有同等重要的作用，具體某一病人需要什麼檢查方法要根據病情來決定，我們的原則是盡可能避免帶給病人痛苦、不便，以最快、最有效、最經濟的方法來明確診斷。

㈥ 如何應用蛋白質組學技術進行腫瘤研究思路設計

雙向凝膠電泳 雙向凝膠電泳的原理是第一向基於蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。由於雙向電泳技術在蛋白質組與醫學研究中所處的重要位置，它可用於蛋白質轉錄及轉錄後修飾研究，蛋白質組的比較和蛋白質間的相互作用，細胞分化凋亡研究，致病機制及耐葯機制的研究，療效監測，新葯開發，癌症研究，蛋白純度檢查，小量蛋白純化，新替代疫苗的研製等許多方面。近年來經過多方面改進已成為研究蛋白質組的最有使用價值的核心方法。 等電聚焦 等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質分離等電點不同的蛋白質的電泳技術。等電聚焦凝膠電泳依據蛋白質分子的靜電荷或等電點進行分離，等電聚焦中，蛋白質分子在含有載體兩性電解質形成的一個連續而穩定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質是脂肪族多氨基多羧酸，在電場中形成正極為酸性，負極為鹼性的連續的pH梯度。蛋白質分子在偏離其等電點的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動；當蛋白質遷移至其等電點位置時，其靜電荷數為零，在電場中不再移動，據此將蛋白質分離。 生物質譜 生物質譜技術是蛋白質組學研究中最重要的鑒定技術，其基本原理是樣品分子離子化後，根據不同離子之間的荷質比（M/E）的差異來分離並確定分子量。對於經過雙向電泳分離的目標蛋白質用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽鍵）成肽段，對這些肽段用質譜進行鑒定與分析。目前常用的質譜包括兩種：基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧質譜（ESI- MS）。 飛行時間質譜 MALDI 的電離方式是 Karas和Hillenkamp於1988年提出。MALDI的基本原理是將分析物分散在基質分子（尼古丁酸及其同系物）中並形成晶體，當用激光（337nm的氮激光）照射晶體時，基質分子吸收激光能量，樣品解吸附，基質-樣品之間發生電荷轉移使樣品分子電離。它從固相標本中產生離子，並在飛行管中測定其分子量，MALDI-TOF-MS一般用於肽質量指紋圖譜，非常快速（每次分析只需3~5min），靈敏（達到fmol水平），可以精確測量肽段質量，但是如果在分析前不修飾肽段，MALDI-TOF-MS不能給出肽片段的序列。 電噴霧質譜（ESI-MS） ESI- MS是利用高電場使質譜進樣端的毛細管柱流出的液滴帶電，在N2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產生的庫侖力與液滴表面張力達到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴，這一過程不斷重復使最終的液滴非常細小呈噴霧狀，這時液滴表面的電場非常強大，使分析物離子化並以帶單電荷或多電荷的離子形式進入質量分析器。ESI-MS從液相中產生離子，一般說來，肽段的混合物經過液相色譜分離後，經過偶聯的與在線連接的離子阱質譜分析，給出肽片段的精確的氨基酸序列,但是 分析時間一般較長。 目前，許多實驗室兩種質譜方法連用，獲得有意義的蛋白質的肽段序列，設計探針或引物來獲得有意義的基因。隨著蛋白質組研究的深入，又有多種新型質譜儀出現，主要是在上述質譜儀的基礎上進行改進與重新組合。

㈦ 細胞檢查的標本採集方法有哪些 原發性肺癌脫落細胞

肺癌發病率及死亡率在世界各國均大幅度增長，是惡性腫瘤的第2、3位。肺癌發病隱匿，早期常無臨床症狀，易被忽略。大多數病例確診時已是晚期，故其治療效果一直不滿意。5年生存率為10%左右。但早期肺癌患者手術後5年生存率為60-90%，可見早期診斷是當前肺癌的重要研究課題。肺癌的早期診斷可根據早期臨床症狀、X線檢查，痰液塗征檢查及纖維支氣管鏡等各方面配合進行。痰註解細胞學檢查陽性率為60-70%，是診斷肺癌的主要方法之一。
標本採集方法：
1、採集痰液的基本要求
採集痰液的質量和方法直接影響痰檢查陽性率。
採集痰液的基本要求是：①痰液必須新鮮。②痰液必須是肺部咳出。
2、細胞學檢查方法
（1）支氣管液細胞學檢查：為在纖維支氣管鏡下直接吸取支氣管液作塗片；或對可疑部位刷取、沖洗及細針吸取標本。
（2）經皮肺部細針吸取檢查：為在X線或CT引導下作穿刺獲得標本。主要應用於經痰液、支氣管液細胞學檢查仍為陰性的患者、無痰液患者和肺轉移病灶患者。
二、人的痰液中能找到癌細胞嗎
痰液中也能找到癌細胞，原發性肺癌源於支氣管黏膜上皮，癌細胞脫落到管腔，隨痰液排出，因此，痰液里能找到癌細胞。早期肺癌，在X線胸片上還發現不了可疑病灶時，痰液中已能找到癌細胞了。痰液細胞學檢查不但是肺癌早期診斷的檢查手段之一，對於少數患者，還能從細胞學形態上區分出所屬類型。但由於脫落癌細胞較少且分散，以痰檢作為肺癌的病理分型並不確切。
癌症確診後，治療手段的選擇較大程度上影響著患者的生存質量和生存期。此外，作為患者家屬，做好家庭護理在患者治療和康復過程中起著重要的作用。首先要照顧好患者的生活起居：保證其周圍環境的干凈、安靜。做一些病人喜歡吃的高熱量、高蛋白、高維生素的具有養陰潤肺、止咳功能的食物，少量多餐，放療期間或放療後讓患者食用流食或半流食。
三、肺部良性病變脫落細胞是怎樣的
1.、炎症病變的脫落上皮細胞
（1）假復層纖毛柱狀上皮細胞：包括：固縮退變、多核纖毛柱狀細胞、核增大的柱狀上皮細胞、纖毛柱狀上皮細胞增生、儲備細胞增生、鱗狀化生細胞、纖毛柱狀上皮細胞衰變。
（2）鱗狀上皮細胞：退化變性、巴氏細胞。

㈧ 研究活細胞或組織最好的方法是

1(常用光鏡標本制備技術

切片標本的制備。這是最常用的方法。應用光學顯微鏡觀察機體各部的微細結構時，首先應把所有要觀察的材料製成薄片，最基本的就是切片方法，其中石蠟切片更為常用。其制備程序大致如下:

(1)取材與固定。將所要觀察的人體或動物的新鮮材料切成適當的小塊，立即浸入固定液(如甲醛溶液等)中進行固定，防止離體後結構發生變化，使其盡可能保持活體時的結構狀態。

(2)脫水與包埋。為了使石蠟能浸入組織內，把固定好的材料用乙醇等脫水，經二甲苯透明後，再浸入加溫溶化的石蠟中浸透包埋使組織塊變硬。

(3)切片與染色。將包埋的組織蠟塊，用切片機切成5-10μm左右的薄片，貼在載玻片上，脫蠟後進行染色。最常用的染色法是蘇木精和伊紅染色，簡稱HE染色。

(4)封固。在切片上滴加中性樹膠，用蓋玻片進行封固，保存備用。

在製作較硬組織(如骨組織等)或較大組織器官(如眼球)等切片，可用火棉膠代替石蠟進行浸透包埋，再進行染色。為了較好地保存細胞內酶的活性 ，可選用冰凍切片，將組織在低溫條件下快速凍結，直接切片，進行染色。

2(塗片、鋪片、磨片標本的制備

血液等液體材料，可直接在玻片上塗片，乾燥後再進行固定和染色。疏鬆結締組織和腸系膜等薄層組織，可在玻片撕開展平，製成鋪片，待乾燥後進行固定和染色。骨和牙等堅硬組織除用酸(稀硝酸等)脫鈣後再按常規製成切片外，還可直接研磨成薄的磨片進行染色觀察。

3(組織化學和免疫組織化學方法

組織化學與細胞化學是應用物理、化學和免疫學方法，對組織、細胞內某些化學成分的定性、定位和定量進行研究，從而探討與其相關的機能活動。

(1)組織化學。其原理是在組織切片上或被取材料上，加某種試劑，使它與組織或細胞內某些物質起化學反應，形成最終反應產物。光鏡組織化學要求其最終產物是有色的沉著物;電鏡細胞化學要求其最終產物是重金屬沉著物。觀察其沉著物的顏色、深淺或電子密度，可對某種物質進行定性、定位和定量。

(2)免疫細胞化學。是將免疫學基本理論與細胞化學技術相結合而建立起來的新技術。主要是應用抗原與抗體特異性結合的特點，檢測細胞內某些肽類和蛋白質等大分子物質的分布。肽類和蛋白質種類繁多，均具抗原性。提取動物的某些肽類和蛋白質，作為抗原注入另一種動物體內，則產生與抗原相應的特異性抗體(免疫球蛋白)，從血清中制備該抗體。如使抗體與熒光素結合，則形成熒游標記抗體。常用的熒光素為異硫氰酸熒光素(FITC)，當用該熒光素標記抗體處理組織切片時，則與組織內相應抗原發生特異結合，在熒光顯微鏡下呈黃綠色熒光部分，即為抗原抗體復合物，稱此為熒游標記抗體法。如抗體與辣根過氧化物酶(HRP)等酶標記，與抗原結合後呈棕紅色，可在光鏡或電鏡下觀察，此即酶標抗體法。

4(組織培養

組織培養或細胞培養是在體外研究活組織或活細胞的形態結構和生理功能動態變化的一種很有價值的研究手段，已廣泛應用於生物醫學的各個領域。組織培養是在無菌條件下進行，從機體取得的活組織或活細胞，或者長期傳代培養的細胞株，放入盛有營養液的培養基