蛋白質定性分析的常用方法有哪些

『壹』 請問蛋白質的檢驗方法有多少種（請盡量詳細,

蛋白質測定方法:
測定蛋白質的方法可分為兩大類：
一類是利用蛋白質的共性,即含氮量 、肽鍵和折射率測定蛋白質含量 ；
另一類是利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸性和鹼性基團 以及芳香基團等測定蛋白質含量.
(1) 凱氏定氮法:是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應的蛋白質系數而求出蛋白質的含量,由於樣品中含有少量非蛋白質含氮化合物,故此法的結果稱為粗蛋白質含量.(是食品上蛋白質含量測定最常用的方法)
(2) 雙縮脲法
(3) 染料結合法
(4) 酚試劑法：方法簡便快速,故多用於生產單位質量控制分析.
(5) 紫外分光光度法-近紅外光譜法

『貳』 鑒定蛋白質有哪些方法

蛋白質含量的測定：
1 凱氏定氮法
根據氮在蛋白質分子中含量恆定（平均佔16%），因此測定出樣品中氮的含量後，即可求出樣品中蛋白質含量。
2 雙縮脲法
3 福林-酚試劑法
福林-酚試劑包括兩種試劑：鹼性銅試劑，磷鉬酸及磷鎢酸的混合試劑。鹼性銅試劑與蛋白質產生雙縮脲反應。這種被作用的蛋白質中的酚基（酪氨酸），在鹼性條件下易將磷鉬酸和磷鎢酸還原成藍色的鉬藍和鎢藍，所生成藍色的深淺，與蛋白質的含量成正比。在650nm和660nm波長下測定光吸收值，即可測定蛋白質含量。
4 紫外吸收法
酪氨酸，色氨酸在280nm處左右具有最大吸收。由於在各種蛋白質中這幾種氨基酸含量差別不大，所以280nm的吸收值與濃度呈正相關。可用於蛋白質濃度的測定。

『叄』 蛋白質的定性測定方法

蛋白質定性方法茚三酮反應
1.范圍

本方法採用茚三酮試劑與蛋白質中a-氨基酸反應生成藍紫色化合物最大吸收值的波長為570nm
本方法適用於各類蛋白質測定范圍0.5 g 50 g 蛋白質

2.原理

茚三酮是使氨基酸和多肽顯色的重要試劑當茚三酮在弱酸性條件下和-氨基酸反應時氨基酸被氧化分解生成醛放出NH3 和C02 水合茚三酮則變成還原型茚三酮然後還原型茚三酮與NH3 及另一分子茚三酮進一步縮合生成藍紫色化合物最大吸收值的波長為570nm此反應為一切a-氨基酸所共有反應靈敏因而本法是氨基酸定量測定應用最廣泛的方法之一脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應生成黃色化合物最大吸收值的波長在44Onm 多肽和蛋白質雖然具有茚三酮反應但肽鏈越大靈敏度也越來越差故不宜作定量測定之用在多肽合成中常用來檢驗有無自由氨基的肽類存在

3 .試劑

茚三酮無水乙醇95%乙醇甘氨酸

4.試樣制備

4.1 蛋白質溶液箱保存備用
4.2 1mg mL-1的茚三酮乙醇溶液,0.1g 茚三酮溶於100mL 95%乙醇新鮮配置
4.3 5mg mL-1的甘氨酸溶液

5.參考文獻

1.陳曾燮劉兢羅丹 編.生物化學實驗.合肥中國科學技術大學出版社1994.1-6
2.李建武等 合編.生物化學實驗原理和方法.北京北京大學出版社1994.150-174
3.寧正祥 編.食品成分分析手冊.北京中國輕工業出版社1998.62-80

『肆』 常用的蛋白質含量測定方法有哪些

①凱氏定氮法
原理：蛋白質平均含氮量為16%。當樣品與濃硫酸共熱，蛋白氮轉化為銨鹽，在強鹼性條件下將氨蒸出，用加有指示劑的硼酸吸收，最後用標准酸滴定硼酸，通過標准酸的用量即可求出蛋白質中的含氮量和蛋白質含量。
②雙縮脲法
原理：尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲，在鹼性溶液中雙縮脲可與Cu2+形成穩定的紫紅色絡合物。蛋白質中的肽鍵實際上就是醯胺鍵，故多肽、蛋白質等都有雙縮脲（biuret）反應，產生藍色或紫色復合物。比色定蛋白質含量。
缺點：靈敏度低，樣品必須可溶，在大量糖類共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 (數mg)，且會受樣品中 硫酸銨 及 Tris 的干擾，但 准確度 較高，不受蛋白質的種類影響。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當於雙縮脲試劑（鹼性銅試劑），試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。
在鹼性條件下，蛋白質中的巰基和酚基等可將Cu2+還原成Cu+， Cu+能定量地與Folin－酚試劑反應生成藍色物質，600nm比色測定蛋白質含量。
靈敏度較高(約 0.1 mg)，但較麻煩，也會受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。 步驟中各項試劑的混合，要特別注意均勻澈底，否則會有大誤差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收進行測定。
280nm-260nm的吸收差法：若樣品液中有少量核酸共存按下式計算：
蛋白質濃度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260為角標）
⑤色素結合法（Bradford 法）
直接測定法：利用蛋白質與色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）結合物的光吸收用分光光度法進行測定。
考馬斯亮蘭（CBG）染色法測定蛋白質含量。CBG 有點像指示劑，會在不同的酸鹼度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍色。當 CBG接到蛋白質上去的時候，因為蛋白質會提供 CBG一個較為中性的環境，因此會變成藍色。當樣本中的蛋白質越多，吸到蛋白質上的CBG也多，藍色也會增強。因此，藍色的呈色強度，是與樣本中的蛋白質量成正比。
間接測定法：蛋白質與某些酸性或鹼性色素分子結合形成不溶性的鹽沉澱。用分光光度計測定未結合的色素，以每克樣品結合色素的量來表示蛋白質含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4』-二羧-2,2』-二喹啉）法與Lowry法相似，主要差別在鹼性溶液中，蛋白質使Cu2+轉變Cu+後，進一步以BCA 取代Folin試劑與Cu+結合產生深紫色，在波長562 nm有強的吸收。
它的優點在於鹼性溶液中BCA 比Folin試劑穩定，因此BCA與鹼性銅離子溶液結合的呈色反應只需一步驟即完成。靈敏度Lowry法相似。
本方法對於陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度，較不受干擾，但會受還原糖 及EDTA的干擾。
⑦膠體金測定法
膠體金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶膠，呈洋紅色，具有高電子密度，並能與多種生物大分子結合。
膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體遇蛋白質轉變為藍色，顏色的改變與蛋白質有定量關系，可用於蛋白質的定量測定。
⑧其他方法
有些蛋白質含有特殊的 非蛋白質基團，如 過氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團，可測 403 nm 波長的吸光來定量之。 含特殊金屬的酶 (如鎘)，則可追蹤該金屬。

『伍』 測定蛋白質含量的方法有哪些

1、凱氏定氮法

凱氏定氮法是由丹麥化學家凱道爾於1833年建立的，現已發展為常量、微量、平微量凱氏定氮法以及自動定氮儀法等，是分析有機化合物含氮量的常用方法。

凱氏定氮法的理論基礎是蛋白質中的含氮量通常占其總質量的16%左右(12%~一19%)，因此，通過測定物質中的含氮量便可估算出物質中的總蛋白質含量(假設測定物質中的氮全來自蛋白質)，即: 蛋白質含量=含氮量/16%。

2、紫外吸收光譜法

紫外吸收光譜法又稱紫外分光光度法，是根據物質對不同波長的紫外線吸收程度不同而對物質組成進行分析的方法。此法所用儀器為紫外吸收分光光度計或紫外-可見吸收分光光度計。

光源發出的紫外光經光柵或棱鏡分光後，分別通過樣品溶液及參比溶液，再投射到光電倍增管上，經光電轉換並放大後，由繪制的紫外吸收光譜可對物質進行定性分析。

(5)蛋白質定性分析的常用方法有哪些擴展閱讀

蛋白質含量測定的意義：

膳食蛋白質符合人的需要時，可維持正常代謝，生成抗體，抵抗感染，有病也易恢復。相反，蛋白質供給不足時，會減輕體重，易患貧血，容易感染疾病；創傷、骨折不易癒合；嚴重缺乏時，血漿蛋白降低，可引起浮腫。

此外癌症與蛋白質攝入量不足也有一定關系。但是，蛋白質攝入過多也可造成腎臟負擔。食物蛋白質在體內代謝所生成的尿酸、氨、酮體等累積過多，可導致衰老；而氨還對機體有毒性，不僅會陡然增加肝臟負擔，還會增加胃腸負荷，引起肝腎受累以及消化不良等症。所以，蛋白質的攝入量要適當。

『陸』 蛋白質含量的測定方法有哪些

蛋白質含量測定的方法有微量凱氏定氮法、雙縮脲法、folin―酚試劑法、考馬斯亮蘭法、紫外吸收法等。

1、微量凱氏定氮法：含氮有機物即分解產生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸銨。經強鹼鹼化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。

2、雙縮脲法：雙縮脲是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨後得到的產物。在強鹼性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。

3、folin―酚試劑法：這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法，由於其試劑乙的配製較為困難，近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。

4、考馬斯亮蘭法：1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法，是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。

5、紫外吸收法：蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成正比。

『柒』 說明常用蛋白質測定方法的原理,並對各種方法加以比較

1、凱氏定氮法

准備4個50mL凱氏燒瓶並標號，想1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品，另外兩個燒瓶作為對照，在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物，再加入濃硫酸，將4個燒瓶放到消化架上進行消化。

消化完畢後進行蒸餾，全部蒸餾完畢後用標准鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量，直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色，即為滴定終點，結算出蛋白質含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法，硫銨不幹擾顯色， Cu2+與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。

利用標准蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標准曲線，將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合，並只加入硫酸鈉不含血清的試管作對照，將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑，混合後於37℃環境中放置10分鍾，在540nm波長進行比色，以對照管調零，讀取吸光度值，標准曲線上直接查出蛋白質含量。

3、酚試劑法

取6支試管標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量加入蒸餾水補足而保持一致，混合均勻，在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

5、考馬斯亮藍法

Bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸餾水補充至200ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。

標准曲線蛋白質樣本的准備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標准品，測定抗體，可用純化的抗體作為標准。待測樣本是未知的，也可用抗體作為標准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標准曲線。

將待測樣本溶於緩沖溶液中，該緩沖溶液應與製作標准曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，出現沉澱，過濾除去。

每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合後，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min。根據標准曲線計算待測樣本的濃度。

『捌』 常用來測定蛋白質含量的方法有哪些優缺點是什麼

1、凱氏定氮法

凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然後在鹼性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來並為過量的硼酸液吸收，再以標准鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。

由於蛋白質含氮量比較恆定，可由其氮量計算蛋白質含量，故此法是經典的蛋白質定量方法。

優點：可用於所有食品的蛋白質分析中；操作相對比較簡單；實驗費用較低；結果准確，是一種測定蛋白質的經典方法；用改進方法（微量凱氏定氮法）可測定樣品中微量的蛋白質。

缺點：凱氏定氮法只是一個氧化還原反應,把低價氮氧化並轉為氨鹽來測定,而不能把高價氮還原為氮鹽的形式,所以不可以測出物質中所有價態的氮含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是一個用於鑒定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑是一個鹼性的含銅試液，呈藍色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配製。

當底物中含有肽鍵時（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應蛋白質單位1-10mg。

優點：測定速度較快，干擾物質少，不同蛋白質產生的顏色深淺相近。

缺點：①靈敏度差； ② 三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會干擾該反應。

3、酚試劑法

取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

優點：靈敏度高，對水溶性蛋白質含量的測定很有效。

缺點：①費時，要精確控制操作時間；②酚法試劑的配製比較繁瑣。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

優點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定後能回收。 

缺點：①測定蛋白質含量的准確度較差，專一性差； ②干擾物質多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。

5、考馬斯亮藍法

考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合後，其對可見光的最大吸收峰從 465nm 變為 595nm。

在考馬斯亮藍 G-250 過量且濃度恆定的情況下，當溶液中的蛋白質濃度不同時，就會有不同量的考馬斯亮藍 G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉變有一定的數量關系。

一般情況，當溶液中的蛋白質濃度增加時，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用考馬斯亮藍 G-250 顯色法來測定溶液中蛋白質的含量。

優點：靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡合劑的影響，適合大量樣品的測定。

缺點：由於各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用於不同蛋白質測定時有較大的偏差。

『玖』 常用的血清蛋白質含量測定方法有哪些

四種血清總蛋白質的測定的方法：

1.基於蛋白分子中含有酪氨酸和色氨酸而使用的酚試劑比色法 由於各種蛋白質分子中上述兩種氨基酸的組成比例不同，特別是白蛋白含色氨酸為0.2%，而γ-球蛋白中含量達2%-3%，導致較大的差異。Lowry的改良法在酚試劑中加入Cu2+，集中原法和雙縮脲反應兩者的作用，使呈色靈敏度提高。其中75%的呈色依賴於Cu2+.反應產物最佳吸收峰在650-750nm，方法靈敏度為雙縮脲方法的100倍左右。有利於檢測較微量的蛋白質。但試劑反應仍易受多種化合物的干擾。

2.紫外測定法 採用280nm和215/225紫外吸收值，計算蛋白質含量280nm 是由於蛋白質分子中存在芳香族氨基酸所致。方法的特異性和准確性受蛋白分子中該種氨基酸的含量比例影響甚大。尿酸和肝紅素在280nm附近有干擾。紫外區200-225nm是肽健的強吸收峰。在此區域其吸收值為280nm的10-30倍，將血清稀釋1000-2000倍可以消除干擾物質的影響。

3.採用沉澱反應進行散射比濁法 用磺柳酸、三氯醋酸等配方，此方法甚為簡便，不需特殊儀器，技術關鍵在於：①選擇最佳試劑濃度及溫度；②混勻技術；③選用的標准；④待測標本中的蛋白濃度。

4.染料結合法 蛋白質可與某些染料特異結合，如氨基黑（amino black）與考馬亮藍（comassive brilliant blue ）。這一性質除了可以用於電泳後的蛋白質區帶染色，亦可用於總蛋白質的定量。缺點是多種蛋白質與染料的結合力不一致。考馬亮藍在與蛋白質結合後的吸收峰從465nm移向595nm，這一性質可用分光光度法來定量檢測。

『拾』 蛋白質分離鑒定的常用方法有哪些

蛋白質分離鑒定的常用方法：
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沉澱法
沉澱法也稱溶解度法。其純化生命大分子物質的基本原理是根據各種物質的結構差異性來改變溶液的某些性質，進而導致有效成分的溶解度發生變化。
1、鹽析法
鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出。
2、有機溶劑沉澱法
有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。
3、蛋白質沉澱劑
蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用，常見的有鹼性蛋白質、凝集素和重金屬等。
4、聚乙二醇沉澱作用
聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用。
5、選擇性沉澱法
根據各種蛋白質在不同物理化學因子作用下穩定性不同的特點，用適當的選擇性沉澱法，即可使雜蛋白變性沉澱，而欲分離的有效成分則存在於溶液中，從而達到純化有效成分的目的。

吸附層析
1、吸附柱層析
吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。
2、薄層層析
薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。
3、聚醯胺薄膜層析
聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。

離子交換層析
離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統中進行的。離子交換劑是由基質、電荷基團和反離子構成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，或藉助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。

凝膠過濾
凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠具有網狀結構，小分子物質能進入其內部，而大分子物質卻被排除在外部。當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。

親和層析
親和層析的原理與眾所周知的抗原-抗體、激素-受體和酶-底物等特異性反應的機理相類似，每對反應物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應中，特異的底物（S）才能和一定的酶（E）結合，產生復合物（E-S）一樣。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，並產生復合物。而親和層析與酶-底物反應不同的是，前者進行反應時，配體（類似底物）是固相存在；後者進行反應時，底物呈液相存在。實質上親和層析是把具有識別能力的配體L（對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等）以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質M（如活化瓊脂糖等）上，製成親和吸附劑M-L，或者叫做固相載體。而固化後的配體仍保持束縛特異物質的能力。因此，當把固相載體裝人小層析柱（幾毫升到幾十毫升床體積）後，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質S就可藉助靜電引力、范德瓦爾力，以及結構互補效應等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質則被起始緩沖液洗滌出來，並形成了第一個層析峰。然後，恰當地改變起始緩沖液的pH值、或增加離子強度、或加入抑制劑等因子，即可把物質S從固相載體上解離下來，並形成了第M個層析峰。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個以上的物質與固相載體具有親和力（其大小有差異）時，採用選擇性緩沖液進行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經再生處理後，可以重復使用。
上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。除此之外，還有一種親和層析法叫通用性配體親和層析法。這兩種親和層析法相比，前者的配體一般為復雜的生命大分子物質（如抗體、受體和酶的類似底物等），它具有較強的吸附選擇性和較大的結合力。而後者的配體則一般為簡單的小分子物質（如金屬、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的解析度。

聚焦層析
聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動相，其流動相為多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。
聚焦層析原理可以從pH梯度溶液的形成、蛋白質的行為和聚焦效應三方面來闡述。
1、PH梯度溶液的形成
在離子交換層析中，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現的。例如，當使用陰離子交換劑進行層析時，制備pH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室中裝高pH溶液，而在另一室裝低pH極限溶液，然後打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的pH值是由高到低變化的。而在聚焦層析中，當洗脫液流進多緩沖交換劑時，由於交換劑帶具有緩沖能力的電荷基團，故pH梯度溶液可以自動形成。例如，當柱中裝陰離子交換劑PBE94（作固定相）時，先用起始緩沖液平衡到pH9，再用含pH6的多緩沖劑物質（作流動相）的淋洗液通過柱體，這時多緩沖劑中酸性最強的組分與鹼性陰離子交換對結合發生中和作用。隨著淋洗液的不斷加入，柱內每點的pH值從高到低逐漸下降。照此處理J段時間，從層析柱頂部到底部就形成了pH6～9的梯度。聚焦層析柱中的pH梯度溶液是在淋洗過程中自動形成的，但是隨著淋洗的進行，pH梯度會逐漸向下遷移，從底部流出液的pH卻由9逐漸降至6，並最後恆定於此值，這時層析柱的pH梯度也就消失了。
2、蛋白質的行為
蛋白質所帶電荷取決於它的等電點（PI）和層析柱中的pH值。當柱中的pH低於蛋白質的PI時，蛋白質帶正電荷，且不與陰離於交換劑結合。而隨著洗脫劑向前移動，固定相中的pH值是隨著淋洗時間延長而變化的。當蛋白質移動至環境pH高於其PI時，蛋白質由帶正電行變為帶負電荷，並與陰離子交換劑結合。由於洗脫劑的通過，蛋白質周圍的環境pH 再次低於PI時，它又帶正電荷，並從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復進行，於是各種蛋白質就在各自的等電點被洗下來，從而達到了分離的目的。
不同蛋白質具有不同的等電點，它們在被離子交換劑結合以前，移動之距離是不同的，洗脫出來的先後次序是按等電點排列的。
3、聚焦效應
蛋白質按其等電點在pH梯度環境中進行排列的過程叫做聚焦效應。pH梯度的形成是聚焦效應的先決條件。如果一種蛋白質是加到已形成pH梯度的層析柱上時，由於洗脫液的連續流動，它將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，其蛋白質將以緩慢的速度進行吸附、解吸附，直到在等電點pH時被洗出。若在此蛋白質樣品被洗出前，再加入第二份同種蛋白質樣品時，後者將在洗脫液的作用下以同樣的速度向前移動，而不被固定相吸附，直到其遷移至近似本身等電點的環境處（即第一個作品的緩慢遷移處）。然後兩份樣品以同樣的速度遷移，最後同時從柱底洗出。事實上，在聚焦層析過程中，一種樣品分次加入時，只要先加入者尚未洗出，並且有一定的時間進行聚焦，剩餘樣品還可再加到柱上，其聚焦過程都能順利完成，得到的結果也是滿意的。

氣相色譜
多種組分的混合樣品進入色譜儀的氣化室氣化後呈氣態。當載氣流入時，氣化的物質被帶人色譜柱內，在固定相和流動相中不斷地進行分配．在理想狀態下，溶質於氣-液兩相間的分配可用分配系數Kg描述。當分配系數小時，溶質在柱中就停留時間短，也即滯留因子（Rf）大，所以它將首先從色譜柱流出而進入鑒定器，經放大系統放大後，輸出訊號便在記錄儀中自動記錄下來，這時呈現的圖形為色譜圖，亦稱色譜峰；當分配系數大時，溶質在柱中停留時間就長，其色譜圖在記錄儀上後出現。由於不同物質有不同的分配系數，所以將一混合樣品通過氣-液色譜柱時，其所含組分就可得到分離。
氣相色譜柱效率高、解析度強的重要原因是，理論塔板數（N）大。毛細管氣相色譜的N可達105~6。增加理論塔板數和降低樣品組分的不同分子在展層中擴展程度（速率理論），就可明顯地提高柱效。以下將討論塔板理論和速率理論對柱效的影響：
1、塔板理論
塔板理論是將色譜假設為一個蒸餾塔，塔內存在許多塊塔板，樣品各組分在每塊塔板的液相和氣相間進行分配，在柱內塔板間高度H（即理論塔板高度）一定時，在有效范圍內，柱子越長，N也就越大，樣品各組分分配次數也就越多，解析度自然提高；若柱長一定時，塔板理論高度H越小，就越能增加樣品各組分的分配次數，進而提高其解析度。因此 N=L/H 在線性分配和忽略塔板間縱向擴散的條件下，根據樣品組分的保留時間tr、峰寬W或半峰高寬度2ΔXi，Martin導出了計算N的公式，樣品組分峰寬度值越小，理論塔板數越高。實際上，進行色譜分析時，峰寬度值的大小是衡量解析度高低的一個尺度。
2、速率理論
根據塔板理論，在H（塔板理論高度）一定時，增加柱長可以提高柱效。但是，柱子過長，將會延長分析時間，降低檢測的靈敏度。所以實踐中應設法降低H，提高柱效。
速率理論主要是分析同一樣品的不同分子，在色譜柱中遷移速度差異所引起色譜峰的擴張程度。而渦流擴散、縱向分子擴散和質量傳遞（包括流動相傳質和固定相傳質）等因子與速率理論值（H）的密切關系可用下面的公式表示：
H=A+B/U+C
渦流擴散（A）是由於樣品組分隨著流動相的移動通過固定相顆粒不均勻的色譜柱時，引起同一組分的不同分子在流動相中形成不規則的"渦流"，致使色譜峰變寬、柱效降低。如固定相顆粒均勻、直徑小時，則可降低"渦流"現象發生。
縱向擴散（B/U）亦稱分子擴散項。縱向擴散與樣品分子在色譜柱中的流暢程度（有無阻礙）、流動相的速度（U）等因子有關。因此，降低溶質在流動相中擴散系數和縮短溶質在流動相中停留時間，均可降低縱向擴散。
傳質阻力（C）：溶質分子在氣相與氣液界面進行交換所受的阻力，以及在進入固定相液膜傳遞的差異性統稱傳質阻力。傳質阻力分別與固定相顆粒直徑的平方和固定相液膜厚度成正比關系。

高效液相色譜
高效液相色譜按其固定相的性質可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、解析度高、重復性好，且須在色譜儀中進行。
高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統，下面將分別敘述其各自的組成與特點。
1、進樣系統
一般採用隔膜注射進樣器或高壓進樣器完成進樣操作，進樣量是恆定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。
2、輸液系統
該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47~4.4×107Pa，流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高解析度、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、pH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質（即使僅有一個基團的差別或是同分異構體）都能獲得有效分離。
3、分離系統
該系統包括色譜柱、連接管和恆溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），內徑為2～5mm，由"優質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料製成，住內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質和固定液構成）。固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基團基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000?）和比表面積大的特點，加之其表面經過機械塗漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學法偶聯各種基團（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）後，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、緻密狀態，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小，微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高解析度是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小，會提高解析度的道理。
再者，高效液相色譜的恆溫器可使溫度從室溫調到60C，通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。
4、檢測系統
高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。
（1）紫外檢測器
該檢測器適用於對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點：使用面廣（如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為10-10?g/ml）；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
（2）示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7?g/ml），流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用於痕量分析，也不適用於梯度洗脫樣品的檢測。
（3）熒光檢測器
凡具有熒光的物質，在一定條件下，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用於具有熒光的有機化合物（如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-12～10-14?g/ml），痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可採用。
（5）數據處理系統
該系統可對測試數據進行採集、貯存、顯示、列印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。