基因編輯的研究目標和方法

1. 輕鬆了解：什麼是基因編輯，它的原理是什麼

基因編輯技術指能夠讓人類對目標基因進行「編輯」，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術自問世以來，就有著其它基因編輯技術無可比擬的優勢，技術不斷改進後，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地「編輯」任何基因。

2. 對基因編輯的理解

你好，很高興為你解答：

基因編輯什麼意思
基因編輯，又稱基因組編輯或基因組工程，是一種新興的比較精確的能對生物體基因組特定目標基因進行修飾的一種基因工程技術。基因編輯技術指能夠讓人類對目標基因進行定點「編輯」，實現對特定DNA片段的修飾。

基因編輯依賴於經過基因工程改造的核酸酶，也稱「分子剪刀」，在基因組中特定位置產生位點特異性雙鏈斷裂（DSB），誘導生物體通過非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HR）來修復DSB，因為這個修復過程容易出錯，從而導致靶向突變。

3. 基因編輯到底是什麼

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CRISPR/Cas基因編輯系統

CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas）系統是目前被廣泛運用的基因編輯系統，其原理是由CRISPR轉錄產生的gRNA介導Cas核酸酶靶向目標序列，對序列進行切割。

CRISPR/Cas9基因編輯示意圖

(圖源：Wellcome Trust Sanger Institute,Sanger)

下面來深入了解以下基因編輯技術吧~

CRISPR/Cas基因敲除

CRISPR/Cas9系統中sgRNA(smallguideRNA)識別並結合目標基因的靶向序列，引導Cas9對結合位點進行剪切，產生DNA雙鏈斷裂（double-strandbreak,DSB），機體自身通過非同源重組（non-homologousendjoining，NHEJ）的方式修復DSB，參與修復的蛋白經常會在DNA末端插入或刪除幾個鹼基，修復後的基因由於產生突變而導致功能喪失，從而實現機體內的基因敲除。
應用：基因敲除細胞系建立、基因敲除建立動物疾病模型。
技術優勢：相較於在mRNA水平「敲低」目的基因的RNAi而言，CRISPR/Cas9系統造成基因序列的缺失，從而能完全沉默（即敲除）目的基因。

CRISPR/Cas基因敲入

CRISPR/Cas9系統中sgRNA(smallguideRNA)識別並結合目標基因的靶向序列，引導Cas9對結合位點進行剪切，產生DNA雙鏈斷裂（double-strandbreak,DSB），通過細胞內的同源重組（homologousrecombination，HR）修復方式，將外源供體DNA定點導入至基因組的靶位點中，從而實現基因敲入。
應用：基因片段敲入細胞系建立、基因單鹼基突變細胞系建立、基因敲入建立動物疾病模型。
技術優勢：操作簡易、效率高、具有廣譜性且提供BSL-1和BSL-2病毒注射及實驗操作平台。

CRISPR/dCas9調控內源基因的轉錄激活與抑制

CRISPR-dCas9系統即是dCas9與轉錄激活因子（如VP64）或轉錄抑制因子（如KRAB）融合後，結合sgRNA能促進或抑制目的基因的表達。
應用：目的基因在內源環境中過表達、誘導iPSC、抑製表達等。
技術優勢：操作簡易、效率高、具有廣譜性且提供BSL-1和BSL-2病毒注射及實驗操作平台，同時可與RNAi聯合作用。

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4. 基因編輯技術是什麼它是如何在醫學領域應用的

基因編輯技術可以准確地改造人類基因，達到基因治療效果。中國科學院生物化學與細胞生物學研究所李勁松研究組通過在小鼠胚胎中注射CRISPR/Cas9糾正白內障小鼠模型中的遺傳缺陷，所產生的後代是可育的並能將修正後的等位基因傳遞給它們的後代。杜氏肌營養不良（DMD）是一種罕見的肌肉萎縮症，也是最常見的致命性遺傳病之一，是由肌營養不良蛋白dystrophin基因突變引起。杜克大學Charles Gersbach研究組應用CRISPR/Cas9在DMD小鼠中將dystrophin基因突變的23外顯子剪切，而合成了一個截短的但功能很強的抗肌萎縮蛋白，這是生物學家「首次成功地利用CRISPR基因編輯技術治癒了一隻成年活體哺乳動物的遺傳疾病」。

►CAR-T治療簡圖，圖片來自onclive.com

基因編輯技術聯合免疫療法在腫瘤及HIV/AIDS治療具有廣泛的應用前景。嵌合抗原受體T細胞（Chimeric Antigen Receptor T cell，CAR-T）細胞治療是非常有前景的腫瘤治療方法。CAR-T細胞療法在B細胞惡性血液腫瘤治療中已經取得碩果。中科院動物研究所王皓毅研究組利用CRISPR/Cas9技術在CAR-T細胞中進行雙基因（TCRα subunit constant 和beta-2 microglobulin）或三基因（TRAC，B2M及programmed death-1）敲除。美國斯隆凱特林癌症紀念中心Michel Sadelain研究組發現CRISPR/Cas9技術將CAR基因特異性靶向插入到細胞的TRAC基因座位點，極大增強了T細胞效力，編輯的細胞大大優於傳統在急性淋巴細胞白血病小鼠模型中產生CAR-T細胞。

繼諾華的Kymriah以及Gilead （kite Pharma）的Yescarta接連上市，CRISPR Therapeutics公司也在應用CRISPR/Cas9基因編輯技術開發同種異體CAR-T候選產品。2016年10月，四川大學華西醫院的腫瘤醫生盧鈾領導的一個團隊首次在人體中開展CRISPR試驗，從晚期非小細胞肺癌患者體內提取出免疫細胞，再利用CRISPR/Cas9技術剔除細胞中的PD-1基因更有助於激活T細胞去攻擊腫瘤細胞，最後將基因編輯過的細胞重新注入患者體內。

微生物種群與人體醫學，自然環境息息相關。北卡羅來納大學Rodolphe Barrangou與Chase L. Beisel合作通過使用基因組靶向CRISPR/Cas9系統可靶向並區分高度密切相關的微生物，並程序性去除細菌菌株，意味著CRISPR/Cas9系統可開發成精細微生物治療體系來剔除有害致病菌，人類將有可能精確控制微生物群體的組成。以色列特拉維夫大學Udi Qimron將CRISPR系統導入溫和噬菌體中在侵染具有抗生素抗性的細菌以消滅此類細菌，CRISPR系統已具有成為新一類抗生素的潛力。Locus BioSciences公司也在開發在噬菌體中開發CRISPR系統以達消滅難辨梭菌的目的。

弗吉尼亞理工大學Zhijian Tu研究組在雄蚊子中進行M因子基因編輯，可以導致雌雄蚊之間的轉化或雌蚊的殺戮，從而實現有效的性別分離和有效減少蚊子的數量，也將減少寨卡病毒及瘧疾等傳播。

基於CRISPR治療不僅可以應用於根除共生菌或有益菌群的病原體，也可應用於靶向人類病毒，包括HIV-1，皰疹病毒，乳頭瘤病毒及乙型肝炎病毒等。具有純合的32-bp缺失（Δ32）的CC趨化因子受體5型（CCR5）基因的患者對HIV感染具有抗性。因此加利福尼亞大學Yuet Wai Kan在誘導多能幹細胞iPSC中利用CRISPR系統引入純合CCR5Δ32突變後，誘導分化後的單核細胞和巨噬細胞對HIV感染具有抗性。天普大學Kamel Khalili 課題組應用CRISPR/Cas9系統在宿主細胞基因組中精確編輯HIV-1 LTR U3區，從而在將艾滋病病毒從基因組中剔除。

Cas12a （Cpf1）屬於CRISPR家族另一核酸內切酶，它也可被gRNA引導並剪切DNA。但是，它不僅可以切割相結合的單鏈或雙鏈DNA，也剪切其他的DNA。近日，加州大學伯克利分校Jennifer Doudna研究組開發了基於CRISPR的一項新技能——基因偵探（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR)）。利用單鏈DNA將熒光分子和淬滅分子連接構建成一個報告系統，當CRISPR-Cas12a在gRNA引導下結合到目標DNA並發揮剪切作用時，報告系統中的DNA也被剪切，熒光分子將被解除抑制。此系統在致癌性HPV的人的DNA樣品檢測HPV16和HPV18變現極佳。

布羅德研究所Feng Zhang研究組開發的基於CRISPR的2代SHERLOCK （Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），原理是利用Cas13a被激活後，可以切割除靶序列外其他的RNA的特徵，引入了解除熒光分子的抑制。此工具可實現一次性多重核酸檢測，可同時檢測4種靶標分子，額外添加的Csm6使得這種工具比它的前身具有更高的靈敏度，並將它開發成微型試紙條檢測方法，簡單明了易操作，已被研究人員成功應用於RNA病毒，如登革熱病毒和寨卡病毒，及人體液樣本檢測。

Broad研究所David R. Liu研究組利用CRISPR/Cas9開發了一種被稱為CAMERA（CRISPR-mediated analog multi-event recording apparatus）的記錄細胞事件的「黑匣子」他們利用這個系統開發出兩種細胞記錄系統，在第一種被稱為「CAMERA 1」的細胞記錄系統中，研究人員利用細菌中質粒的自我復制但又嚴格控制其自身數量的特徵，

將兩種彼此之間略有不同的質粒以穩定的比例轉化到細菌中，隨後在接觸到外來葯物刺激時，利用CRISPR/Cas9對這兩種質粒中的一種進行切割，通過對質粒進行測序並記錄兩種質粒比例的變化來記錄細菌接觸外來刺激的時間。另一種細胞記錄系統被稱為「CAMERA 2」，它利用基於CRISPR/Cas9的鹼基編輯系統實現在細胞內特定信號發生時改變遺傳序列中的單個鹼基，以此實現對諸如感染病毒、接觸營養物等刺激的記錄。這套技術的出現將很大程度的幫助人們進一步了解細胞的各類生命活動的發生發展規律。

2015 年 4 月，中山大學的黃軍利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術，同源重組修復了胚胎中一個引發地中海貧血β-globin gene （HBB）的突變。

►圖片來自kurzgesagt.org

2016年，廣州醫科大學的范勇團隊在三原核受精卵中，應用基因編輯技術CRISPR受精卵中的基因CCR5進行編輯引入CCR5Δ32純合突變由於當時脫靶效率問題突出，產生了鑲嵌式的受精卵。

2017年8月2日，俄勒岡健康與科學大學胚胎細胞和基因治療中心Shoukhrat Mitalipov研究組公布了其應用CRISPR在人類胚胎中進行DNA編輯的結果，糾正了突變的MYBPC3基因，其突變會引起心肌肥厚並將年輕運動員猝死。