㈠ 檢驗目的基因是否轉錄用什麼方法
應用分子雜交進行檢測。
分子雜交技術：不同的DNA
片段之間，DNA
片段與RNA
片段之間，如果彼此間的核苷酸排列順序互補也可以復性，形成新的雙螺旋結構。這種按照互補鹼基配對而使不完全互補的兩條多核苷酸相互結合的過程稱為分子雜交。檢測目的基因是否進行轉錄，即有無互補RNA產生，可以使用分子雜交技術。
㈡ 比較概述基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學的概念、研究方法、優缺點及應用設想
組學omics，研究的是整體. 按照分析目標不同主要分為基因組學，轉錄組學，蛋白質組學，代謝組學。
基因組學研究的主要是基因組DNA，使用方法目前以二代測序為主，將基因組拆成小片段後再用生物信息學演算法進行迭代組裝。當然這僅僅是第一步，隨後還有繁瑣的基因注釋等數據分析工作。
轉錄組學研究的是某個時間點的mRNA總和，可以用晶元，也可以用測序。晶元是用已知的基因探針，測序則有可能發現新的mRNA,
蛋白組學針對的是全體蛋白，組要以2D-Gel和質譜為主，分為top-down和bottom-up分析方法。理念和基因組類似，將蛋白用特定的物料化學手段分解成小肽段，在通過質量反推蛋白序列，最後進行搜索，標識已知未知的蛋白序列。
代謝組分析的代謝產物，是大分子和小分子的混合物，主要也是用液相和質譜。
總而言之，這些技術都想從全局找變數，都是一種top-down的研究方法，原因很簡單：避免『只緣身在此山中』的尷尬。
但因為技術局限，都各有缺點，尤其是轉錄組和蛋白組數據，基本上顛覆了以前一直認為的mRNA水平能代表蛋白水平的觀念，因為這兩組數據的重合度太低。
所以目前很多研究都開始使用交叉驗證方法。
無論如何，都需要對數據進行分析，有經驗的分析往往能化腐朽為神奇。
㈢ 研究某一基因的轉錄水平上的表達,有哪些實驗手段
常用的方法有普通的RT-PCR，以及real-time RT-PCR，以及northern blot，現在也有人用數字PCR。
㈣ 轉錄因子的研究思路
轉錄因子（Transcriptionfactor，TF)是一種能與特異DNA序列結合的蛋白，可以單獨或與其他蛋白形成復合體，提高或阻斷特定基因對RNA聚合酶的招募，調控基因的表達。轉錄因子的特點是它包含一個或多個DNA結合域（DNA-binding domain，DBDs），通過這些結合域與基因附近的DNA序列結合，從而完成調控。下面結合文章介紹轉錄因子的研究方法。
01 案例文章簡介
案例文章 ：
Ahr-Foxp3-RORt axis controls gut homing of CD4+T cells by regulating GPR15. Sci Immunol. 2020, 5(48). （IF=13.44）
GPR15是一種趨化因子受體，在T細胞向大腸歸巢的過程中發揮重要作用。這項研究發現小鼠大腸Treg中的GPR15表達水平最高，芳香烴受體（Ahr）可通過增加GPR15的表達促進Treg向大腸的歸巢，而Foxp3及RORγt在Ahr介導的GPR15表達上調中分別起到正向及負向調控作用。另外，在人結腸Treg中也可重復上述發現。該研究提示，Ahr-Foxp3-RORγt軸可通過調控GPR15的表達調節Treg的腸道歸巢，從而影響腸道免疫穩態。
02 案例文章的研究內容
GPR15在小鼠大腸Treg中表達量最高，並且受Ahr控制。GPR15是一種孤兒鳥嘌呤核苷酸結合蛋白（G蛋白）偶聯趨化劑受體（GPCR），最初是基於其與其它GPCR家族成員的相似性而被發現的，也被稱為HIV或猿猴免疫缺陷病毒共受體。最近有研究表明，GPR15對小鼠和人的調節性T細胞（Treg）和效應T細胞（Teff）的腸道歸巢至關重要。芳香烴受體（Ahr）是一種環境感測器，可檢測外源性配體，如環境毒素（如二惡英），以及宿主細胞、微生物群和飲食（如色氨酸代謝物）產生的內源性配體。通過流式細胞術檢測GPR15蛋白在各種T細胞中的表達水平，發現Treg中GPR15的表達水平最高。在Ahr缺陷小鼠的CD4+ T細胞中，GPR15的表達水平降低。而在在Ahr過量表達小鼠的CD4+ T細胞中，GPR15的表達水平升高。
Ahr通過直接與Gpr15基因座結合調節GPR15表達。利用ChIP-seq在iTreg 和TH17細胞中發現Gpr15基因是Ahr最重要的全基因組靶點之一。Ahr在Gpr15基因座具有兩個實質性的結合峰（在距轉錄起始點+15和+17 kb處）。
Foxp3與Ahr協同作用，正調節GPR15的表達。在CD4+ T 細胞中用shRNA干擾Foxp3，GPR15的表達水平降低。在來自Ahr+/+小鼠的iTregs細胞中強製表達Foxp3可顯著提高其GPR15的表達，在來自Ahr-/-（Ahr缺陷）小鼠的iTregs細胞中卻沒有這種效果。在TH0條件下培養的分選CD4+T細胞中同時表達Ahr和WT Foxp3或Foxp3△FKH可以增加GPR15的表達，而Foxp3單獨表達並不影響GPR15的表達。ChIP-qPCR表明Foxp3在Gpr15基因座的結合位點與Ahr相同（距轉錄起始點+15和+17 kb處）。Ahr缺陷不影響Foxp3在Gpr15位點的結合，但是在iTreg中敲低Foxp3後，Ahr向Gpr15基因座的招募減少。
RORγt負向調節GPR15表達。在RORγt缺陷Treg中，GPR15的表達增加。RORγt和GPR15表達的負相關系在Ahr充足和Ahr缺陷Treg中都很明顯。此外，與來自RORγt充足的CD4+ T細胞分化的iTregs和TH17細胞相比，來自RORγt缺陷的CD4+ T細胞具有更高的GPR15表達。
RORγt拮抗Ahr在Gpr15基因座的DNA結合。在從RORγt缺陷小鼠分化的iTregs或TH17細胞中，Gpr15基因座的Ahr募集顯著增強，而在沒有Ahr的情況下，Gpr15基因座的RORγt結合顯著增加，提示Ahr和RORγt與Gpr15基因座結合存在競爭。此外在RORγt缺陷iTregs中表達RORγt抑制GPR15表達。
Ahr通過調節GPR15促進Tregs向腸道歸巢。在大腸（LI）和小腸（SI）中，歸巢的Ahr缺陷iTreg相對於WT對照組減少了大約三倍。GPR15的強製表達顯著增強了Ahr缺陷Treg向LI的歸巢，但不增強到包括SI在內的其他器官的歸巢，這與GPR15在Treg大腸歸巢中的關鍵作用一致。此外， 在LI中WT-iTreg和GPR15恢復表達的Ahr缺陷iTreg的歸巢能力相當（而不是在SI中），這表明GPR15在Ahr缺陷iTregs中的表達受損是其向LI歸巢缺陷主要機制。在Ahr缺陷的iTregs中強製表達GPR15促進其在炎症期間歸巢至LI。此外，強製表達GPR15的Ahr缺陷iTreg的過繼性轉移顯著抑制了腸道炎症，表現為減輕了腸道組織學變化和降低了促炎細胞因子（即Tnf和Il1b）的表達。
Ahr信號促進GPR15在人Treg中表達。與之前的報告顯示GPR15在人類Treg中的低表達不同，本研究檢測到GPR15在所有患者樣本中的表達。與外周血單個核細胞（PBMCs）相比，結腸Treg的 GPR15表達顯著增高。人Treg中Ahr mRNA表達的增加與Gpr15表達的增加以及其他Ahr靶基因（Cyp1a1和Ahrr）的表達增加有關，這與Ahr促進Gpr15表達的作用相一致。此外，通過蛋白質染色分析GPR15和Foxp3的表達，發現Foxp3的表達與人CD127-CD25+ T細胞中GPR15的表達呈正相關。加入Ahr的配體FICZ顯著增強了iTreg中GPR15和其他Ahr靶基因的表達，但不增強Ahr的表達，而用一種特異性Ahr拮抗劑CH223191治療可消除人iTregs中GPR15的表達。
03 轉錄因子研究的技術手段
❶ 雙熒光素酶實驗
某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現非共價結合，從而對基因的表達起增強或抑制的作用。雙螢光素酶報告實驗（al luciferase assay）是檢測轉錄因子和靶啟動子中的特異順序結合的重要手段，通過檢測轉錄因子表達水平的改變對熒光素酶基因表達水平的影響，分析轉錄因子能否作用於啟動子。
其原理簡述如下 ：
（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到螢光素酶編碼序列上游的報告基因質粒，如pGL3-basic等。
（2） 將要檢測的轉錄因子的表達質粒、干擾質粒或者siRNA與報告基因質粒共轉染293細胞或其它相關的細胞系。通常會用另一種螢光素酶作為內參，避免轉染效率對實驗結果的影響。
（3） 加入特定的螢光素酶底物，螢光素酶與底物反應，發光，通過檢測發光強度可以測定螢光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與靶啟動子片段有作用。
❷ 染色質免疫共沉澱
染色質免疫沉澱技術 (chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)被廣泛用於研究體內轉錄因子與靶基因啟動子上特異性核苷酸序列的結合，並已成為研究染色質水平基因表達調控的最有效的方法。ChIP的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白-DNA復合物，並將其隨機切斷為一定長度的染色質小片段，然後通過免疫學方法沉澱此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的 DNA 片段。通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。通過qPCR或二代測序，篩選與目的蛋白互作的DNA信息。ChIP-PCR用於鑒定轉錄因子結合到靶基因的啟動子上，而ChIP-seq用於篩選轉錄因子直接結合的靶基因，探究轉錄因子的作用元件。
❸ 電泳遷移率改變試驗
電泳遷移率改變試驗 (electrophoretic mobility shift assay，EMSA ) 也稱凝膠阻滯試驗，DNA 在凝膠中的遷移率與相對分子質量及構型有關。裸露DNA與含有結合蛋白的DNA- 蛋白質復合物電泳時，裸露 DNA 遷移率主要取決於DNA本身，DNA-蛋白質復合物由於體積較大而滯留在較後位置。電泳遷移率改變試驗用於體外分析轉錄因子與靶基因啟動子的結合。將一系列序列不同的DNA片段與轉錄因子進行電泳遷移率改變試驗，可以探究轉錄因子的體外結合序列。
㈤ 轉錄因子研究的思路
轉錄因子是起正調控作用的反式作用因子，是一類蛋白分子，
它能通過與基因上游5』 端特定序列專一性結合的方式來使目的基因順利表達。在轉錄起始過程中，可調控RNA 聚合酶與DNA模板的結合。 轉錄因子除了能與基因上游的啟動子區域結合外，也可以轉錄因子復合物的形式和其它轉錄因子結合來調控基因的轉錄。
無論是TF還是TFBS的同類預測，生物信息的研究手段主要依賴於蛋白質或者DNA的序列保守性進行。具體演算法和軟體有隱馬爾可夫模型,Gibbs抽樣,貪婪演算法等，但這次重點在於介紹研究轉錄因子的實驗方法，因此不過於敘述這部分信息。
實驗方法主要有兩種思路：1. 通過已知TF尋找未知TFBS；2.通過已知TFBS尋找未知TF。無論哪種手段，前提都是基於蛋白與DNA之間的結合關系尋找，即交叉尋找目標，這有別於計算機技術的同類型尋找。
https://www.omicshare.com/forum/forum.php?mod=viewthread&tid=756&fromuid=50125
㈥ 轉錄組測序流程步驟是哪些
以真核轉錄組測序為例，實驗流程為總RNA提取-mRNA分離-建庫試劑-定量-文庫回收-橋式擴增-上機測序；項目分析流程為數據產出數據=數據去雜-轉錄組拼接-SSR分析及SNP分析-基因功能注釋-基因表達差異分析-差異基因表達模式聚類-差異基因富集分析。
㈦ 轉錄組測序研究怎麼做
首先需要做的是將測出來的readsmapping到基因組上，與此同時可以得到數據mapping比例等信息，依靠這些信息可以進行數據質量的分析，然後還可以統計每個基因的表達情況，如果是比較不同樣本之間的轉錄組，則可以進行差異表達基因的分析
㈧ 2篇文章帶你Get腫瘤空間轉錄組研究思路
10x Visium空間轉錄組技術繼問世以來便受到了科研人員的青睞，已廣泛應用於發育生物學、神經生物學、腫瘤生物學等領域的研究。尤其在腫瘤研究領域可以深入揭示腫瘤異質性、腫瘤微環境、腫瘤發生發展、腫瘤浸潤細胞等。但目前大多數利用10x Visium空間轉錄組技術的研究均由國外科學家完成。2021年4月，四川大學華西醫院的研究人員利用10x Visium空間轉錄組技術解析了非小細胞肺癌的空間軌跡。2021年5月，上海東方肝膽外科醫院的研究人員再次利用該技術揭示原發性肝癌的空間轉錄異質性。下面我們一起來了解下這兩篇文章的研究思路吧！
一、文章一 ：空間轉錄組測序揭示非小細胞肺癌的空間軌跡
1、研究背景
肺癌已成為全球癌症死亡的主要原因，占惡性腫瘤的22.7%。非小細胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的80%以上，肺腺癌（LUAD）和肺鱗癌（LUSC）是兩種主要的組織學亞型。獲取細胞空間位置，了解腫瘤微環境和腫瘤轉移機制對治療非小細胞肺癌具有重要意義。
2、研究方法
對從12個個體收集的4張LUAD和 8張LUSC切片進行10x Visium空間轉錄組測序。
3、研究思路
4、研究結果
（1）LUSC表現出更強的侵襲能力
對所有樣本的整合聚類分析揭示了10個不同的亞群，但LUAD和LUSC之間的聚類差異很大。LAUD和LUSC之間的顯著差異表明它們可能具有不同的空間轉錄表達模式。 SLPI 、 SCGB3A1 、 SCGB3A2 、 MS4A15 和 NR4A1 等與癌症惡性相關的基因在LUAD_1中高表達，而 SPP1 、 GSTA1 、 MAL2 和 MGST1 等與腫瘤轉移和腫瘤細胞增殖相關的基因在LUSC中高表達。此外，LUSC的空間微環境顯著富集與上皮-間質轉化相關的途徑。這些結果表明LUSC表現出更強的侵襲能力，可直接向周圍和淋巴結轉移，遠處轉移較少，具有豐富的免疫微環境和細胞通訊。
（2）沿空間軌跡的瞬時基因表達模式
沿腫瘤的侵襲軌跡， DSG2 和 SPRR3 等促進腫瘤增殖相關的基因調節細胞增殖，在非小細胞肺癌中侵襲和細胞凋亡過程中減少，而腫瘤進展相關基因 BGN 和轉移生長相關基因 POSTN 的功能逐漸增強。此外，能量代謝過程途徑沿軌跡減少，而細胞外基質組織、免疫反應、抗原處理和呈遞在腫瘤基質中增強。
（3）腫瘤亞克隆空間表達異質性
將腫瘤細胞重新聚類為4個亞群。腫瘤亞群之間的差異富集通路差異明顯。所有亞群都是惡性細胞，且含有不同程度的拷貝數變異。上皮間質轉化（EMT）評分高的亞型在患者間相似，這些亞克隆不同於與侵襲和轉移相關的上皮間質轉化水平。此外，腫瘤亞克隆的免疫細胞組成和腫瘤比例有顯著差異，而且腫瘤純度與腫瘤EMT的趨勢相反。
（4）腫瘤內空間軌跡推斷
stlearn偽時間軌跡分析表明腫瘤細胞的空間軌跡方向總是從簇1開始，指向其他子群，呈發散狀態。這可以解釋為亞克隆之間的進化軌跡是從具有低轉移侵襲性的亞克隆開始，並逐漸進化為具有強侵襲和轉移能力的亞克隆。LUSC_1具有兩個分支，主要分支具有多個亞分支，是腫瘤主要的演化軌跡。LUSC_3也具有類似的結果，反映了LUSC亞克隆進化固有的分支進化。
二、文章二：原發性肝癌空間轉錄組分析
1、研究背景
原發性肝癌（PLC）是死亡率第二高的腫瘤，其中肝細胞癌（HCC）和肝內膽管癌（ICC）是兩種主要的組織學亞型。PLC由於其高度的腫瘤內異質性，有效非手術治療策略較少，因此准確地評估空間異質性對於了解腫瘤細胞亞群是必不可少的。
2、研究方法
收集了7名患者的21份組織標本，包括5例肝細胞癌（HCC-1、2、3、4、5）、1例肝細胞和膽管細胞癌混合型（cHC-1）和1例肝內膽管細胞癌（ICC-1）。對於HCC-1/2/3/4和cHC-1，進行三個連續切片（N：非腫瘤；L：前緣；T：腫瘤）；對於ICC-1，僅收集了L切片；對於HCC-2，還收集了門靜脈癌栓的切片（P）。利用10x Genomics Visium平台對這些切片進行空間轉錄組測序。
3、研究思路
4、研究結果
（1）PLC空間異質性的不同模式
聚類分析表明HCC-1T、HCC-3T和HCC-4T的簇具有區域分布特徵，而HCC-2T和cHC-1T的簇是相互交織的。HCC-3L的簇5是一個獨特的簇。分層聚類分析發現來自相同類型區域的簇在總體上更相似，擴散圖分析表明正常和腫瘤區域簇位於分支中，基質區域簇位於連接處。間質區域富含成纖維細胞和內皮細胞，而不同腫瘤區域的免疫細胞表現出高度的多樣性。變異曲線分析發現T細胞、B細胞、內皮細胞和成纖維細胞的變異模式高度相似，而NK細胞和髓細胞高度變異。
（2）腫瘤邊緣微環境特徵
HCC-1、HCC-3和HCC-4的L&T切片的腫瘤區域具有更高的空間連續性和更低的轉錄組多樣性。包膜完整的腫瘤組織具有較高的空間連續性和較低的轉錄組多樣性，其完整性與腫瘤細胞的空間異質性及其周圍間質和免疫細胞的分布密切相關。基因組變異分析發現，包膜完整性對正常和腫瘤區域的標志通路活性影響不大。
（3）PLC的瘤內異質性
腫瘤區域spots的標志通路活性的分級聚類識別出兩個模塊，分別顯示細胞周期、代謝相關途徑的高活性和炎症、血管生成、上皮間質轉化途徑的高活性。HCC-1的腫瘤簇屬於兩個不同的模塊，簇2（T.2）為模塊2，簇5和6（T.5&6）為模塊1。從空間轉錄組數據推斷出的CNV大多與WES數據一致，這表明從ST數據推斷出的CNV是可靠的。而且空間轉錄組數據在不同腫瘤簇之間產生了更微妙的CNV異質性。這些結果表明腫瘤內存在廣泛的空間異質性，某些腫瘤的不同亞群具有不同的通路活性和不同的細胞起源，不同亞群的細胞通訊可能對腫瘤的生態和進化至關重要。
三、總結
空間轉錄組技術可以解析腫瘤異質性，腫瘤免疫微環境及腫瘤轉移機制。未來空間轉錄組技術將在篩選腫瘤葯物靶點，提高臨床診斷准確率及發掘新的治療手段方面提供新的思路和見解。
參考文獻：
1. Li Zhang et al. Spatial transcriptome sequencing revealed spatial trajectory in the Non-Small Cell Lung Carcinoma. bioRxiv, 2021.
2. Rui Wu et al. Comprehensive Analysis of Spatial Architecture in Primary Liver Cancer. bioRxiv, 2021.
㈨ 轉錄組數據分析RNA-seq
轉錄組學（transcriptomics）的研究對象是全基因組尺度下所有轉錄本（transcript），即轉錄組（transcriptome）
將熒游標記的cDNA製成微陣列探針來測定樣本中特定轉錄本含量。又稱為 基因晶元（Gene Chip）、微陣列（Microarry）。
獲取表達量的步驟：
提取RNA -> 反轉錄 （->擴增）->標記->雜交->掃描->獲得原始數據
局限性：
• 只能檢測已知或；確定性的序列
• 無法檢測新發現的，未放置到晶元上的基因
• 有部分探針的信號可能會收到非特異性雜交或個體序列差異的影響
基於高通量二代測序技術的轉錄組學研究方法。
特點：
高通量、低成本；不依賴已知轉錄本探針，可以測全轉錄組；對於低表達豐度的轉錄本靈敏
度高；以reads數量腐酸表達，比晶元的熒光信號更為精確。
應用和最新進展
依據文庫要求檢查完整性分值，如果不合格將不適合建庫測序。一些特殊文庫對RNA提取要求很高，如全長轉錄組文庫，需要特殊提取流
程保證RNA 完整性。
需要的數據：參考基因組數據fasta、GFF注釋信息、雙端測序的fastq文件
我這里用的是普通栽培稻( Oryza sativa L.)的參考基因組和、GFF文件和SRR17439319數據。
參考步驟： https://blog.csdn.net/sunchengquan/article/details/79781366
注意：配置時，需要在bin目錄下執行 ./vdb-config --interactive ，然後彈出一大堆亂七八糟的之後，按X退出即可。再執行./fastq-mp，若沒有報錯，而是幫助信息的話即可以使用。
測序數據分析前需要經過數據預處理，並檢查數據GC含量、序列重復成俗、是否存在接頭等。
在質控後，再質檢一次，對比看看有什麼不同。
將 reads 匹配到參考基因組或轉錄組的相應位置上
• 非剪接比對：轉錄組
Bowtie、BWA
• 剪接比對：參考基因組
STAR、HISAT、Topha
對鑒定SNP做了優化： GSNAP、MapSplice等
① 建立基因組索引
②利用注釋文件比對
沒有注釋文件的比對方法
③ SAM 文件處理
使用 samtools 對 SAM 文件排序並轉化為 BAM 文件。samtools是一個用於操作sam和bam文件的工具合集，包含有許多命令。
④比對結果可視化
比對結果使用 IGV 、Genome Maps 和Sacant 等可視化查看。
例如：IGV 通過讀入基因組和注釋信息以及BAM 文件展示比對結果。
需要額外添加 BMA 的索引: samtools index test_sorted.bam test_sorted.
⑤比對結果評估
比對結果評估工具：RSeQC、Qualimap
計算FPKM
-p 線程數
-G 參考基因組注釋
-e 只估計已給參考基因組注釋的基因豐度
-A 基因豐度估計輸出文件
-o 輸出文件