利用hplc進行定量分析的方法

㈠ 高效液相色譜法測定中葯含量採用的方法有哪些

遵照下面的要求選擇合適的方法,HPLC法外標、內標兩種,檢測器一般UV即可.
含量測定分析方法驗證的可接受標准簡介
摘要：本文介紹了在對含量測定所用的分析方法進行方法學驗證時,各項指標的可接受標准,以利於判斷該分析方法的可行性.
關鍵詞：含量測定 分析方法驗證 可接收標准
在進行質量研究的過程中,一項重要的工作就是要對質量標准中所涉及到的分析方法進行方法學驗證,以保證所用的分析方法確實能夠用於在研葯品的質量控制.為規范對各種分析方法的驗證要求,我國已於2005年頒布了分析方法驗證的指導原則.該指導原則對需要驗證的分析方法及驗證的具體指標做了比較詳細的闡述.但是文中未涉及各具體指標在驗證時的可接受標准,國際上已頒布的指導原則中也未發現相關的要求.另一方面,大多數葯品研發單位在進行質量研究時,已逐步認識到分析方法驗證的必要性與重要性,大都也在按照指導原則的要求進行分析方法驗證,但驗證完後卻因沒有一個明確的可接受標准,而難以判斷該分析方法是否符合要求.本文結合國外一些大型葯品研發企業在此方面的要求,提出了在對含量測定方法進行驗證時的可接受標准,供國內的葯品研發單位在進行研究時參考.
1．准確度
該指標主要是通過回收率來反映.驗證時一般要求分別配製濃度為80％、100％和120％的供試品溶液各三份,分別測定其含量,將實測值與理論值比較,計算回收率.
可接受的標准為：各濃度下的平均回收率均應在98.0%-102.0%之間,9個回收率數據的相對標准差（RSD）應不大於2.0%.
2．線性
線性一般通過線性回歸方程的形式來表示.具體的驗證方法為：
在80％至120％的濃度范圍內配製6份濃度不同的供試液,分別測定其主峰的面積,計算相應的含量.以含量為橫坐標（X）,峰面積為縱坐標（Y）,進行線性回歸分析.
可接受的標准為：回歸線的相關系數（R）不得小於0.998,Y軸截距應在100％響應值的2％以內,響應因子的相對標准差應不大於2.0%.
3．精密度
1）重復性
配製6份相同濃度的供試品溶液,由一個分析人員在盡可能相同的條件下進行測試,所得6份供試液含量的相對標准差應不大於2.0%.
2）中間精密度
配製6份相同濃度的供試品溶液,分別由兩個分析人員使用不同的儀器與試劑進行測試,所得12個含量數據的相對標准差應不大於2.0%.
4．專屬性
可接受的標准為：空白對照應無干擾,主成分與各有關物質應能完全分離,分離度不得小於2.0.以二極體陣列檢測器進行純度分析時,主峰的純度因子應大於980.
5．檢測限
主峰與噪音峰信號的強度比應不得小於3.
6．定量限
主峰與噪音峰信號的強度比應不得小於10.另外,配製6份最低定量限濃度的溶液,所測6份溶液主峰的保留時間的相對標准差應不大於2.0%.
7．耐用性
分別考察流動相比例變化±5％、流動相pH值變化±0.2、柱溫變化±5℃、流速相對值變化±20％時,儀器色譜行為的變化,每個條件下各測試兩次.可接受的標准為：主峰的拖尾因子不得大於2.0,主峰與雜質峰必須達到基線分離；各條件下的含量數據（n=6）的相對標准差應不大於2.0%.
8、系統適應性
配製6份相同濃度的供試品溶液進行分析,主峰峰面積的相對標准差應不大於2.0%,主峰保留時間的相對標准差應不大於1.0%.另外,主峰的拖尾因子不得大於2.0,主峰與雜質峰必須達到基線分離,主峰的理論塔板數應符合質量標準的規定.
望採納，謝謝

㈡ 如何建立HPLC法測定有關物質的方法.ppt

摘要 本文就如何建立TLC法測定有關物質的方法進行論述，系統地闡述了薄層色譜法各條件確定的原理，並列舉了質量標准制訂中存在的某些問題。
關鍵詞 薄層色譜法（TLC法） 有關物質 方法建立
有關物質是研究品中除主成分以外的雜質，它可能是原料合成過程中帶入的原料、中間體、試劑、降解物、副產物、聚合體、異構體以及不同晶型、旋光異構的物質，也可能是制劑過程中產生的降解物，或是在貯藏、運輸、使用過程中產生的降解物等[1]。這些雜質的存在直接反映品的有效性和安全性，故要對其進行研究，特別是在品申報的質量研究資料中需建立其檢測方法，並根據生產、穩定性考核等實際情況考慮是否在質量標准中制訂該檢查項，規定其限度。目前，有關物質的常用測定方法有高效液相色譜法(HPLC法)和薄層色譜法(TLC法)。
TLC的特點是快速、簡便，尤其是對無紫外吸收的雜質測定，更具有其應用價值。如能將TLC法與HPLC法有機地結合、或彼此間進行比對研究，便可得到更多、更為准確的有關雜質信息，做到兩方法間的相輔相成，相益得彰！本文將著重討論如何建立薄層色譜法測定有關物質的方法。
1．測定方法類型
常用的方法有雜質對照品法（適用於已知雜質）和自身（稀釋）對照法（適用於一般雜質檢查，雜質成分少且尚不能取得雜質對照品）。目前國內由於難以獲得雜質對照品、故一般均採用自身對照法。
2．展開劑的確定（即專屬性試驗）
專屬性的研究是提供被分析物在雜質和輔料存在時能被區分的證明，該點是色譜條件建立的關鍵。通常採用在被分析物的對照品或精製品中加入一定量的雜質或輔料，證明色譜條件可將各雜質與被分析物分離[1]。這里的關鍵是：將多少量的雜質加入到多少量的主成分中。正確的作法是將1%(w/w)濃度量的各雜質加入到100%濃度的主成分中，配製這樣的溶液來
驗證系統適用性。之所以如此配製，目的是模仿樣品中有可能存在的狀態，即有少量（1%左右）雜質存在時是否能與主成分達到完全分離，只有這樣才能比較客觀、科學地反映樣品中實際存在情況的（見圖1）；而不應把該溶液配製成：主成分與中間體相同濃度的。因為一者實際檢測時樣品中不可能存在此種情況；二者該濃度不易確定，目前國內申報資料中一般的作法均是配製成較低的一致濃度，這樣各斑點當然易於完全分離了（見圖2），但在實際測定時，由於主斑點急劇增大，很易將相鄰雜質包含於主成分斑點中。同樣，質量標准中的系統適用性試驗用溶液的配製方法亦如此。

（1，3，4為雜質，2為主成分）
圖1 圖2 （雜質濃度均為供試品溶液濃度的1%）
3．檢出條件的確定
其基本出發點是：主成分與相關雜質均應在該條件下顯色，且在相同濃度下，斑點大小應基本一致。薄層板的類型根據被測物質的性質來選用，測定有紫外吸收的物質通常選用GF254或GF365板；測定無紫外吸收、需噴顯色劑的，常選用硅膠G板或H板，選用該類薄層板時，顯色方法根據被測物質的結構式選取，但當有多個顯色方法時，應分別進行試驗，選取靈敏度最高的顯色方法。如醋酸氫化可的松有關物質的測定，中國典2000年版採用鹼性四氮唑藍試液顯色，美國典26版採用硫酸-乙醇(10:90)溶液顯色，兩者均為激素類物的顯色方法。醋酸氫化可的松屬於激素類中的腎上腺皮質激素，四氮唑法是腎上腺皮質激素的重要顯色方法；而硫酸-乙醇顯色法則主要是針對激素類中的的顯色反應，對於屬於腎上腺皮質激素類的醋酸氫化可的松則反應活性不強，結果兩法的靈敏度相差10倍以上。因此，檢出條件的確定，一定要在查閱文獻的基礎上，並根據試驗結果進行綜合考慮。
4．供試品溶液濃度的確定（靈敏度試驗——最低檢出限的測定）
供試品溶液濃度的設定在有關物質檢測中是至關重要的，濃度越高、越能反映樣品中雜質存在的情況，但若設定得過高，則會產生主斑點嚴重拖尾、「斷腰」等超載現象的發生，產生錯誤結論；若設定太低，又將達不到檢測雜質的目的，觀測不到雜質量的變化。其設定是根據最低點樣量和最大點樣量來綜合考慮的。
最低檢出限雖然是個絕對值，但真正的意義卻是其相對值，即相對於供試品溶液的濃度多少而言，所以測定結果不僅要羅列出其絕對值又應列出其相對值，這樣最低檢出限才有意義！最大點樣量則是通過不斷加大供試品溶液濃度，直至主斑點嚴重拖尾、「斷腰」等情況出現時來得到的。然後根據最低檢出限，採用「上推法」來確定：如一般設定雜質斑點小於1.0%對照斑點，對照溶液的濃度至少應為最低檢出濃度（即最低檢出限）的20~50倍，則供試品溶液濃度是最低檢出濃度的2000~5000倍；反過來，最低檢出濃度應至少達到供試品溶液濃度的0.02%~0.05%。應注意的是：由於最低檢出量和最大點樣量因試驗環境、薄層板質量以及即時試驗時其他各因素的不同而改變（即耐受性因數），故供試品溶液的濃度在保證小於最大進樣量的情況下，可在此基礎上設定得再高一些，以保證該濃度可適用於各種條件下。舉例說明見表1（規定雜質限度為1.0%）。

表1 最低檢出量、最大點樣量、供試品溶液和對照溶液濃度之間的比例關系

最大點樣量
供試品溶液
對照溶液
最低檢出量 濃 度 8mg/ml 3mg/ml 30μg/ml 1μg/ml 點樣量 10μl 10μl 10μl 10μl 絕對量 30μg 0.3μg 10ng 相對於樣品測定濃度的 100% 1.0% 0.02% 倍 數 關 系 5000倍 30倍 「基準點」
供試品溶液濃度也可設定得再高些，但不可超過最大點樣量。
5．加樣回收試驗（即准確性試驗）
准確性試驗可採用在預經有關物質測定後的樣品中，加入已知量雜質的方法來評價。准確稱取各雜質，將含有1%(w/w)濃度的各雜質加入到樣品溶液中，以驗證所採用的薄層測定條件是否可分離檢測出相應的各雜質以及樣品中已存在的雜質是否累加，斑點是否加深。該原理同前面所述的專屬性研究是一致的。
6．強力破壞試驗
該項研究是為了揭示原料內在穩定性的特性，它是開發研究的一部分。這些試驗是在比加速試驗更劇烈的條件下進行的，其能夠包含品在銷售過程中所遇到的劇烈條件。可取一批樣品通過強光、高溫、高濕、氧化破壞、以及酸鹼破壞來證明該展開條件能分離檢測出雜質。
7．展開距離
測定時一定要採用25cm、長薄層板，展開距離應盡可能長一些，以使雜質與主成分盡量分離。如用短板，易造成臨近主斑點的雜質斑點「躲進」主斑點中。但同時又應注意，距離拉大，斑點分散，會損失最低檢出限，降低靈敏度，故應綜合考慮。
8．其它的因素
展開溫度應盡量控制在20~25℃之間，尤其在冬季，應注意環境的溫度，如太低，將嚴重影響展開效果。另層析缸的蓋兒，應塗抹凡士林油，以保證整個試驗過程中，層析缸的密封，避免展開劑揮發；並應在展開前，預先傾入展開劑，以使層析缸內的空氣飽和，達到最佳的展開效果。薄層板由於有自製、市售，質量不一也應注意。
二．討論
1． 質量標准中的系統適用性試驗，最好能將最難分離的雜質訂入系統適用性試驗用溶液的配製，將此雜質的濃度配製為主成分濃度的1%，或0.5%，或0.2%（依據雜質限度而定）進行試驗，驗證分離度後，再進行樣品的測定，以確保試驗的准確進行。
2． 質量標准中，應配製系列濃度的對照溶液（即梯度對照），以對雜質有「半定量」的概念，這可更好地評價雜質存在的情況；並應規定雜質的個數及最大雜質斑點的限度，使質量標准更完善、科學。經查閱，中國典薄層色譜法測定有關物質的有70個品種，僅有2個品種採用了梯度對照，絕大部分品種僅是制定了對照溶液，均未規定雜質個數，和最大雜質斑點限度，如有若干個雜質斑點也無法判定；而英國典和美國典則幾乎每個品種均採用梯度對照，並規定雜質個數和最大雜質斑點限度，這一點值得學習和推廣。
3． 錯誤的一種誤區，認為HPLC法完全替代了TLC法，這是不正確的，一定要做到相互補充、相互論證、相互參考才是最客觀、最科學的！
本文是在參閱了日本《分析方法驗證》一書和大量日本國內新申報資料中質量研究部
分的內容所寫而成。

㈢ 高效液相色譜有幾種定量方法其中那種是比較精確的定量方法並簡述

峰面積法、峰高法、歸一法、外標法。峰面積法是比較精確的定量方法

㈣ HPLC法中定量分析方法大致有哪幾種

氣相色譜定量檢測一般就兩種，一個是外標法，一個是標法，對於沒有標准物質的，就只能靠容面積歸一法粗略定量。

通過對人類和環境有影響的各種物質的含量、排放量的檢測，跟蹤環境質量的變化，確定環境質量水平，為環境管理、污染治理等工作提供基礎和保證。簡單地說，了解環境水平，進行環境監測，是開展一切環境工作的前提。

(4)利用hplc進行定量分析的方法擴展閱讀：

HPLC根據固定相和流動相的成分分為正相色譜和反向色譜。

正相色譜法

採用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。

㈤ 色譜分析的定性和定量方法有哪些

氣相色譜分析嚴格來講是一種定量分析方法，如果不配置質譜儀等專用定性的儀器聯勝，其本身並不能真正定性，因為氣相色譜、液相色譜等色譜法本身的原理只是通過色譜柱將待測物質組份進行分離後再通過檢測器進行檢測，而且常用的FID,TCD,ECD,FPD等檢測器本身並不能定性，只能進行相對定量檢測計算；
之所以說氣相色譜可以定性，那是是一種對照判斷式定性，就是將通過在相同的色譜分析條件下在相同時間段內出現的峰認定為同一種物質。這種認定一般對已經物質的定性是准確的，但對未知物質和同分異構體是無法分別的；
氣相色譜儀分析根據定量對照計算方法的不同分為：歸一法，校正歸一法，內標法，外標法等常用方法。
歸一法：就是將所有峰數據的總數歸一，根據各組份的峰面積在總面積中所佔比例計算各組份的百分比，由於事實上檢測器對不同的物質的響應因子並不相同，導致峰面積比在事實上並不能代表真實組份含量比，因此這是一種粗略的相對測控法，並不準確。常被用於工廠對已知組份生產過程的控制粗測，此時並不需要准確知道具體含量值，只需要知道比例范圍是否發生變化。

㈥ HPLC分類及其原理

HPLC分類有很多種，可以根據不同的依據進行分類。

1. 根據流動相和固定相的極性不同，HPLC可以分為正相色譜和反相色譜。

正相高效液相色譜： 色譜柱中的固定相是由硅膠、氧化鋁等極性化合物組成。當色譜運行時，由於樣品中的極性化合物對固定相有較強的親和力，使它們在色譜柱中的保留時間比非極性化合物長，因此非極性化合物最先被洗脫出來。許多物質都可以用正相色譜法分析，但由於葯物、食物和其他生物製品大都是非極性的，所以在日常生活中應用不如反向色譜法廣泛。

反相高效液相色譜 ：固定相由非極性化合物組成，如十八烷基硅烷、C18、C8等有機化合物。流動相是極性的。因此，極性高的化合物最先被洗脫，低極性或無極性的化合物最後洗脫。

HPLC大都是對葯物、食品、生化分子等物質進行分析，而它們在自然界中都是極性物質（水溶性）。因此，反相高效液相色譜應用更為廣泛。

2. 根據分離原理的不同，HPLC可分為以下六種。

親和色譜： 主要利用樣品與固定性之間的親和性，實現分離。

離子交換色譜： 基於固定相與流動相的帶電基團發生可逆交換，達到分離目的。離子交換樹脂用於分離含有帶電離子的樣品。對於陰離子，使用陰離子交換樹脂；對於陽離子，使用陽離子交換樹脂。主要用於分離酸性和鹼性化合物。

離子對色譜： 在反相色譜的流動相或固定相中加入離子配對劑，與樣品中可電離的成分形成「對離子」。常用的離子配對劑有戊烷、己烷、庚烷或辛烷磺酸鹽等。

吸附色譜： 是利用吸附性不同的原理，根據樣品中的組分對固定相的親和力不同而發生分離。

空間排阻色譜： 按樣品中的組分的分子大小順序進行分離。色譜柱是由瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯醯胺等軟凝膠製成，也可用烷基葡聚糖、聚苯乙烯等半剛性凝膠。

手性色譜： 用於分離樣品中的光學活性異構體。固定相採用化學鍵合硅膠。常應用於醫葯、生物等領域。

3. 根據分析目的不同，HPLC可以分為分析型液相色譜和制備型液相色譜。

分析型液相色譜： 主要利用檢測器對混合物中各組分進行定性和定量分析。

制備型液相色譜： 主要是對混合物中各組分進行分離純化。制備型的色譜柱和進樣量都比分析型大。

4. 正如大家所知道的，混合物的分離是由於流動相流過HPLC色譜柱完成的，其中流動相可以是單一的溶劑，也可以是混合溶劑，因此HPLC可以分為等度洗脫和梯度洗脫兩種類型。

等度洗脫： 只有一種溶劑，所有的操作都是在一種溶劑下進行的。

梯度洗脫： 流動相由兩種或兩種以上的溶劑組成，並不斷改變其濃度配比。

迪信泰檢測平台以液相/氣相為依託，組建國際領先的HPLC、LC-MS、GC-MS等檢測平台，為廣大科研工作者提供高質量、快速、精準的一站式檢測服務，涉及生物、食品、葯物、化妝品、環境等多領域。

參考資料：Types Of HPLC | Their Principle And Application

㈦ 有哪些常用的色譜定量方法試比較它們的優缺點和使用范圍

色譜分析常用的定量方法：歸一化法、內標法和內加（增量）內標法、外標法。 1、面積歸一化法優點是簡便、准確，當操作條件變化時對結果影響較小，宜於分析多組分試樣中各組分的含量。但是試樣中所有組分必須全部出峰，因此，此法在使用中受到一定限制。 2、外標法是用純物質配成一系列不同濃度的標准溶液（或直接購買不同濃度標准溶液）分別取一定體積，注入色譜儀，根據峰面積和濃度做標准曲線。在分析未知樣時按與標准曲線相同的操作條件和方法，由標准曲線查出所需組分的濃度（現在在工作站上直接就能求出濃度）。此法要求進樣准確，操作條件穩定，分析樣品和標准曲線條件必須一致。 3、內標法是試樣中所有組分不能全部出峰或只要求測定試樣中某個或某幾個組分時，可採用此法。內標法是在准確稱取一定量的試樣中，加入一定的標准物質（內標物），根據內標物和試樣的質量以及色譜圖上的相應峰面積，計算待測組分的含量。內標法的關鍵是選擇合適的內標物，內標物應是試樣中不存在的純物質，物質與被測物質相近，能溶於樣品中，但不能於樣品發生反應。此法比較費事，一般不使用於快速分析。

㈧ 高效液相色譜有幾種定量方法，其中哪種是比較精確的定量方法

峰面積法、峰高法、歸一法、外標法。峰面積法是比較精確的定量方法

㈨ 採用hplc法和gc法測定的葯物主成分含量時定量分析測定的方法有哪些

原題:
[葯物分析]HPLC或GC法測定葯物含量時常用內標法定量，其校正因子(F)值的計算公式為
選項:
A.F=A標／A內×C標／C內
B.F=A標／A標×C內／C內
C.F=A內／A標×C標／C內
D.F=A內／A標×C內／C標
E.F=A內／A內×C標／C標
答案：
C

㈩ HPLC採用歸一化法定量有什麼優點

高效液相色譜使用歸一化法定量分析：
1.必須滿足兩個條件：
A、樣品中各組分均出峰，完全分離，且均有響應；B、進樣量無須准確，要清楚每個組分的校正因子。
2.此方法的優點：簡便、精確，進樣量的多少與測定結果無關，操作條件（如流速，柱溫）的變化對定量結果的影響較小。（但由於液相色譜所用檢測器為選擇性檢測器，對很多組分沒有響應，因此液相色譜法較少使用歸一化法。）